从乳汁中分离和培养奶牛乳腺上皮细胞的方法及专用培养基

摘要

本发明公开了一种从乳汁中分离和培养奶牛乳腺上皮细胞的方法及专用培养基。本发明公开一种从牛乳汁中分离和培养乳腺上皮细胞的方法，包括如下步骤：选择牛乳汁中体细胞数低于5×104个/ml并且处于泌乳中后期的牛，采集牛乳汁；分离并培养牛乳汁中的乳腺上皮细胞。本发明公开的方法通过奶牛生产记录限定适宜乳汁采样牛只的条件以及确定收集期为泌乳中后期，通过人工挤奶方法，简便、快速，经济的获得牛奶样品，并分离、培养乳腺上皮细胞，结果可靠、稳定，操作简单，适合常规实验室实验需要，成本低、细胞状态好，同时与组织块培养法相比，仅需获得牛乳样品，对牛只没有损伤，操作简单，适用范围更广。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从乳汁中分离和培养奶牛乳腺上皮细胞的方法及专用培养基，属 于生物技术领域。

背景技术

乳房是母畜特有的哺育器官，泌乳期乳腺内充满丰富的腺泡和导管(崔立莉， 2006)。乳腺是由外层肌上皮和内层分泌上皮细胞围成的球形结构，与导管相连，其 中分泌上皮是腺泡内合成乳成分的基本单元，是其行使泌乳功能的基础。因此，它是 研究乳成分合成和变动机制、乳腺发育和变化以及乳腺肿瘤形成、癌变的相关因子和 基因的不可或缺的实验材料(杜鹃等，2007)。

目前，乳腺上皮细胞的培养历史已有100多年，作为一种高度分化的成体细胞， 其在离体培养一段时间后往往出现形态和特性的脱分化，趋向变为成纤维样的状态 (Ebner等，1961)。有限二倍体细胞由于脱离正常的体内环境，原代培养后逐渐脱 分化的现象是很常见的。面对这种问题，研究人员用基因转移技术将SV40、原癌基因 和人端粒酶逆转录酶基因等外源基因整合到有限细胞内，可获得永生性的转化细胞(陶 谦等，2001)。永生性细胞在保持着部分与起源细胞相似的生物特性和表型的同时， 也表现出一些转化和纯化培养后的新特点。外源基因随机整合到宿主细胞基因组的位 置不确定，其插入位点可能影响到细胞原有基因的功能，克隆细胞由于缺少细胞互作 的影响也表现出新的特征。已有的永生化乳腺上皮细胞系对因子刺激的反应和乳成分 的表达存在差异，这些不确定性使其应用受到限制。

由于永生化细胞的诸多不确定性，原代细胞系更能代表体内的器官特异性功能和 信号转导途径。一般体外培养的乳腺上皮细胞可以稳定培养几个月，能满足细胞实验 周期的需要。因此，多数生物学实验还是首选原代培养的乳腺上皮细胞(Pantsckenko 等，2000)。原代细胞经过多次传代后丢掉一些原始的受限制的特性，在生长率、乳 汁合成、对因子刺激的反应和敏感性上与体内细胞存在差异。不过，这个问题可以通 过低温贮存新鲜分离的细胞来解决，对培养细胞运用冷冻解冻技术(Bramley等， 1982)，以保持其原有细胞特性，让符合研究需求的原代细胞和传代细胞能够得到长 久保存，使在不同实验条件下分析同一原始特性细胞的特征成为可能。同时，可通过 添加一些生物活性因子(胰岛素，氢化可的松，表皮生长因子，转铁蛋白等)促进细 胞增殖和维持细胞特性，延缓细胞脱分化。

目前国内培养原代乳腺上皮细胞通常采用的方法为组织块培养法，这种方法通过 活体穿刺或屠宰获得活体组织，一方面对牛体的损害较大、购买健康成体牛的成本高； 另一方面，多获得的是淘汰牛的活体组织，难以获得高产牛的组织样品。

