母乳脂肪酸谱数据库的建立方法

摘要

本发明公开了一种母乳脂肪酸谱数据库的建立方法，包括以下步骤：取多个母乳样品；将每个母乳样品与甲醇进行酯化反应，反应完成后，将反应液离心，取上层有机相；将所述有机相注入SPE固相萃取小柱，用洗脱液淋洗SPE同相萃取小柱，收集流出液，N

说明书

技术领域

本发明涉及脂肪酸含量测定领域，尤其涉及一种母乳脂肪酸谱数据库 的建立方法。

背景技术

母乳是婴儿成长唯一最自然、最安全、最完整的天然食物，其营养丰 富，含有婴儿成长所需的碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质和 抗体等物质，易于吸收和利用，能够保证婴儿的健康成长。特别是，母乳 中含有的百分之五十的脂肪，除了能够提供婴儿身体日常消耗的热量外， 还能满足婴儿脑部发育所需的脂肪。母乳可提供婴儿自身体内不能合成的 必需脂肪酸(essential fatty acid，EFA)，如亚油酸(linoleic acid，LA)和α- 亚麻酸(linoleic acid，LNA)以及一些长链多不饱和脂肪酸(long chain  polyunsaturated fatty acid，LC PUFA)，如花生四烯酸(arochidonic acid，AA) 和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)，它们对于婴儿的生长发育 有着重要的意义，尤其是后者对婴儿中枢神经系统发育的作用越来越引起 人们的重视。

然而，母乳中的微量和常量营养素是会随着哺乳的进行以及乳母饮食 改变而发生变动的，母乳中的某些脂肪酸如二十二碳六烯酸(DHA)等会随 乳母饮食的变化而变化。母亲饮食中补充鱼油或DHA能够使母乳中的 DHA含量显著升高，母乳中的其它脂肪酸成分也都受到了不同程度的膳 食影响。

我国目前所有的婴儿配方奶粉都是模仿西方大品牌的产品配制的。不 同民族不同饮食方式的人群对食物的应答不同，不同国家哺乳妇女由于遗 传背景和饮食状况的不同，母乳中部分成分也不相同，如脂肪酸成分与含 量就有着显著的不同，即使在同一个国家，不同地区由于环境和饮食习惯 的不同，母乳脂肪酸成分及含量同样存在较大的差异。对婴儿而言，如果 母亲由于种种原因不能用母乳喂养婴儿，那么一种与母乳成分相同的配方 奶粉是最安全、最健康、最理想的选择。

在中国人群中，尚没有建立母乳脂肪酸谱数据库的快速、准确测定的 方法，建立此方法对于构建不同地区人群的母乳脂肪酸谱数据库，了解中 国不同地区人群母乳的特点和哺乳期母乳脂肪酸的变化特征，指导我国企 业以母乳脂肪酸谱数据库为基础，生产出真正的适合中国婴儿的配方奶粉 具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种能够实现母乳脂肪酸含量快速、准确测定，建立母 乳脂肪酸谱数据库的方法。

