同时检测三种链球菌的三重实时荧光PCR方法及试剂盒

摘要

本发明提供一种同时检测三种链球菌的三重实时荧光PCR方法及试剂盒，试剂盒包括：无乳链球菌的检测引物对如序列表SeqIDNo.1和2所示及探针如序列表SeqIDNo.3所示，停乳链球菌的检测引物对如序列表SeqIDNo.4和5所示及探针SeqIDNo.6所示，海豚链球菌的检测引物对如序列表SeqIDNo.7和8及探针SeqIDNo.9所示、三种阳性对照品如序列表SeqIDNo.16、17和18所示，阴性对照品(ddH

说明书

技术领域

 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时检测三种链球菌的三重实时荧光PCR方法及试剂盒。

背景技术

链球菌属 ( Streptococcus ) 是一个具有庞大种群的属，该属已发现至少有60 多个菌种和亚种，在水生动物中致病性链球菌属病原菌种群种类并不多，从养殖鱼类上已经分离到的链球菌有海豚链球菌（S.iniae）、难辨链球菌( S. diffucilis )、无乳链球菌( S. agalactiae )、米氏链球菌( S. milleri )、副乳房链球菌( S.parauberis )、停乳链球菌( S. dysgalactiae )，但已报道的致病性链球菌主要是无乳链球菌、停乳链球菌和海豚链球菌，可引起多种海、淡水鱼类发病，在世界各主要鱼类养殖国家均有发生，对温带和热带、亚热带地区养殖鱼类危害尤为严重，已有6 大洲的23 个国家报道了鱼类链球菌病。目前，鱼类链球菌病已经成为一种呈世界性分布的疾病，每年给世界水产养殖业造成巨大的经济损失。

目前，针对无乳链球菌、停乳链球菌和海豚链球菌的检测通常采用常规增菌培养、生化鉴定及自动酶联荧光免疫检测方法相结合，存在工序繁琐、检测周期长、检测灵敏度不高、检出效率低、假阴性普遍等缺点。因此，发展操作简便、快速准确、灵敏度高且易推广的检测方法，对鱼类链球菌病进行早诊断和早预防，提高水产品质量和保障人类健康均具有重要意义。

实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction,Real Time PCR）从众多检测技术中脱颖而出，它不仅具有快速、简便、灵敏等优点，而且与常规PCR方法相比，由于引物和探针的“双保险”，因此特异性更强、自动化程度更高，并实现了实时在线检测，PCR扩增过程无需对PCR扩增产物进行后处理，有效地解决了PCR产物污染导致的假阳性及不能准确定量的问题，因而成为检测领域越来越重要的一种检测手段。但是，荧光定量PCR技术只能检测一个靶标。

多重荧光定量PCR技术是在荧光定量PCR基础上发展起来的一个新技术，它强调在同一个反应体系里同时扩增多个靶标。最近已有多项研究将多重定量PCR技术应用于细菌检测领域。Andrea G.等建立了大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和单细胞增生李斯特氏菌多重荧光PCR检测方法，Moniserrat E.等建立了鱼类和水产品中副溶血弧菌、霍乱弧菌等5种弧菌的多重PCR检测方法，结果显示多重PCR体系与单一扩增结果在灵敏度和特异性方面基本相同。但是到目前为止，尚无报道有同时检测无乳链球菌、停乳链球菌和海豚链球菌的试剂盒。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种能同时检测水生动物主要三种致病性链球菌无乳链球菌、停乳链球菌和海豚链球菌的多重定量Taqman PCR方法，同时基于该方法提供相应的试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术实现的：

