一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条

摘要

一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条，包括一个样品垫、一个含有胶体金标记探针的金标垫、一个纤维素膜、一个吸水垫组成，纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检测线，检测线由特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体组成，由保藏号为CGMCC No.9240的小鼠杂交瘤细胞产生，胶体金标记探针为抗原表位不同的特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.9239的小鼠杂交瘤细胞产生，质控线由特异性结合胶体金标记探针的二抗或链球菌G蛋白或金黄色葡萄球菌A蛋白组成。本发明敏感性及特异性高，总的敏感性可达83%，特异性为95%。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种免疫层析试条，具体来说是一种基 于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条。

背景技术

内脏利什曼病或称黑热病，是由杜氏利什曼原虫种团(Leishmania  donovanicomplex)或婴儿利什曼原虫(L.infantum)/恰氏利什曼原虫(L. chagasi)的原虫寄生于人体的淋巴—巨噬细胞系统所引起的一种寄生虫病，由 媒介白蛉叮咬传播。该病在世界范围内流行甚广，包括亚、欧、非及中、南美洲 的61个国家，每年新发生的病例数约有50万。在上世纪60年代以前我国也深受其 害，病例曾达60万，死亡率极高。准确检测感染和诊断是监测工作急需和治疗的 关键所在，因此，对黑热病诊断技术的研究始终受到重视。

以骨髓、脾等穿刺物涂片染色镜检的方法是黑热病最古老的诊断方法，迄今 仍是黑热病诊断的“金标准”。国外报道显示骨髓和淋巴结穿刺物涂片镜检敏感 性分别为60％～75％和30％～50％，国内报道以骨髓、淋巴结、脾穿刺涂片镜检检 出率依次为:80～90％、46～87％、96～98％。由于这种检测方法对操作人员的 技术要求非常高，在疾病诊断与流行病学调查中应用受到限制。

免疫学方法在黑热病诊断上的应用越来越受到重视，常用检测方法有间接血 凝法(Indirect haemagglutination assay；IHA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、酶 联免疫电转移印渍法(Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay ；EITBA),以及金标免疫点印渍法(Gold-labelled dot blotting；GDB；俗称膜法 或渗滤法)。但这些方法或费时费力、或需要冷链系统保存试剂、或对仪器设备 及操作人员的要求较高而不适合现场使用。

发明内容

本发明的目的在于提出一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试 条，所述的这种诊断黑热病的免疫层析试条要解决现有技术中的诊断黑热病的准 确率不高，而且费时费力的技术问题。

本发明提供了一种小鼠杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No.9239。

本发明还提供另外一种小鼠杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No.9240。

本发明还提供了一种可特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单 克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.9240的小鼠杂交瘤细胞产生。

本发明还提供了另外一种抗原表位不同的可特异性结合杜氏利什曼原虫无 鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.9239的小鼠杂交瘤细胞产 生。

本发明还提供了一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条，包括 一个样品垫、一个紧密连接于所述样品垫的含有胶体金标记探针的金标垫、一个 与所述金标垫紧密连接的纤维素膜、一个紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水 垫，所述纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤 维素膜上设置检测线，其中，所述的检测线由特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛 体虫体抗原的单克隆抗体组成，由保藏号为CGMCC No.9240的小鼠杂交瘤细胞产 生，所述的胶体金标记探针为抗原表位不同的特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛 体虫体抗原的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.9239的小鼠杂交瘤细胞产生， 所述的质控线由特异性结合胶体金标记探针的二抗或链球菌G蛋白(SPG)或金黄 色葡萄球菌A蛋白(SPA)组成。

