一种促进成骨细胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面处理方法

摘要

本发明属于生物医用钛合金表面制备技术领域，首次将喷砂/酸蚀的表面处理工艺应用于Ti6Al7Nb表面的处理方法，发明出一种促进成骨细胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面处理方法。喷砂酸蚀后Ti6Al7Nb表面在微米级的孔洞中偶尔可见纳米级孔洞位于其中，增加了表面的多孔形态；促进成骨细胞在样品表面的增殖、黏附，促进成骨细胞分化；喷砂与酸蚀工艺均不需要高温、高压环境，设备简单，操作步骤简单易行。

说明书

技术领域

本发明属于生物医用钛合金表面制备技术领域，主要涉及的是一种促进 Ti6Al7Nb合金表面成骨细胞增殖、黏附和分化的表面处理方法。

背景技术

商业纯钛及钛合金的发展先后经过了以纯钛和Ti6Al4V为代表的第一个 时代，以Ti5Al2.5Fe和Ti6Al7Nb为代表的第二个时代。随着钛及钛合金在临床 应用的增加，在临床应用中的弊端也逐渐显露，如：纯钛的强度较低，耐磨性 较差；Ti6Al4V具有较高的硬度、良好的表面性能、优越的微观结构，耐磨性优 于2、3级纯钛，但是存在与周围组织结合不佳以及缓慢释放合金中的V、Al 等有潜在毒性的物质。种植体植入人体后，与骨组织最理想的结合方式为材料 与骨组织在分子水平的化学键合，即骨键结合，又称生物活性结合，是在临床 意义下的植入体与骨组织之间无软组织中介的、光学显微镜水平下的直接接触， 其应力传递是连续的，也是需长期存在体内的植入物的最佳结合模式。

近年来材料表面工艺制备理论及技术不断完善和发展，目前，钛合金种 植体表面改性的方法达几十种，有些已经成功应用于临床，如表面加成法(钛 浆涂层、羟基磷灰石涂层)和表面减少法(喷砂/酸蚀、可吸收性研磨介质)，有 些正处于研究阶段，如表面轰击法和表面氧化法。每种表面处理方法因其原料 与工艺不同表现出不同的优缺点，如羟基磷灰石(HA)涂层可以明显促进种植 体周围成骨，但是存在结合强度不够，涂层剥脱的问题；阳极氧化使钛氧化层 表面的分子黏合能力高并具有亲骨性，但是阳极氧化法所形成的氧化膜与钛基 体结合强度仍然有待进一步提高。喷砂/酸蚀复合处理是目前商业用钛种植体最 广泛采用的处理方法，钛基种植体喷砂/酸蚀复合处理后粗糙多孔的表面有利于 引导成骨细胞趋化，加速骨结合，增强了种植体的抗扭矩的性能，其优越性已 经通过临床实践证实。

发明内容

本发明针对上述技术内容的缺陷，首次将喷砂/酸蚀的表面处理工艺应用 于Ti6Al7Nb表面的处理方法，发明出一种促进成骨细胞增殖、黏附和分化的 Ti6Al7Nb表面处理方法。

本发明采取的技术方案：

第一步进行预处理：将Ti6Al7Nb棒材切割成为Φ10mm×10mm的圆柱 形试块，用分析纯丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗各15分钟，然后选取一 个平整的底面，在自动旋转打磨仪上，依次用400#、600#、1200#的防水SiC砂 纸将选取的平面逐级打磨，直到获得划痕均匀一致的光滑表面，然后用无水乙 醇超声波清洗15分钟，将经过打磨后的Ti6Al7Nb烘干后，放入干燥箱内以室 温保存待用；

第二步进行喷砂处理：将吸入式干喷砂机固定在台虎钳上，喷砂介质为 白刚玉砂，粒度为60#，尺寸约为250-300μm，将Ti6Al7Nb固定在平口钳上， 使吸入式干喷砂机的枪头和Ti6Al7Nb表面保持一定的距离，喷射角度选择75°， 将喷砂机的气压调至为0.3MPa气压，对Ti6Al7Nb表面进行喷砂处理，喷砂时 间30秒，然后将喷砂处理后的Ti6Al7Nb用去离子水冲洗，再用无水乙醇和去 离子水各超声清洗10分钟，烘干，得到喷砂处理的Ti6Al7Nb；