1、一种利用实时荧光PCR方法同时检测三种链球菌的引物对及探针, 

无乳链球菌：

上引物cpsF- FP，如序列表Seq ID No.1所示，

下引物cpsF- RP，如序列表Seq ID No.2所示，

探针cpsF-PROBE，如序列表Seq ID No.3所示；

停乳链球菌：

上引物MIG- FP，如序列表Seq ID No.4所示，

下引物MIG- RP，如序列表Seq ID No.5所示，

探针MIG-PROBE，如序列表Seq ID No.6所示；

海豚链球菌：

上引物16SrRNA- FP，如序列表Seq ID No.7所示，

下引物16SrRNA-RP，如序列表Seq ID No.8所示，

探针16SrRNA-PROBE，如序列表Seq ID No.9所示；

cpsF-PROBE探针，MIG-PROBE探针和16SrRNA-PROBE探针的5’端标记的荧光素不同，分别为FAM、HEX 和ROX。

2、一种含有如上所述的一种利用实时荧光PCR方法同时检测三种链球菌的引物对及探针的试剂盒。

3、一种利用实时荧光PCR方法同时检测三种链球菌的阳性对照品PCR扩增引物对, 

无乳链球菌：

上引物SA-F，如序列表Seq ID No.10所示，

下引物SA-R，如序列表Seq ID No.11所示；

停乳链球菌：

上引物SD-F，如序列表Seq ID No.12所示，

下引物SD-R，如序列表Seq ID No.13所示；

海豚链球菌：

上引物SI-F，如序列表Seq ID No.14所示，

下引物SI-R，如序列表Seq ID No.15所示。

4、一种利用实时荧光PCR方法同时检测三种链球菌的阳性对照品，

    pMD-T-cpsF，如序列表Seq ID No.16所示；

pMD-T-MIG，如序列表Seq ID No.17所示；

pMD-T-16SrRNA，如序列表Seq ID No.18所示。

5、如上所述的一种利用实时荧光PCR方法同时检测三种链球菌的引物对及探针，检测链球菌的实时荧光PCR反应体系如下：

2×Quantitech Multiplex PCR NoRox Master Mix12. 5μL5μM cpsF- FP0.5μL5μM MIG- RP0.5μL5μM cpsF-PROBE1μL5μM MIG- FP0.5μL5μM MIG- RP0.5μL5μM MIG-PROBE1μL5μM 16SrRNA- FP0.5μL5μM 16SrRNA-RP0.5μL5μM 16SrRNA-PROBE1μLddH₂O3.5μLpMD-T-cpsF1μLpMD-T-MIG1μLpMD-T-16SrRNA1μL

扩增反应条件均为：

Step 1   95℃   15min；

Step 2   94℃   60s

Step 3   60℃   60s

Step 4   读数，Go  to  Step 2  for  40个循环。

6、如上所述的一种利用实时荧光PCR方法同时检测三种链球菌的阳性对照品的制备方法，包括以下步骤：

（1）PCR模板的制备：三种链球菌基因组DNA的提取和纯化，

（2）选择无乳链球菌cpsF基因作为靶基因， 步骤（2）中，三种靶基因的PCR反应体系均如下：

10×PCR Buffer2.5μLdNTP (2.5mM for each)2.0μL上游引物1.0μL下游引物 1.0μLTaqDNA>0.5μLDNA模板0.5μLddH₂O17.5μL

，PCR的反应条件均为：预变性95℃ 5min；94℃ 15s、57.6℃ 20s、72℃ 30s，35个循环；终延伸72℃ 10min；

设计阳性对照品的PCR扩增引物：

上引物SA-F，如序列表Seq ID No.10所示，

下引物SA-R，如序列表Seq ID No.11所示，并进行靶基因的PCR扩增；

选择停乳链球菌MIG基因作为靶基因，设计阳性对照品的PCR扩增引物：上引物SD-F，如序列表Seq ID No.12所示，

下引物SD-R，如序列表Seq ID No.13所示，并进行靶基因的PCR扩增；

选择海豚链球菌16SrRNA基因作为靶基因，设计阳性对照品的PCR扩增引物：

上引物SI-F，如序列表Seq ID No.14所示，

下引物SI-R，如序列表Seq ID No.15所示，并进行靶基因的PCR扩增；

（3）阳性对照品pMD-T-cpsF，pMD-T-MIG，pMD-T-16SrRNA的制备；

步骤（3）中，阳性对照品的制备过程，包括如下步骤：将步骤（2）中所得PCR产物与克隆载体pMD-19-T vector连接，转化大肠杆菌感受态JM109，获得阳性克隆菌株，并制备质粒pMD-T-cpsF、pMD-T-MIG和pMD-T-16SrRNA作为阳性对照品。

7、一种同时检测三种链球菌的三重实时荧光PCR方法的试剂盒，包括三对引物对及三条探针：

无乳链球菌

上引物cpsF- FP，如序列表Seq ID No.1所示，

下引物cpsF- RP，如序列表Seq ID No.2所示，

探针cpsF-PROBE，如序列表Seq ID No.3所示；

停乳链球菌

上引物MIG- FP，如序列表Seq ID No.4所示，

下引物MIG- RP，如序列表Seq ID No.5所示，

探针MIG-PROBE，如序列表Seq ID No.6所示；

海豚链球菌

上引物16SrRNA- FP，如序列表Seq ID No.7所示，

下引物16SrRNA-RP，如序列表Seq ID No.8所示，

探针16SrRNA-PROBE，如序列表Seq ID No.9所示；

三种阳性对照品：pMD-T-cpsF，如序列表Seq ID No.16所示，pMD-T-MIG，如序列表Seq ID No.17所示，pMD-T-16SrRNA，如序列表Seq ID No.18所示，阴性对照品(ddH₂O)和荧光实时定量PCR扩增所需的PCR缓冲液，dNTP， Taq DNA Polymerase。