发明内容

本发明的目的是提供一种从乳汁中分离和培养奶牛乳腺上皮细胞的方法及专用培 养基。

本发明提供一种从牛乳汁中分离和培养乳腺上皮细胞的方法，包括如下步骤：选 择牛乳汁中体细胞数低于5×10⁴个/ml并且处于泌乳中后期的牛，采集牛乳汁；分离 并培养牛乳汁中的乳腺上皮细胞；

所述泌乳中后期为产犊后150-250d；

所述采集牛乳汁时前50-100ml牛乳汁不收集。

上述方法中，所述分离并培养牛乳汁中的乳腺上皮细胞包括分离并培养原代牛乳 腺上皮细胞，再将原代牛乳腺上皮细胞进行传代培养，得到传代的牛乳腺上皮细胞。

上述任一所述的方法中，所述原代牛乳腺上皮细胞和传代的牛乳腺上皮细胞培养 时使用的培养基按照如下方法制备：将DMEM/DF12培养基和FBS按照体积比为9：1 混匀，加入终浓度为1×的青霉素，终浓度为1×的链霉素，终浓度为5ug/mL的胰岛 素，终浓度为5ug/mL的转铁蛋白，终浓度为5ug/mL的氢化可的松，终浓度为10ng/mL 的表皮生长因子，终浓度为1ug/mL的孕酮，终浓度为10ng/mL的重组牛胎盘催乳素；

所述DMEM/DF12培养基购自Gibco，产品目录号为C11330500BT；

所述终浓度为1×的青霉素和终浓度为1×的链霉素的母液是浓度为100×的青霉 素/链霉素双抗溶液；

所述浓度为100×的青霉素/链霉素双抗溶液的商品名称为青霉素/链霉素双抗溶 液(100×)，购自Gibco，产品目录号为15140-122；

所述重组牛胎盘催乳素购自Prospec，产品目录号为CYT-511。

上述任一所述的方法中，所述牛为奶牛。

上述任一所述的方法中，所述奶牛为荷斯坦牛。

一种培养基也属于本发明的保护范围，按照如下方法制备：将DMEM/DF12培养基 和FBS按照体积比为9：1混匀，加入终浓度为1×的青霉素,终浓度为1×的链霉素， 终浓度为5ug/mL的胰岛素，终浓度为5ug/mL的转铁蛋白，终浓度为5ug/mL的氢化可 的松，终浓度为10ng/mL的表皮生长因子，终浓度为1ug/mL的孕酮，终浓度为10ng/mL 的重组牛胎盘催乳素；

所述DMEM/DF12培养基购自Gibco，产品目录号为C11330500BT；

所述终浓度为1×的青霉素和终浓度为1×的链霉素的母液是浓度为100×的青霉 素/链霉素双抗溶液；

所述浓度为100×的青霉素/链霉素双抗溶液的商品名称为青霉素/链霉素双抗溶 液(100×)，购自Gibco，产品目录号为15140-122；

所述重组牛胎盘催乳素购自Prospec，产品目录号为CYT-511。

本发明提供的方法通过奶牛生产记录限定适宜乳汁采样牛只的条件以及确定收集 期为泌乳中后期，通过人工挤奶的方法，简便、快速，经济的获得牛奶样品，并分离、 培养乳腺上皮细胞，结果可靠、稳定，操作简单，适合常规实验室实验需要，成本低、 获得的细胞状态好。本发明的方法与组织块培养法相比，仅需获得牛乳样品，对牛只 没有损伤，操作简单，适用范围更广。