第三步进行酸蚀处理：先将盐酸(HCl)、硫酸(H₂SO₄)和水(H₂O)体 积比按2：12：11的比例混合，配制溶液过程中注意密封处理以防止盐酸HCl 的挥发，然后将配好的酸蚀溶液加热至沸腾状态，保持温度不变；再将Ti6Al7Nb 置于温度为50℃的蒸馏水中保温2分钟；然后置于加热的酸蚀溶液中，当将 Ti6Al7Nb放入酸蚀溶液初期时，Ti6Al7Nb表面会有气泡产生，随着酸蚀时间的 不断增加，Ti6Al7Nb表面产生的气泡越来越多，并且观察到酸蚀溶液由无色变 成紫色；

第四步进行清洗处理：将酸蚀处理后的Ti6Al7Nb用去离子水超声清洗10 分钟，烘干，得到酸蚀出来的Ti6Al7Nb；

第五步细胞增殖：调整细胞密度为1×10⁵cells/ml，每个钛片表面接种1 ×10⁴cells/disc，100ul培养基，接种4h后每孔补加1ml完全培养基，37℃，孵 育1天、3天、5天，弃旧培养基，每孔添加50ul MTT与450ul的无血清培养 基的混合液，MTT浓度5mg/ml，37℃孵育4小时，弃培养基，每孔加750ul  DMSO，吹打使结晶溶解后，37℃孵育10分钟，将溶解液转移至96孔板中每孔 100ul(约每孔转移96孔板中的6个孔)，测OD值(490nm、570nm)；

第六步细胞在Ti-6Al-7Nb表面黏附形态：消化细胞，制备细胞悬液，计 数，调整细胞浓度为5×10⁴cells/ml，将调整好的细胞轻缓的接种到每个钛片表 面，尽量不要溢出周边，每个钛片接5000个cells，100ul培养基(每接种一个 钛片前都要将细胞吹打均匀)，2小时后，每孔补加500ul完全培养基(沿壁缓 慢滴加)，待3天后2.5％戊二醛4℃固定4小时，弃戊二醛，无水乙醇梯度脱水 50％、70％、90％、100％，两次，每个梯度脱水30分钟，完全干燥后送检，喷 金；

第七步成骨细胞在Ti-6Al-7Nb表面黏附：消化细胞，制备细胞悬液，计 数浓度调整至1×10⁵cells/ml，每个钛片表面接种1×10⁴cells，100ul培养基，待 4小时后每孔添加1ml完全培养基，待12小时、24小时、48小时后去除旧培养 基，PBS冲洗三次，每孔加500ul染色剂calcein-AM1mmol/l，37℃下孵育15 分钟；

第八步成骨细胞在Ti-6Al-7Nb表面分化：消化细胞，制备细胞悬液，计 数调整细胞密度为6×10⁴cells/ml，每个钛片表面接种6000cells/disc，100ul培 养基，每组3个样品，待4小时后补加全培养基2ml/每孔，37℃孵育1天、7 天，待1天、7天后将钛片表面的细胞用0.25％的胰酶消化2-3分钟，加培养基 终止消化，用移液器轻轻吹打，将所有液体转移至离心管中，然后1500r/min，5 分钟，弃上清，留沉淀细胞，再加入1ml PBS轻轻吹打，再次离心1500r/min， 5分钟，弃上清，留沉淀细胞，在沉淀细胞中加入0.4ml PBS轻轻吹打，超声破 碎，将离心管置于超声水浴锅中每3-5秒，超声一次，间隔4次，每次间隔时间 30秒左右，去100μl细胞破碎悬液，置于酶标板上测量520nm波长下的OD值。