本发明分别以空肠弯曲菌（ATCC 33560）、肠出血性大肠埃希菌O157:H7（ATCC 35150）、单核细胞增生李斯特菌（ATCC 19111）、伤寒沙门氏菌（CMCC 50115）、志贺菌（ATCC 12022）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（ATCC 9610）、霍乱弧菌（ATCC 51394）、创伤弧菌（ATCC 27562）、溶藻弧菌（ATCC 33787）、副溶血弧菌（ATCC 27519）、无乳链球菌 （ATCC 13813）、停乳链球菌（ATCC 35666）、海豚链球菌（ATCC29178）基因组DNA进行实验，以验证该方法检测的特异性。实验结果显示，本发明方法能够特异性的对无乳链球菌、停乳链球菌、海豚链球菌进行检测，引物与其他细菌无交叉反应，证明本发明方法具有高度的检测特异性。本发明的试剂盒还具有快速简单、精准的优点、具有良好的重复性、稳定性、可靠性和实用性。

附图说明

图1为无乳链球菌、停乳链球菌和海豚链球菌三重实时荧光PCR检测方法的建立。

图2为无乳链球菌、停乳链球菌和海豚链球菌三重实时荧光PCR检测无乳链球菌灵敏度实验结果。

图3为无乳链球菌、停乳链球菌和海豚链球菌三重实时荧光PCR检测停乳链球菌灵敏度实验结果。

图4为无乳链球菌、停乳链球菌和海豚链球菌三重实时荧光PCR检测海豚链球菌灵敏度实验结果。

图5为无乳链球菌、停乳链球菌和海豚链球菌三重实时荧光PCR检测方法检测无乳链球菌特异性实验结果。

图6为无乳链球菌、停乳链球菌和海豚链球菌三重实时荧光PCR检测方法检测停乳链球菌特异性实验结果。

图7为无乳链球菌、停乳链球菌和海豚链球菌三重实时荧光PCR检测方法检测海豚链球菌特异性实验结果。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明作进一步详细的描述。

实施例1

三种链球菌DNA模板的制备

参照TIANamp Bacteria DNA Kit 说明书进行三种链球菌[无乳链球菌 （ATCC 13813）、停乳链球菌（ATCC 35666）、海豚链球菌（ATCC29178），三种链球菌来源于美国典型菌种保藏中心(ATCC)]基因组DNA的提取和纯化，按顺序加入相应试剂：

（1）取1.5mL菌液，10000r/min 离心1min，弃上清，加入200μL缓冲液GA，彻底悬浮菌体；

（2）加入20μL蛋白酶K (20mg/mL)，并加入220μL 缓冲液GB，充分混匀，70℃水浴作用10min；

（3）加入220μL无水乙醇，充分混匀15s，简短离心后将所得溶液（包括絮状沉淀）转移至吸附柱CB3中，12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；

（4）向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；

（5）向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体； 

（6）重复上步操作；

（7）将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min离心2min，室温放置2-5min，晾干残留的漂洗液；

（8）将吸附柱CB3转入新的收集管中，在吸附膜中央加入100μL缓冲液TE，室温放置2-5min，12000r/min离心2min，收集DNA洗脱液。

实施例2 

阳性对照品的制备 

1、PCR引物的设计与合成

选择无乳链球菌cpsF基因作为靶基因、停乳链球菌MIG基因作为靶基因和海豚链球菌16SrRNA基因作为靶基因，并经过BLAST分析，设计合成引物对，如表1所示：

表1 三种链球菌的PCR引物对

2、利用如上所述三种链球菌的靶基因扩增引物SA-F/SA-R，SD-F/SD-R，SI-F/SI-R，采用PCR法分别扩增无乳链球菌cpsF基因、停乳链球菌MIG基因和海豚链球菌16S rRNA基因。三段基因PCR的反应体系均为：

10×PCR Buffer2.5μLdNTP (2.5mM for each)2.0μL上游引物1.0μL下游引物 1.0μLTaqDNA>0.5μLDNA模板0.5μLddH₂O17.5μL