附图说明

图1为从乳汁中分离的原代乳腺上皮细胞的形态。

图2为牛乳腺上皮细胞生长曲线。

图3为乳腺上皮细胞的角蛋白18染色结果。

图4为乳腺上皮细胞内乳成分相关基因的RT-PCR检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

DMEM/DF12培养基购自Gibco，产品目录号为C11330500BT。

胎牛血清(FBS)购自Gibco，产品目录号为10099-141。

青霉素/链霉素双抗溶液(100×)购自Gibco，产品目录号为15140-122。

胰岛素(牛，细胞级)购自Sigma，产品目录号为I5500。

转铁蛋白购自Sigma，产品目录号为G7250。

氢化可的松购自Sigma,产品目录号为H0888-1G。

表皮生长因子购自Gibco，产品目录号为PHG6045。

孕酮购自Sigma，产品目录号为P8783。

重组牛胎盘催乳素购自Prospec，产品目录号为CYT-511。

下述实施例中的所用的完全培养基的配制：将DMEM/DF12和FBS按照体积比为9： 1混匀，加入青霉素/链霉素双抗溶液至抗生素的终浓度均为1×，添加终浓度如下的 各因子：胰岛素(5ug/mL)，转铁蛋白(5ug/mL)，氢化可的松(5ug/mL)，表皮生长因子 (10ng/mL)，孕酮(1ug/mL)，重组牛胎盘催乳素(10ng/mL)，该培养基用于乳腺上皮细 胞的培养。

非免疫山羊血清购自福州迈新生物技术开发有限公司。

Anti-cytokeratin 18抗体购自abcam，产品目录号为ab668。

荧光标记的二抗(alexa488goat anti-mouse IgG(H+L))购Proteintech (PTG)，产品目录号为SA00006-1。

BSA抗体稀释液购自北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CW2340。

实施例1、适宜采样的牛的选择和乳汁样品的采集和保存

一、根据生产记录选择牛乳中体细胞数低于5×10⁴个/ml(避免隐性乳房炎)的 乳房健康的处于泌乳中后期(产犊后150～250d)的荷斯坦牛，一天采两次奶，一次早 上，一次下午，每次只收一次奶。于早上第一次采奶时手工挤奶，一般收集150mL 左右的乳汁到无菌离心管(采集前，用大块酒精棉球擦拭被采集的牛只乳头，前三把 奶大约50-100ml去除不收，以减少外源细菌在乳头处对牛奶的污染))，同时更换牛只 的时候，更换一次性手套，避免对牛奶形成外源性污染。

二、牛奶收集后，用酒精棉球擦拭完离心管口和盖子后，用封口膜密封后，做好 标记，将牛奶的温度保持在4-37℃之间，保证样品在2h左右带回实验室，以便进行 后续处理。

实施例2、牛乳中原代乳腺上皮细胞的分离和收集

一、将实施例1得到的牛奶在常温离心机中1000r/min离心20min,离心后牛 奶分为两层，上层为粘稠的乳脂，下层为浑浊的液体。此时细胞集中在离心管底部， 尽量去除上层乳脂，保留10mL底层浑浊液体，尽量减少底部液体晃动。

二、在底层浑浊液体中加入等量的无菌PBS，混匀后，1000r/min离心10min， 去除上层液体，继续保留10mL底部液体。重复该步骤3～5次，直至底部液体澄清。

三、将步骤二得到的底部液体转入15mL离心管，15000r/min离心10min，吸 弃上清，保留1mL上清。

四、用移液器混匀保留的上清和离心管底部沉淀，移至T25细胞培养瓶，加入完 全培养基培养乳腺上皮细胞。

五、隔天换新的完全培养基。换液前，吸出旧培养基后，将培养瓶倾斜，在瓶口 处缓慢加入PBS，使PBS沿倾斜面慢慢过细胞表面，然后去除清洗液PBS，重复1～2 次该操作，清除培养瓶中不贴壁的非细胞成分，加入新的完全培养基继续培养。

实施例3、乳腺上皮细胞的原代培养、传代、冻存和复苏

一、将实施例2培养的细胞每隔3天换新的完全培养基一次，直至较大的细胞克 隆形成。

从乳汁中分离的原代乳腺上皮细胞的形态如图1所示。

图1中，A1为培养到第5天，单个原代乳腺上皮细胞贴壁后的形态；A2为培养到 第5天，单个原代乳腺上皮细胞增殖后形成约为10个细胞的克隆(100×)。B1和B2 为培养到第14天，单克隆形成的大的细胞集落(100×)。C为培养20天以后，部分 细胞内出现滴状物(100×)。D为培养20天以后，细胞集落中出现的部分细胞围成的 空腔(100×)。