本发明还提供了另外一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条， 包括一个样品垫、一个紧密连接于所述样品垫的含有胶体金标记探针的金标垫、 一个与所述金标垫紧密连接的纤维素膜、一个紧密连接于所述纤维素膜另一端的 吸水垫，所述纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间 的纤维素膜上设置检测线，其中，所述的检测线由特异性结合杜氏利什曼原虫无 鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体组成，由保藏号为CGMCC No.9239的小鼠杂交瘤细 胞产生，所述的胶体金标记探针为抗原表位不同的特异性结合杜氏利什曼原虫无 鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.9240的小鼠杂交瘤细胞产 生所述的质控线由特异性结合胶体金标记探针的二抗或链球菌G蛋白(SPG)或金 黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)组成。

进一步的，所述的质控线由特异性结合胶体金标记探针的羊抗鼠IgG组成。

进一步的，特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体 E3C3的喷涂量为0.1～8μg/cm；胶体金标记探针的特异性结合杜氏利什曼原虫无 鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体A6A2浓度(以蛋白浓度计)：0.2～2mg/20mL；羊 抗鼠IgG的喷涂量为0.1～4μg/cm。

具体的，所述支持检测线和质控线的纤维素膜可为硝酸纤维素膜(NC膜) 或醋酸纤维素膜；所述支持胶体金标记探针的金标垫为玻璃纤维膜或聚脂膜；所 述样品垫可以是滤血膜样品垫，所述的滤血膜是棉籽绒和纤维素的混合物或者玻 璃纤维和纤维素的混合物，适合于全血样品和血清样品；所述样品垫也可以是玻 璃纤维或吸水纸样品垫，适合于血清样品；所述吸水垫由吸水材料制备，如吸水 纸。

具体的，所述纤维素膜宽度控制在2.5～3.0mm；所述吸水垫可宽度为20～ 40mm，所述金标垫的宽度为5～10mm；所述样品垫宽度为20～40mm。

进一步的，所述免疫层析试条背面可设置一个起支撑作用的背板，背板材料 的选择是多种多样的，可以是塑料板，如聚氯乙烯板(PVC)等。

进一步的，可将所述带有背板的免疫层析试条切成3～5mm宽装入一个盒体 中，该盒体对应于滤血膜样品垫的部位设有加样孔，对应于检测线和质控线的部 位设有观测窗，检测样品时将全血或血清加入加样孔中。

利什曼原虫在黑热病患者体内以无鞭毛体的形式存在，检测病人血样中是否 含有利什曼原虫无鞭毛体循环抗原，可以作为病人感染利什曼原虫的指标。

本发明将特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体E3C3 固定在纤维膜上形成检测线，该固相抗原可以捕获受试者血样中相应的杜氏利什 曼原虫循环抗原，在检测线位置形成抗原抗体复合物沉淀。

本发明采用特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体 A6A2作为检测探针，该胶体金标记探针附着于金标垫上。检测过程中，复溶的胶 体金标记探针可与受试者血样中的杜氏利什曼原虫循环抗原，结合，从而当受试 者血样中存在杜氏利什曼原虫循环抗原时在检测线位置形成色带。

本发明将与胶体金标记探针特异性结合的抗体固定在纤维素膜上作为质控 线。胶体金标记探针是特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆小 鼠抗体，相应的，质控线采用羊抗小鼠IgG的抗抗体。无论待检样品中是否含有 杜氏利什曼原虫循环抗原，本发明的诊断黑热病中质控线位置总能形成色带，该 条色带是判定检测过程是否正常和免疫层析试条是否变质的标准。

与胶体金标记探针特异性结合的质控线不限于使用羊抗鼠IgG,也可采用金 黄色葡萄球菌A蛋白(SPA),链球菌G蛋白(SPG)，或者采用其他动物如兔抗鼠IgG 抗体的单抗或多抗，同样能实现本发明的发明目的，这是领域的一般技术人员都 知晓的。