PCR的反应条件为：预变性95℃ 5min；94℃ 15s、57.6℃ 20s、72℃ 30s，35个循环；终延伸72℃ 10min。

将上述PCR产物分别与pMD-19-T vector连接，转化感受态大肠杆菌JM109，获得重组菌，参照华舜小量质粒DNA提取试剂盒说明书分别制备重组质粒：

（1）挑取阳性克隆单菌落，接种于5mL含100μg/mL Ampr的LB培养基中，37℃培养过夜；

（2）取1-3mL过夜培养菌液，12000r/min离心5min，弃上清，加入250μL 的Buffer P1（含RNase）充分振荡菌体沉淀至其彻底悬浮；

（3）加入250μL 的Buffer P2，立即温和地上下颠倒离心管6-10次，混匀，室温静置2-4min；

（4）加入350μL 的Buffer P3，温和反复颠倒离心管6-10次，混匀，12000r/min离心10min；

（5）将上清液移入吸附柱中，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；

（6）加入500μL B1液，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；

（7）加入500μL W1液（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；

（8）加入500μL W1液（含无水乙醇），室温静置1min，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中，12000r/min空载离心1min；

（9）将吸附柱转移至一个洁净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入150μL去离子水，室温静置2min，12000r/min离心1min，洗脱收集质粒DNA。

将鉴定正确的重组质粒分别命名为pMD-T-cpsF，pMD-T-MIG，pMD-T-16SrRNA。

将提取的质粒DNA进行定量，作为试剂盒阳性质控标准品-20℃保存备用。定量计算公式为：阳性质粒拷贝数copies/μL= (OD₂₆₀×50×10^-9×稀释倍数×6.02×10²³) / (660×碱基数)，式中：50代表用直径1cm比色杯在OD₂₆₀等于1时相对应的双链DNA浓度为50μg/mL；660代表双链DNA碱基对平均分子量。

实施例3  

三种链球菌三重实时荧光PCR引物及探针的设计合成

根据Genbank中已发布的无乳链球菌、停乳链球菌和海豚链球菌基因组DNA序列，结合生物信息学手段，确定以无乳链球菌的cpsF基因、停乳链球菌的MIG基因和海豚链球菌的16S rRNA基因的保守区序列作为检测靶序列，设计合成了3对引物和3条探针，以便对无乳链球菌、停乳链球菌和海豚链球菌进行定性检测。如表2所示。

表2 三种链球菌三重实时荧光PCR引物及探针

实施例4  

三重荧光PCR条件的优化

本发明采用单因子浓度梯度实验法逐一改变实时荧光PCR反应体系中各组分浓度，以优化实时荧光PCR反应体系，建立了三重实时荧光PCR。优化结果如图1所示。优化后的PCR反应体系如下所示：

2×Quantitech Multiplex PCR NoRox Master Mix12. 5μL5μM cpsF- FP0.5μL5μM MIG- RP0.5μL5μM cpsF-PROBE1μL5μM MIG- FP0.5μL5μM MIG- RP0.5μL5μM MIG-PROBE1μL5μM 16SrRNA- FP0.5μL5μM 16SrRNA-RP0.5μL5μM 16SrRNA-PROBE1μLddH₂O3.5μLpMD-T-cpsF1μLpMD-T-MIG1μLpMD-T-16SrRNA1μL

扩增反应条件均为：

Step 1   95℃   15min；

Step 2   94℃   60s

Step 3   60℃   60s

Step 4   读数，Go  to  Step 2  for  40个循环。

实施例5

三重荧光PCR检测三种链球菌灵敏度试验

分别将浓度约为1.52×10⁸无乳链球菌、浓度约为1.33×10⁸停乳链球菌、浓度约为1.76×10⁷ CFU/mL的海豚链球菌进行10倍梯度稀释，每个浓度梯度设3个平行。采用试剂盒提取每个稀释度无乳链球菌、停乳链球菌和海豚链球菌的基因组DNA，以此作为模板进行无乳链球菌、停乳链球菌和海豚链球菌实时荧光PCR检测，确定检测方法的灵敏度。结果如图2-4所示。如图可知，无乳链球菌原始菌液稀释至10^-7时仍能检出，表明本检测方法对无乳链球菌的检测灵敏度约为1.52×10²CFU/mL(见图2)；停乳链球菌原始菌液稀释至10^-6时仍能检出，表明本检测方法对停乳链球菌的检测灵敏度约为1.33×10²CFU/mL(见图3)；海豚链球菌原始菌液稀释至10^-6时仍能检出，表明本检测方法对海豚链球菌的检测灵敏度约为1.76×10²CFU/mL(见图4) 。