从牛乳汁中离心获取的原代乳腺上皮细胞初次接种过夜后活的乳腺上皮细胞即贴 壁，此时细胞培养基悬浮着大量的蛋白、脂类以及死细胞等杂质，细胞培养基在显微 镜下观察悬浮成分较多，因此过夜后应及时换液，清除不贴壁成分，防止杂质影响细 胞生长。乳汁中获得的细胞数量较少，头一天一般不易看出贴壁细胞，待培养3～5d 后，单细胞贴壁铺展后，形态清晰并开始增殖，能够观察到单个细胞或少数细胞构成 的小的克隆集落，细胞成圆饼状、短梭形或多角形(如图1中A1和A2)。继续培养， 细胞开始大量增殖，细胞集落增大(如图1中B1和B2)并相互汇集。随后，部分细 胞中会出现滴状结构(如图1中C箭头所示)，密集的细胞集落中出现细胞围成的空腔 (如图1中D箭头所示)。

从乳汁中分离的细胞为上皮类型，没有成纤维细胞的污染。

二、待较大细胞克隆形成后(初次接种培养的21d左右)，可进行乳腺上皮细胞的 传代、冻存和复苏的实验。

(一)细胞传代，操作如下：用0.25％胰酶/EDTA消化液在37℃下消化细胞3-5min 后，加样枪吸取消化液反复吹洗单层细胞表面，收集消化液到含有等量完全培养基的 离心管中终止消化，重复上述操作1次，收集剩余贴壁细胞。将收集的细胞在1000 r/min离心5min，保留沉淀，将其接种到新的培养皿中，添加新的完全培养基，接种 密度按24h能形成40％汇集率的细胞量计算(保持传代时适宜的细胞密度,细胞密度过 低时细胞增殖速度明显变慢)，过夜培养后换液，此后每3天更换一次培养基。

(二)细胞冻存，操作如下：用0.25％胰酶/EDTA消化液收集步骤(一)得到的传 代的对数生长期的单层细胞，离心沉淀，加入1mL完全培养基重悬细胞，取少量重悬 液适当稀释后，进行血细胞计数，用冻存保护液(DMEM/F12：FBS：DMSO体积比为7： 2：1)稀释细胞至合适的数量级，每1mL分装到2mL的冻存管中，一般10cm²平皿 收获的细胞可以冻存3-5管。冻存细胞采用梯度降温法：4℃10min，-20℃30min， -80℃过夜，细胞在超低温冰箱过夜后转入液氮罐长期冻存。

(三)细胞复苏：从液氮罐中取出冻存的传代细胞，在37℃的水浴锅中振摇，促 使细胞迅速解冻，将细胞悬液在无菌条件下转入离心管，1000r/min离心5min，保 留细胞沉淀，1mL完全培养基重悬细胞，接种到T25培养瓶中，37℃恒温培养，过夜 换培养基。此后每3天换1次新的培养基。

实施例4、乳腺上皮细胞性质鉴定

一、生长特性鉴定

细胞生长曲线绘制：将传代培养至第五代的细胞接种到24孔培养板中，每孔加入 5×10⁴个细胞。共设置14组，每组3个重复，接种后1～14天每天消化收集1组细胞， 将每组的3孔细胞混在一起，离心沉淀后加入400μL PBS混匀，用血细胞计数板重 复计数5-6次。以培养时间作为横坐标，以每天计算的每孔细胞的平均数为纵坐标,绘 制14天的牛乳腺上皮细胞生长曲线，如图2所示。

细胞生长曲线常用于衡量细胞的生长增殖能力。传代细胞的生长要经历潜伏期(细 胞缓慢增殖)，指数生长期(细胞快速增殖)，平台期(细胞数量恒定)及衰亡期(细 胞死亡)4个部分。