本发明的诊断黑热病的免疫层析试条适用于从亲内脏什曼原虫感染者或黑 热病患者(患畜)体内抽取的全血样品和血清样品。对于全血样品，本发明的诊 断黑热病的免疫层析试条中的样品垫采用滤血膜样品垫；如果仅仅检测血清样 品，本发明的诊断黑热病的免疫层析的免疫层析试条中的样品垫可采用玻璃纤维 或吸水纸样品垫，也可采用滤血膜样品垫。

本发明中的细胞株E3C3，属于小鼠杂交瘤细胞，该菌株保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中科院微生 物研究所)，保藏日期为2014年5月28号，保藏号为CGMCC No：9240。

本发明中的细胞株A6A2，属于小鼠杂交瘤细胞，该菌株保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中科院微生 物研究所)，保藏日期为2014年5月28号，保藏号为CGMCC No：9239。

本发明的免疫层析试条具有以下优点：(1)敏感性及特异性高：实验室考核 结果显示，本发明的免疫层析试条总的敏感性可达83％，特异性为95％；(2)检 测方法简单、快速：检测过程中标本处理简单，血清或全血都可以直接使用，无 需处理，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并 可迅速观察结果，标本中的抗体经5分钟左右的层析后，即可出现肉眼可见的沉 淀线，从而为黑热病人的治疗争取了时间，很适合现场和基层使用；(3)本发明 的免疫层析试条可以同时应用与人、畜和野生动物感染的现场检测，有助于寻找 确定传染源，在疾病预防控制工作中有重要意义；(4)制备方法简单，成本低廉， 易于进行工业化生产。本发明将在诊断黑热病及其相关疾病的诊断和治疗中发挥 重要作用，应用前景广阔。

附图说明

图1、诊断黑热病的免疫层析试条的正面结构示意图。

图2、诊断黑热病的免疫层析试条的纵截面结构示意图。

其中：1为样品垫；2为金标垫；3为纤维素膜；4为吸水垫；5为检测线； 6为质控线；7为背板。

具体实施方式

实施例1 杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的制备

杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原按如下方法制备：取本实验室保种的杜氏 利什曼原虫801(MHOM/CN//801/XJ)在NNN培养基中22℃培养的前鞭毛体接种 于199培养基(PH7.2-7.4)中于22℃扩大培养。前鞭毛体达到一定密度后，离 心收集，转入199培养基(PH5.4)中37℃进行无鞭毛体的转化。将转化的 无鞭毛体40C下3000g离心15分钟收集无鞭毛体，弃上清，沉淀同法用PBS洗 3次后，按前鞭毛体的压积量加4倍体积的PBS，在液氮和37℃水浴中，反复冻 融5次，然后在冰浴中超声粉碎3次，18000g，4℃离心20min，上清即为可溶 性抗原。用按上述方法制备的抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0 瘤细胞融合,获得的能高效分泌特异抗体的杂交瘤细胞经3次克隆后注射小鼠生 产腹水。本发明在采用杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原免疫的小鼠脾细胞与小 鼠骨髓瘤细胞S/P20细胞按常规方法制备杂交瘤时，筛选到两株分泌特异性抗杜 氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原单克隆抗体细胞株：

(1)E3C3(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCC No.9240,保藏日期为2014年5月28日)，该杂交瘤细胞株分泌 的单克隆抗体经鉴定为IgG1型，可以与杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原特异 性结合。

(2)A6A2(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCC No.9239,保藏日期为2014年5月28日)，该杂交瘤细胞株分泌 的单克隆抗体经鉴定为IgG1型，可以与杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原特异 性结合。

实施例2 抗杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原单克隆抗体的制备

免疫：每只BALB/c小鼠首次腹腔注射100μg上述纯化的杜氏利什曼原虫无 鞭毛体可溶性抗原+福氏完全佐剂的混悬液，以后每隔1月注射100μg纯化的杜 氏利什曼原虫无鞭毛体可溶性抗原+福氏不完全佐剂的混悬液1次，共2次，并 于杀鼠取脾进行细胞融合的前3d经尾静脉直接注射抗原加强免疫1次。