实施例6 

三重荧光PCR检测三种链球菌特异性试验  

利用建立的三重实时荧光PCR检测方法对表3中的细菌进行检测，以探究该方法检测的特异性，结果如表1所示。结果显示，本发明方法能够特异性地检测无乳链球菌、停乳链球菌和海豚链球菌，且与其他菌株无交叉反应，说明本发明方法具有高度的特异性，如图5-7所示。

表3 实时荧光PCR方法检测的特异性结果

菌株来源荧光PCR结果空肠弯曲菌Campylobacter>ATCC 33560－肠出血性大肠埃希菌Enterohemorrhagic> O₁₅₇:>ATCC 35150－单核细胞增生李斯特菌Listeria>ATCC 19111－伤寒沙门氏菌Salmonella>CMCC50115－志贺菌ShigellaATCC 12022－金黄色葡萄球菌Staphylococcus>ATCC 29213－小肠结肠炎耶尔森氏菌Yersinia>ATCC 9610－霍乱弧菌Vibrio>ATCC 51394－创伤弧菌Vibrio>ATCC 27562－溶藻弧菌Vibrio>ATCC 33787－副溶血弧菌Vibrio>ATCC 27519－无乳链球菌Streptococcus>ATCC 35666+停乳链球菌Streptococcus>ATCC 13813+海豚链球菌Streptococcus>ATCC29178+

实施例7 

三重荧光PCR检测三种链球菌重复性试验

1、利用本发明方法重复20次检测同一个阳性标准品，考察该方法检测的重复性和稳定性。结果显示，每次检测结果均相同。

2、利用本发明方法间隔30天检测同一批次阳性标准品，考察该方法检测的重复性和稳定性。结果显示，两次检测结果相同。

实施例8 

三重荧光PCR检测三种链球菌实践验证试验

应用建立的三重实时荧光PCR检测方法对采集的实际样本进行检测，共检测罗非鱼样品181份，结果共检出2份海豚链球菌阳性样本，利用单重实时荧光PCR检测方法进行验证，符合率为100%，显示本发明方法具有良好的可靠性和实用性。

<110>中华人民共和国海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>同时检测三种链球菌的三重实时荧光PCR方法及试剂盒

<160>18

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

TGAAAATTTG TCTGGTTGGT TC

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

CGGCACCAGA TGATATGATA AC

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

TGGTGGTCAT CTAGCACACT TGAACCT

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

AAATGATTTA GTTGCGACTG AC 

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

TTCAACAATC CTATCTTGAG AATC  

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

TGCTACTCCG GGAGGCGTAT TTACAG  

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

GCGTTGTATT AGCTAGTTGG TG 

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

AAACCTTCTT CACTCACGC  

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ACGGCTCACC AAGGCGACGA TACATA  