图2表明，体外培养的牛乳腺上皮细胞在前7d内处于平台期，细胞生长缓慢， 以适应新的培养环境，从第8开始进入指数生长期，第13d后进入增殖减缓的平台期， 结果表明，乳腺上皮细胞的生长曲线为典型的S型。

二、免疫荧光(IF)染色鉴定细胞角蛋白18

角蛋白是上皮细胞特有的细胞骨架蛋白，通过免疫荧光检测细胞内角蛋白18的表 达，以判定细胞的上皮特性。具体操作如下：

(一)将乳腺上皮细胞按适宜数量接种，隔天吸弃培养液，PBS冲洗三次后用体 积百分含量2％～4％甲醛的PBS溶液固定15min，得到固定好的细胞；

(二)将固定好的细胞用PBS洗涤3次，每次5分钟，滴加非免疫山羊血清(内 含体积百分含量为0.3％Triton X-100)，覆盖细胞液面2～3mm，室温放置60min， 甩去多余液体；

(三)滴加CK18的一抗Anti-cytokeratin 18抗体(用BSA抗体稀释液按照体积 比1：500稀释)50μL，4℃过夜。

(四)过夜后，用PBS洗3次，每次5min，滴加荧光标记的二抗alexa488 goat anti-mouse IgG(H+L)(用BSA抗体稀释液按照体积比1：200稀释)，室温孵育 60min；

(五)PBS冲洗3次，去除二抗，加入DAPI染色15min以上；

(六)用含体积百分含量0.1％的Tween-20的PBS漂洗3次，每次10min；

(七)在荧光显微镜下观察。

乳腺上皮细胞的角蛋白18染色结果如图3所示。

图3中，A为乳腺上皮细胞的DAPI核染以定位细胞，图中蓝色圆形和椭圆形为 单个细胞核(400×)。B为乳腺上皮细胞的骨架蛋白-角蛋白18免疫荧光染色结果， 绿色代表细胞抗原-抗体反应呈阳性，分离的乳腺上皮细胞表达角蛋白18(400×)。 C为A与B的重叠图，显示所检测细胞为角蛋白18阳性细胞。

角蛋白18是乳腺上皮细胞特异性表达的骨架蛋白，以上结果表明，采用免疫荧 光方法对角蛋白18进行免疫荧光染色后，观察到核周围出现绿色阳性反应，说明角蛋 白18分布于细胞核外。蓝色部分为DAPI染色的细胞核，呈椭圆形，用于细胞定位。 结合细胞形态特征，证明培养和纯化后所得的细胞为乳腺上皮细胞。

三、细胞乳成分相关基因表达特性鉴定

乳中的主要成分：乳蛋白，乳糖和乳脂，是细胞从血液中获得前体物质，在乳腺 上皮细胞中合成后，释放到乳腺腺泡的。

选择乳蛋白基因CSN1S1，CSN2，LGB，持家基因GAPDH，根据GenBank的基因序 列，设计上述基因的特异性引物，通过RT-PCR扩增，分析体外培养细胞的分泌特性和 目的基因的表达情况，步骤如下：

将传至5代的乳腺上皮细胞培养至其铺满平皿后，用TRizol裂解细胞，提取总 RNA，反转录为cDNA，采用TaKaRa Taq^TM Version 2.0(购自TaKaRa，产品目录号为 R004A)进行RT-PCR检测乳成分相关基因的表达。

RT-PCR检测的基因以及对应的引物如表1所示。

RT-PCR反应体系和程序分别如表2和3所示。

表1 RT-PCR扩增特异引物

表2 RT-PCR反应体系

表3 RT-PCR程序

乳腺上皮细胞内乳成分相关基因的RT-PCR检测结果如图4所示。

图4中，M为DNA marker。

图4表明，CSN1S1、CSN2、LGB在体外培养的细胞中均有表达，在相同扩增条件 下，CSN2的表达量较低，而CSN1S1的表达量较高，说明体外培养的细胞有分泌乳汁 的能力。