杂交瘤细胞的产生与筛选：SP2/0瘤细胞与免疫鼠脾细胞的融合及杂交瘤细 胞的克隆按本领域常规方法进行。以上述纯化的杜氏利什曼原虫无鞭毛体可溶性 抗原和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)蛋白分别包板对杂交瘤细胞培养上清进行常规 ELISA检测抗体分泌以筛选杂交瘤细胞株，对GST和重组融合蛋白均反应的克隆 其分泌的抗体视为针对GST，所以只选择保留仅对杜氏利什曼原虫无鞭毛体可溶 性抗原反应的克隆。

单克隆抗体(McAb)免疫球蛋白亚类鉴定：经浓缩的杂交瘤细胞培养上清液与 羊抗鼠IgG、IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3在1％生理盐水琼脂板上进 行免疫双扩散以鉴定McAb免疫球蛋白亚类。

腹水生产与腹水效价决定：每只BALB/c小鼠腹腔注射5×10⁶杂交瘤细胞，1 周后随时观察并取腹水。以纯化的重组融合蛋白包被酶标板，腹水进行倍比稀释， 第1稀释度为1∶1000，用常规ELISA法确定腹水效价。

免疫印迹实验：取培养杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体和10份四川发热病人 红细胞经处理后进行SDS-PAGE电泳，而后转移至硝酸纤维薄膜上。转移完毕后 硝酸纤维素膜用含5％脱脂奶粉的PBS溶液室温封闭1h，用PBS含 0.5％TritonX-100(PBS-T)洗涤3次，按1∶20000稀释度加入单克隆抗体，4℃ 过夜，用PBS-T洗涤3次，加入用PBS稀释(1∶5000)的辣根过氧化物酶标记的 兔抗鼠抗体室温摇2h，同法洗涤3次，再用PBS洗涤1次，用二氨基联苯胺(DAB) 底物系统(DAB50mg，PBS100ml，30％H₂O₂10μL)显色。

制备得到特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体可溶性抗原的单克隆抗体：

A6A2属于IgG1亚类，与重组抗原反应效价1:51200，用于标记；

E3C3属于IgG1亚类，与重组抗原反应效价1:51200，用于包被；

抗杜氏利什曼原虫无鞭毛体可溶性抗原克隆抗体的纯化：将含抗杜氏利什曼 原虫无鞭毛体可溶性抗原单克隆抗体的小鼠腹水，先使用正辛酸—硫酸铵沉淀法 抽提，然后再用G蛋白层析柱(美国GE公司产品)按产品说明书纯化单克隆抗体。

实施例3 诊断黑热病的免疫层析试条的制备

1.抗杜氏利什曼原虫可溶性抗原的单克隆抗体由实施例2制备所得。

2.羊抗小鼠IgG由购买获得。

3.制备免疫胶体金探针及金标垫

用下述方法制备杜氏利什曼原虫可溶性抗原的单克隆抗体胶体金探针及金标 垫：

1)采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，具体方法为：将HAuCl₄(沪试牌购 于上海国药集团化学试剂有限公司)配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸腾， 搅动下准确加入1.6mL的1％的柠檬酸三钠水溶液，待液体颜色稳定成葡萄酒红 色，得到胶体金溶液。

2)确定胶体金偶联探针饱和浓度

用0.2M K₂CO₃调节步骤1)制备的胶体金溶液的pH值至8.0，准备5支洁净 试管，分别加入1mL胶体金溶液。将步骤1)制备的杜氏利什曼原虫可溶性抗原 的单克隆抗体稀释为1mg/mL，分别向4支试管中加入20μL、25μL、30μL、35μL， 另一支为空白对照，混匀后于室温下放置5分钟，加入10％NaCl水溶液，混匀， 静置10-20分钟后观察液体颜色。胶体金溶液颜色不变时所含最少量即为稳定1mL 胶体金溶液所需蛋白的最适浓度，以此为基础增加20％蛋白量即为胶体金探针饱 和溶液。结果：维持胶体金溶液颜色不变的蛋白量为25μL，即探针浓度为20μg/mL。