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ATGAAAATTT GTCTGGTTGG T 

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

ATTCCTCCTA AATTAATTGC CTT  

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

CTTTTGGATT AGCGTCTGTA T 

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

TCTTTACGTT TTGAAGCGAC T 

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

GTAGAACGCT GAGGATTGGT G 

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

ATCTAATCCT GTTTGCTCCC C  

<210>16

<211>3135

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA   60       CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG  120      TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC  180      ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC  240      ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT  300      TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT  360      TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGAATT CGAGCTCGGT ACCCGGGGAT  420      CCTCTAGAGA TATGAAAATT TGTCTGGTTG GTTCAAGTGG TGGTCATCTA GCACACTTGA  480      ACCTTTTGAA ACCCATTTGG GAAAAAGAAG ATAGGTTTTG GGTAACCTTT GATAAAGAAG  540      ATGCTAGGAG TATTCTAAGA GAAGAGATTG TATATCATTG CTTCTTTCCA ACAAACCGTA  600      ATGTCAAAAA CTTGGTAAAA AATACTATTC TAGCTTTTAA GGTCCTTAGA AAAGAAAGAC  660      CAGATGTTAT CATATCATCT GGTGCCGCTG TAGCAGTACC ATTCTTTTAT ATTGGTAAGT  720      TATTTGGTTG TAAGACCGTT TATATAGAGG TTTTCGACAG GATAGATAAA CCAACTTTGA  780      CAGGAAAATT AGTGTATCCT GTAACAGATA AATTTATTGT TCAGTGGGAA GAAATGAAAA  840      AAGTTTATCC TAAGGCAATT AATTTAGGAG GAATATCGTC GACCTGCAGG CATGCAAGCT  900      TGGCGTAATC ATGGTCATAG CTGTTTCCTG TGTGAAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCAC  960      ACAACATACG AGCCGGAAGC ATAAAGTGTA AAGCCTGGGG TGCCTAATGA GTGAGCTAAC 1020     TCACATTAAT TGCGTTGCGC TCACTGCCCG CTTTCCAGTC GGGAAACCTG TCGTGCCAGC 1080     TGCATTAATG AATCGGCCAA CGCGCGGGGA GAGGCGGTTT GCGTATTGGG CGCTCTTCCG 1140     CTTCCTCGCT CACTGACTCG CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT GCGGCGAGCG GTATCAGCTC 1200     ACTCAAAGGC GGTAATACGG TTATCCACAG AATCAGGGGA TAACGCAGGA AAGAACATGT 1260     GAGCAAAAGG CCAGCAAAAG GCCAGGAACC GTAAAAAGGC CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC 1320     ATAGGCTCCG CCCCCCTGAC GAGCATCACA AAAATCGACG CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA 1380     ACCCGACAGG ACTATAAAGA TACCAGGCGT TTCCCCCTGG AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC 1440     CTGTTCCGAC CCTGCCGCTT ACCGGATACC TGTCCGCCTT TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG 1500     CGCTTTCTCA TAGCTCACGC TGTAGGTATC TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC 1560     TGGGCTGTGT GCACGAACCC CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTATC 1620     GTCTTGAGTC CAACCCGGTA AGACACGACT TATCGCCACT GGCAGCAGCC ACTGGTAACA 1680     GGATTAGCAG AGCGAGGTAT GTAGGCGGTG CTACAGAGTT CTTGAAGTGG TGGCCTAACT 1740     ACGGCTACAC TAGAAGAACA GTATTTGGTA TCTGCGCTCT GCTGAAGCCA GTTACCTTCG 1800     GAAAAAGAGT TGGTAGCTCT TGATCCGGCA AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT 1860     TTGTTTGCAA GCAGCAGATT ACGCGCAGAA AAAAAGGATC TCAAGAAGAT CCTTTGATCT 1920     TTTCTACGGG GTCTGACGCT CAGTGGAACG AAAACTCACG TTAAGGGATT TTGGTCATGA 1980     GATTATCAAA AAGGATCTTC ACCTAGATCC TTTTAAATTA AAAATGAAGT TTTAAATCAA 2040     TCTAAAGTAT ATATGAGTAA ACTTGGTCTG ACAGTTACCA ATGCTTAATC AGTGAGGCAC 2100     CTATCTCAGC GATCTGTCTA TTTCGTTCAT CCATAGTTGC CTGACTCCCC GTCGTGTAGA 2160     TAACTACGAT ACGGGAGGGC TTACCATCTG GCCCCAGTGC TGCAATGATA CCGCGAGACC 2220     CACGCTCACC GGCTCCAGAT TTATCAGCAA TAAACCAGCC AGCCGGAAGG GCCGAGCGCA 2280     GAAGTGGTCC TGCAACTTTA TCCGCCTCCA TCCAGTCTAT TAATTGTTGC CGGGAAGCTA 2340     GAGTAAGTAG TTCGCCAGTT AATAGTTTGC GCAACGTTGT TGCCATTGCT ACAGGCATCG 2400     TGGTGTCACG CTCGTCGTTT GGTATGGCTT CATTCAGCTC CGGTTCCCAA CGATCAAGGC 2460     GAGTTACATG ATCCCCCATG TTGTGCAAAA AAGCGGTTAG CTCCTTCGGT CCTCCGATCG 2520     TTGTCAGAAG TAAGTTGGCC GCAGTGTTAT CACTCATGGT TATGGCAGCA CTGCATAATT 2580     CTCTTACTGT CATGCCATCC GTAAGATGCT TTTCTGTGAC TGGTGAGTAC TCAACCAAGT 2640     CATTCTGAGA ATAGTGTATG CGGCGACCGA GTTGCTCTTG CCCGGCGTCA ATACGGGATA 2700     ATACCGCGCC ACATAGCAGA ACTTTAAAAG TGCTCATCAT TGGAAAACGT TCTTCGGGGC 2760     GAAAACTCTC AAGGATCTTA CCGCTGTTGA GATCCAGTTC GATGTAACCC ACTCGTGCAC 2820     CCAACTGATC TTCAGCATCT TTTACTTTCA CCAGCGTTTC TGGGTGAGCA AAAACAGGAA 2880     GGCAAAATGC CGCAAAAAAG GGAATAAGGG CGACACGGAA ATGTTGAATA CTCATACTCT 2940     TCCTTTTTCA ATATTATTGA AGCATTTATC AGGGTTATTG TCTCATGAGC GGATACATAT 3000     TTGAATGTAT TTAGAAAAAT AAACAAATAG GGGTTCCGCG CACATTTCCC CGAAAAGTGC 3060     CACCTGACGT CTAAGAAACC ATTATTATCA TGACATTAAC CTATAAAAAT AGGCGTATCA 3120     CGAGGCCCTT TCGTC                                                           3135