为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案是：

一种母乳脂肪酸谱数据库的建立方法，包括以下步骤：

(1)取多个母乳样品；

(2)将每个母乳样品与甲醇进行酯化反应，反应完成后，将反应液 离心，取上层有机相；

(3)将所述有机相注入SPE同相萃取小柱，用洗脱液淋洗SPE固相 萃取小柱，收集流出液，N₂吹干，获得纯化的脂肪酸甲酯；

(4)利用气相色谱采集脂肪酸甲酯图谱，采用归一法计算得到母乳 样品中各类脂肪酸的含量；

(5)建立母乳脂肪酸谱数据库。

所述酯化反应包括：将母乳样品、甲醇/苯溶液混合均匀，加入乙酰氯， 水浴加热反应，反应完成后加入可溶性碳酸盐，中和混合液。

所述母乳样品、甲醇、苯和乙酰氯的体积比为：1∶16∶4∶2。

所述水浴加热反应的温度为80～100℃，时间为1～2小时。

所述SPE固相萃取小柱为聚酰胺柱，柱容量为500mg。

所述洗脱液为乙醚-正己烷。

所述气相色谱采用安捷伦DB-23色谱柱。

所述气相色谱采集脂肪酸甲酯图谱的分析条件为：进样口温度： 270℃，进样体积：2μL，检测器温度：270℃，载气：N₂，流速：2.30mL/min， 气体配比：氮气∶氢气∶空气为20∶7∶5，柱温：140℃，柱温升温程序：140℃， 保持2min，以10℃/min升至160℃，保持2min；以10℃/min升至220℃， 保持4min；以10℃/min升至240℃，保持6min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)传统方法需对样品进行24小时浸提，并且需通过过滤与旋转蒸 发获得脂肪酸才能进行甲酯化，而本发明方法只需采用甲酯化的一步法即 可完成测定，无需浸提。本发明提供的母乳脂肪酸测定方法与传统甲醇/ 氯仿测定法相比，能够缩短测定时间，减少试剂消耗。此外，本发明方法 无需使用氯仿，可以避免其对人体造成的损害。

(2)本发明提供的母乳脂肪酸的甲酯化法以及脂肪酸甲酯的纯化和 色谱检测方法，能够快速、准确地测定母乳脂肪酸的含量，了解不同人群 哺乳期母乳脂肪酸种类和含量的变化特征，从而建立母乳脂肪酸谱数据 库，指导我国企业生产出真正适合中国婴儿的配方奶粉。

附图说明

图1为31种脂肪酸混合标样的GC分析结果图；

图2为采用本发明方法获得的初乳中脂肪酸的GC分析结果图；

图3为采用本发明方法获得的二周乳中脂脂肪酸的GC分析结果图；

图4为采用本发明方法获得的六周乳中脂肪酸的GC分析结果图；

图5为本发明方法与传统方法测定脂肪酸含量的差异比较；

图6为采用本发明方法获得的不同哺乳时期母乳脂肪酸含量及比例；

SFA：饱和脂肪酸；MUFA：单不饱和脂肪酸；PUFA：多不饱和脂肪 酸；n-3PUFA：n-3多不饱和脂肪酸；n-6PUFA：n-6多不饱和脂肪酸脂 肪酸。

具体实施方式

实施例1

一、母乳的采集

选择提供母乳的产妇标准为：年龄20-40岁，身体健康，不抽烟，刚 生育单胞胎，且产后第一个月全母乳喂养。采集样本前收集产妇的24小 时饮食调查问卷，包括产妇的身高、体重、血压等数据。分别在兰州、北 京、杭州地区的城市和农村征集50名产妇，并收集其初乳、二周乳、六 周乳，用于母乳脂肪酸的测定。

母乳总样本数为1234例，其中初乳477例，二周乳385例，六周乳 372例。杭州地区样本总数为518例，其中初乳202例，二周乳166例， 六周乳150例；北京地区样本总数为332例，其中初乳133例，二周乳93 例，六周乳106例；兰州地区样本总数为384例，其中初乳142例，二周 乳126例，六周乳116例。

产妇母乳取量为30mL，分装于1.5mL冻存管中，于-40～-80℃储存 待用。可采用常温下解冻、流水解冻或冰浴下摇床震荡解冻的方法从冻存 管中提取母乳。

二、母乳样品的甲酯化

采用乙酰氯-甲醇甲酯化法进行母乳脂肪酸的甲酯化，并提取和纯化 母乳脂肪酸甲酯物。甲酯化后得到的产物是不同脂肪酸甲酯，此处统称为 脂肪酸甲酯。

具体步骤如下：

(1)向10mL体积的螺口试管中加入100μL母乳和2.0mL的4∶1(v/v) 甲醇∶苯混合溶液，充分混匀后，缓慢加入0.2mL乙酰氯，边加边摇匀。 再以Teflon膜作内衬，旋紧试管螺旋盖，将试管置于100℃水浴保温1小 时，每隔20min进行震荡摇匀，加速脂肪酸的甲酯化。水浴结束后，将 试管置于室温放置，待其冷却。

(2)向已冷却的试管中加入5mL6％的碳酸钾摇匀，速度不宜过快， 以免液体随气泡溢出。试管在3000r/min条件下离心10分钟。将上层有 机相用玻璃吸管小心吸出至事先放有2mL蒸馏水的圆底试管中，振荡混 匀，静置分层后，再将上层有机相转移至事先装有少量(约100～200mg) 无水Na₂SO₄的尖头离心管中。将上层有机相移入尖头离心管后，轻轻振 荡，若发现其中的无水Na₂SO₄可以跳动，证明没有水分掺杂。再将上层 有机相转移至一个具塞试管中。