3)杜氏利什曼原虫可溶性抗原的单克隆抗体标记的免疫胶体金探针及金标垫 的制备

取50mL胶体金溶液，用0.2M K₂CO₃调节pH值为8.0，按20μg/mL加入已纯 化的杜氏利什曼原虫可溶性抗原的单克隆抗体A6A2，得到免疫胶体金探针溶液 50mL，搅拌15min，再加入终浓度为1％BSA，搅拌15min，10000g离心30min， 弃上清，用10mM HEPES缓冲液洗涤沉淀，并将其保存于10mL含15％蔗糖的10mM  HEPES缓冲液中，得到杜氏利什曼原虫可溶性抗原的单克隆抗体标记的胶体金探 针溶液。取5mL胶体金探针溶液均匀加在玻璃纤维膜上，相对湿度40％下干燥1 小时，得到金标垫。

4、诊断黑热病的免疫层析试条的制备

该试条的制备方法包括以下步骤：

1)NC膜的包被

检测线包被：用0.01M pH7.4 PBS稀释实施例2制备的杜氏利什曼原虫可溶 性抗原单克隆抗体E3C3至终浓度为2mg/mL，用于包被检测线；

质控线的包被：用0.01M pH7.4 PBS稀释羊抗小鼠IgG至终浓度为0.5 mg/mL， 用于包被质控线；

BIODOT公司XZ1000喷膜机将分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜(购 自MILLIPORE公司)上，喷涂量为10μL/cm，形成一条检测线和一条质控线，37 ℃下干燥1小时。

2)诊断黑热病的免疫层析试条的制备

用一块单面涂了不干胶的PVC背板，中间粘贴上处理好的NC膜；NC膜靠近 质控线的一端紧密粘贴吸水垫(购于杰一生物公司)；NC膜靠近质控线的一端紧 密粘贴金标垫；金标垫另一端紧密粘贴滤血膜样品垫(购自杰一生物公司)。得 到诊断黑热病试条母板，切割成4mm宽，加干燥剂后密封保存。

5、诊断黑热病的免疫层析试剂盒的制备

为了方便使用，将步骤4制备的诊断黑热病的免疫层析的免疫层析试条装入 检测盒体中，加干燥剂后密封保存。该检测盒对应于样品垫的部位设有加样孔， 对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。

实施例5 诊断黑热病的免疫层析试条的实验室考核

1、检测方法

于实施例3制备的免疫层析试条的滤血膜样品垫加入待测血清，1分钟后加 入样本稀释液(PBS)1滴(约50μL)，5分钟后开始观察结果，15分钟观察终止。 结果判定：如果检测线5和质控线6均出现红色条带，即判为黑热病；如果仅有 质控线6出现红色条带，即判为阴性；如果质控线不显色，即表明试条失效。

1)实验结果

用本发明实施例3制备的诊断黑热病的免疫层析的免疫层析试条进行实验 室考核结果如表2所示。由表2可以看出本发明的免疫层析试纸的敏感性可达 82.9％，特异性可达95.3％。上述检测结果表明本发明的免疫层析试条可用于黑 热病的快速检测。

表2本发明诊断黑热病的实验室考核结果

血清来源 试验例数 阳性例数(P％) 黑热病 35 29(82.9％) 健康人 86 4(4.7％) 囊虫病 10 0 血吸虫病 5 0 弓形虫病 5 0 肺吸虫病 5 0 肝吸虫病 5 0 包虫病 20 1(5％) 疟疾 20 1(5％)