<210>17

<211>4654

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA   60       CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG  120      TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC  180      ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC  240      ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT  300      TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT  360      TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGAATT CGAGCTCGGT ACCCGGGGAT  420      CCTCTAGAGA TCTTTTTACG TAAATCAGCT TTTGGATTAG CGTCTGTATC AGCTGCGTTT  480      TTAGTTTCGG GAGCACTAGA AAATACTATA ACTGTTTCTG CAGAAACTAT ACCTGCAGCG  540      GTCATTGTAC CTGTTGGCCT AGATACTACA GAATTACAAA AATGGTATGA CATTGCAAAT  600      GATTTAGTTG CGACTGACAA TGCTACTCCG GGAGGCGTAT TTACAGCAGA CTCAATGAAG  660      GCATTATATC GTTTACTAAA TGATGCATAC GATGTGTTGG AATCAAAAGA CTATAGAAAA  720      TATGATTCTC AAGATAGGAT TGTTGAATTG GTAAACAATT TAAAGAATAC TACGCAGTCT  780      CTTTTACCAA TTGGAGTAGA ACCAGTAGTA TTTGATACTA CTCGCTTGAA TACCTGGTAT  840      GATGCTGCTA ATGAAATTGT TAATAATTCA GATGCTTATA CAGCAGAATC AATTCAGCCG  900      TTGTATAAGT TAATTAATGA TGCATACGAT GTGTTAGAAT CAAAAGATTA CAGTAAGTAT  960      GATTCTCAAG ATAAAGTCAA CAATCTTGCA GATCAGTTGA GAGATGCAGT TCAGGCAGTT 1020     CAACTAGAAG CACCTACAGT GATTGACGCA CCTGAACTAA CTCCAGCTTT GACTACTTAC 1080     AAACTTGTTG TTAAAGGTAA CACTTTCTCA GGAGAAACAA CTACTAAAGC CATCGATACT 1140     GCAACTGCGG AAAAAGAATT CAAACAATAC GCAACAGCTA ACAATGTTGA CGGTGAGTGG 1200     TCTTATGACG ATGCAACTAA AACCTTTACA GTTACTGAAA AACCAGCAGT GATTGACGCA 1260     CCTGAACTAA CTCCAGCCTT GACTACTTAC AAACTTATTG TTAAAGGTAA CACTTTCTCA 1320     GGCGAAACAA CTACTAAAGC AGTAGACGCA GAAACTGCAG AAAAAGCCTT CAAACAATAC 1380     GCAACAGCTA ACAATGTTGA CGGTGAGTGG TCTTATGACG ATGCAACTAA AACCTTTACA 1440     GTTACTGAAA AACCAGCAGT GATTGACGCA CCTGAACTAA CTCCAGCCTT GACTACTTAC 1500     AAACTTATTG TTAAAGGTAA CACTTTCTCA GGCGAAACAA CTACTAAAGC TATCGATGCT 1560     GCAACTGCAG AAAAAGAATT CAAACAATAC GCAACAGCTA ACGGTGTTGA CGGTGAATGG 1620     TCTTATGACG ATGCAACTAA AACCTTTACA GTTACTGAAA AACCAGCAGT GATTGACGCA 1680     CCTGAACTAA CTCCAGCCTT GACTACTTAC AAACTTATTG TTAAAGGTAA CACTTTCTCA 1740     GGCGAAACAA CTACTAAAGC AGTAGACGCA GAAACTGCAG AAAAAGCCTT CAAACAATAC 1800     GCTAACGAAA ACGGTGTTTA CGGTGAATGG TCTTATGACG ATGCAACTAA AACCTTTACA 1860     GTTACTGAAA AACCAGCAGT GATTGACGCA CCTGAATTAA CACCAGCATT GACAACCTAC 1920     AAACTTGTTA TCAATGGTAA AACATTGAAA GGCGAAACAA CTACTAAAGC AGTAGACGCA 1980     GAAACTGCAG AAAAAGCCTT CAAACAATAC GCTAACGAAA ACGGTGTTGA TGGTGTTTGG 2040     ACTTACGATG ATGCGACTAA GACCTTTACG GTAACTGAAA TGGTTACTGA AGTTCCTGGT 2100     GATGCACCAA CTGAACCAGA AAAGCCAGAA GCAAGTATCC CTCTTGTTCC