如果无水Na₂SO₄不能跳动，说明有水分掺杂在脂肪酸甲酯中，这需 要重新进行静置分层，吸取上层有机相，直至振荡试管时，无水Na₂SO₄可以跳动。

(3)采用带有聚酰胺填料、柱容为500mg的SPE固相萃取小柱进行 脂肪酸甲酯的纯化。具体过程为：将2mL正己烷快速过(2～5s过完)SPE 固相萃取小柱，再将带纯化样品快速过柱(2～5s过完)。用正己烷清洗具 塞试管两次，两次的用量分别为2mL和1mL，之后快速过柱。然后，用 3mL5％乙醚-正己烷溶液缓慢清洗SPE固相萃取小柱，液体成滴收集到 具塞试管中，并在38℃水浴下N₂吹干，得到相应的脂肪酸甲酯。最后， 先用3mL体积比为2∶1的氯仿∶甲醇溶液，再用3mL正己烷慢速清洗柱 子，冲洗速度为成滴滴下。母乳脂肪酸甲酯纯化中的正己烷可以由石油醚 代替。

三、母乳脂肪酸甲酯成分的测定

用100μL正己烷重新融解N₂吹干的脂肪酸甲酯，并至于样品瓶中， 取2μL样品进样，利用岛津气相色谱仪(GC-14C型)安捷伦DB-23色谱 柱测定样品的脂肪酸成分。

分析条件为：进样口温度270℃，进样体积：2μL，检测器温度：270℃， 载气：N₂，流速：2.30mL/min，气体配比：氮气∶氢气∶空气比为：20∶7∶5， 柱温：140℃，柱温升温程序：140℃，保持2min，以10℃/min升至160℃， 保持2min；以10℃/min升至220℃，保持4min；以10℃/min升至240℃， 保持6min。

四、脂肪酸甲酯图谱分析和SPSS数据统计分析

采用GC-14C型气相色谱仪测定脂肪酸，用杭州英谱科技开发有限公 司HS色谱数据工作站V4.0采集谱图，并处理分析所采集的谱图数据。色 谱峰采用混合的脂肪酸甲酯标样(Sigma)来进行鉴定。

谱图采集处理采用对比标准品保留时间的方法定性，即根据相对保留 值定性；采用面积法定量，即运用面积归一法求各色谱峰面积，能够简便、 准确地计算母乳中脂肪酸的含量。

采用SPSS软件进行数据统计分析，并采用独立样本t检验方法，将 置信区间设置为95％，显著性用p值表示，若p＜0.05则认为有显著性差 异。

五、不同测定方法下母乳脂肪酸含量的差异

取10份母乳样品，分别采用本发明方法利传统甲醇/氯仿测定法测定 母乳中各类脂肪酸的含量，比较两种测定方法下母乳脂肪酸含量的差异。

由图5可知，两种方法测定的母乳脂肪酸的含量无显著性差异(P＞ 0.05)。而本发明方法在脂肪酸甲酯化过程中无需浸提样品，缩短了测定时 间，说明本发明方法用于母乳脂肪酸含量的测定优于传统测定方法。

六、不同哺乳期母乳样品脂肪酸含量的测定

将所有采集的不同哺乳期母乳样品进行脂肪酸含量的测定，并通过 SPSS软件统计分析不同哺乳时期母乳中脂肪酸含量的变化情况。

由图6可知，随着哺乳时期的变化，除C14:1n-5、C17:0、C18:2n-6、 C18:3n-3、C20:1n-9、C20:5n-3、C22:5n-3及总PUFA在母乳中的含量无 显著性变化外，其他脂肪酸的含量在不同哺乳时期间都存在显著性差异。

综上所述，本发明能够提供快速、准确的母乳脂肪酸测定方法并建立 母乳脂肪酸谱数据库。可通过对该母乳脂肪酸数据库的研究，为企业生产 适合中国婴儿发育的配方奶粉提供技术支持。