用本发明实施例3制备的诊断黑热病的免疫层析的免疫层析试条进行实验 室考核，结果与表2所示结果没有统计学差异。

实施例6

诊断黑热病的免疫层析试条的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备检测线抗体溶液：用10mM pH7.4的PBS将特异性结合杜氏利什曼 原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体E3C3浓度调整为2.0mg/mL；

制备标记探针溶液：向100mL pH8.0、HAuCl₄含量为0.01％的胶体金溶液中 加入终浓度为20μg/mL特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆 抗体A6A2，再加入终浓度为1％的BSA，离心弃上清，沉淀复溶到36mL的10mM HEPES 缓冲液中；

制备质控线蛋白溶液：将羊抗鼠IgG或链球菌G蛋白或或金黄色葡萄球菌 A蛋白用10mM pH7.4的PBS缓冲液稀释到0.5mg/mL；

在一个优选的方案中，将羊抗鼠IgG10mM pH7.4的PBS缓冲液稀释到 0.5mg/mL。

(2)将制备的检测线抗体溶液形成检测线，将制备质控线蛋白溶液喷到所 述纤维素膜的另一区域形成质控线；

将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入胶体金标记探针溶液，制备金标垫；

在一个优选的方案中，将制备的检测线抗体溶液喷到所述纤维素膜Y＝9mm处 形成检测线，将制备质控线蛋白溶液喷到所述纤维素膜的Y＝17mm处形成质控线；

在一个优选的方案中，将8mm*300mm的玻璃纤维膜浸入胶体金标记探针溶 液，制备金标垫；

(3)将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离检测线的一端，将金标垫粘贴在 纤维素膜的靠近检测线的一端，将样品垫粘贴于金标垫上与所述纤维素膜相对的 一端，得到诊断黑热病的试条母板。

在一个优选的方案中，上述纤维素膜在喷有检测线、质控线后，先在相对湿 度40％下干燥2小时，再粘贴吸水垫。

在一个优选的方案中，为使胶体金标记探针溶液与玻璃纤维膜更好地结合， 可向胶体金标记探针溶液中添加15％的蔗糖；为使金标垫更易于纤维素膜粘贴， 可将金标垫在相对湿度40％下干燥1小时，再与纤维素膜粘贴。

免疫层析试条：图1为诊断黑热病的免疫层析的免疫层析试条的正面结构 图，图2为的纵截面结构图。诊断黑热病由吸水垫4、硝酸纤维素膜(NC膜)3、 金标垫2和滤血样品垫1四部分粘贴在PVC底板7上组成；硝酸纤维素膜3上设 有检测线5和质控线6。

检测原理与结果判断：测定时将样本血清或全血加在滤血膜样品垫1上，1 分钟后滴一滴(约50μL)样本稀释液，稀释液带动样品按样品垫1、金标垫2、 硝酸纤维素膜3、吸水垫4的方向移动，流经金标垫2时使金标垫2上的胶体金 标记探针复溶，并带动其向硝酸纤维素膜3、吸水垫4移动。胶体金标记探针可 (本发明实施例为单克隆抗体A6A2)与样品中的杜氏利什曼原虫无鞭毛体循环抗 原结合，形成免疫复合物。此免疫复合物流至检测线5时，若标本中有杜氏利什 曼原虫无鞭毛体循环抗原，即被检测线5的特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体 虫体抗原的单克隆抗体(本发明实施例为单克隆抗体E3C3)所捕获，在硝酸纤维 素膜3上的检测线5位置显出红色检测线条；此免疫复合物流经质控线6时，即 被质控线6的固相抗体(本发明实施例为羊抗小鼠IgG)所捕获，在硝酸纤维素 膜3上的质控线6位置显出红色质控线条。

阳性标本既显示检测线，又显示质控线；阴性标本没有检测线，仅显示质 控线；如果质控线没有显示，则表示试条失效。

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中所用方法如无特别说明均为 常规方法；所述百分含量如无特别说明均为质量/体积百分含量或体积/体积百分 含量。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本 发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上， 除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握 对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。