GTTAACTCCT 2160     GCAACTCCAA TTGCTAAAGA TGACGCTAAG AAAGACGATA CTAAGAAAGT CGATACTAAG 2220     AAAGAAGACG CTAAAAAACC AGAAGCTAAG AAAGAAGAAG CTAAGAAAGA AGAAGCTAAG 2280     AAAGCTGCAA CTCTTCCTAC AACTGGTGAA GGAAGCAACC CATTTTTCAC AGCTGCTGCG 2340     CTTGCAGTAA TGGCTGGTGC GGGTGCTTTG GCAGTCGCTT CAAAACGTAA AGAATCGTCG 2400     ACCTGCAGGC ATGCAAGCTT GGCGTAATCA TGGTCATAGC TGTTTCCTGT GTGAAATTGT 2460     TATCCGCTCA CAATTCCACA CAACATACGA GCCGGAAGCA TAAAGTGTAA AGCCTGGGGT 2520     GCCTAATGAG TGAGCTAACT CACATTAATT GCGTTGCGCT CACTGCCCGC TTTCCAGTCG 2580     GGAAACCTGT CGTGCCAGCT GCATTAATGA ATCGGCCAAC GCGCGGGGAG AGGCGGTTTG 2640     CGTATTGGGC GCTCTTCCGC TTCCTCGCTC ACTGACTCGC TGCGCTCGGT CGTTCGGCTG 2700     CGGCGAGCGG TATCAGCTCA CTCAAAGGCG GTAATACGGT TATCCACAGA ATCAGGGGAT 2760     AACGCAGGAA AGAACATGTG AGCAAAAGGC CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC 2820     GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA TAGGCTCCGC CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGACGC 2880     TCAAGTCAGA GGTGGCGAAA CCCGACAGGA CTATAAAGAT ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA 2940     AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC TGTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCT GTCCGCCTTT 3000     CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC GCTTTCTCAT AGCTCACGCT GTAGGTATCT CAGTTCGGTG 3060     TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGCTGC 3120     GCCTTATCCG GTAACTATCG TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT ATCGCCACTG 3180     GCAGCAGCCA CTGGTAACAG GATTAGCAGA GCGAGGTATG TAGGCGGTGC TACAGAGTTC 3240     TTGAAGTGGT GGCCTAACTA CGGCTACACT AGAAGAACAG TATTTGGTAT CTGCGCTCTG 3300     CTGAAGCCAG TTACCTTCGG AAAAAGAGTT GGTAGCTCTT GATCCGGCAA ACAAACCACC 3360     GCTGGTAGCG GTGGTTTTTT TGTTTGCAAG CAGCAGATTA CGCGCAGAAA AAAAGGATCT 3420     CAAGAAGATC CTTTGATCTT TTCTACGGGG TCTGACGCTC AGTGGAACGA AAACTCACGT 3480     TAAGGGATTT TGGTCATGAG ATTATCAAAA AGGATCTTCA CCTAGATCCT TTTAAATTAA 3540     AAATGAAGTT TTAAATCAAT CTAAAGTATA TATGAGTAAA CTTGGTCTGA CAGTTACCAA 3600     TGCTTAATCA GTGAGGCACC TATCTCAGCG ATCTGTCTAT TTCGTTCATC CATAGTTGCC 3660     TGACTCCCCG TCGTGTAGAT AACTACGATA CGGGAGGGCT TACCATCTGG CCCCAGTGCT 3720     GCAATGATAC CGCGAGACCC ACGCTCACCG GCTCCAGATT TATCAGCAAT AAACCAGCCA 3780     GCCGGAAGGG CCGAGCGCAG AAGTGGTCCT GCAACTTTAT CCGCCTCCAT CCAGTCTATT 3840     AATTGTTGCC GGGAAGCTAG AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG CAACGTTGTT 3900     GCCATTGCTA CAGGCATCGT GGTGTCACGC TCGTCGTTTG GTATGGCTTC ATTCAGCTCC 3960     GGTTCCCAAC GATCAAGGCG AGTTACATGA 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<400>18

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