有益效果：喷砂酸蚀后Ti6Al7Nb表面在微米级的孔洞中偶尔可见纳米级 孔洞位于其中，增加了表面的多孔形态；微米级多孔表面促进成骨细胞在样品 表面的增殖、黏附，促进成骨细胞分化；喷砂与酸蚀工艺均不需要高温、高压 环境，设备简单，操作步骤简单易行。

附图说明

图1Ti6Al7Nb预处理后表面形貌

图2Ti6Al7Nb打磨和喷砂酸蚀之后样品形貌

图3Ti6Al7Nb喷砂酸蚀后的表面形貌

图4成骨细胞在Ti6Al7Nb表面的增殖，TA1:纯Ti，TC20：Ti6Al7Ni，SLA： 喷砂酸蚀处理，Polishing:光滑表面(**P<0.01)

图5成骨细胞在纯Ti和Ti6Al7Ni表面黏附的形态，(a)Ti×500, (b)Ti6Al7Ni×500,(c)Ti×1000,(d)Ti6Al7Ni×1000,(e)Ti×2000, (f)Ti6Al7Ni×2000,(g)Ti×3000,(h)Ti6Al7Ni×3000

图6成骨细胞在Ti6Al7Nb表面黏附的数量，(a)Ti,(b)Ti6Al7Ni

图7成骨细胞在样品表面生长时的碱性磷酸酶的OD值，TA1:纯Ti， TC20Ti6Al7Ni，SLA：喷砂酸蚀处理，Polishing:光滑表面(**P<0.01)

具体实施方式

本发明结合附图1、附图2、附图3、附图4、附图5、附图6、附图7进 行实施例中所述的一种促进成骨细胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面处理方 法，本发明采取的技术方案：

第一步进行预处理：将Ti6Al7Nb棒材切割成为Φ10mm×10mm的圆柱 形试块，用分析纯丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗各15min，然后选取一 个平整的底面，在自动旋转打磨仪上，依次用400#、600#、1200#的防水SiC砂 纸将选取的平面逐级打磨，直到获得划痕均匀一致的光滑表面，然后用无水乙 醇超声波清洗15分钟，将经过打磨后的Ti6Al7Nb烘干后，放入干燥箱内以室 温保存待用，如图1；

第二步进行喷砂处理：将吸入式干喷砂机固定在台虎钳上，喷砂介质为 白刚玉砂，粒度为60#，尺寸约为250-300μm，将Ti6Al7Nb固定在平口钳上， 使吸入式干喷砂机的枪头和Ti6Al7Nb表面保持一定的距离，喷射角度选择75°， 将喷砂机的气压调至为0.3MPa气压，对Ti6Al7Nb表面进行喷砂处理，喷砂时 间30秒，然后将喷砂处理后的Ti6Al7Nb用去离子水冲洗，再用无水乙醇和去 离子水各超声清洗10分钟，烘干，得到喷砂处理的Ti6Al7Nb；

第三步进行酸蚀处理：先将盐酸(HCl)、硫酸(H₂SO₄)和水(H₂O)按 体积比2：12：11的比例混合，配制溶液过程中注意密封处理以防止HCl的挥 发，然后将配好的酸蚀溶液加热至沸腾状态，保持温度不变；再将Ti6Al7Nb置 于温度为50℃的蒸馏水中保温2分钟；然后置于加热的酸蚀溶液中，当将 Ti6Al7Nb放入酸蚀溶液初期时，Ti6Al7Nb表面会有气泡产生，随着酸蚀时间的 不断增加，Ti6Al7Nb表面产生的气泡越来越多，并且观察到酸蚀溶液由无色变 成紫色，如图2、图3；

第四步进行清洗处理：将酸蚀处理后的Ti6Al7Nb用去离子水超声清洗10 分钟，烘干，得到酸蚀出来的Ti6Al7Nb；

第五步成骨细胞增殖：调整细胞密度为1×10⁵cells/ml，每个钛片表面接 种1×10⁴cells/disc，100ul培养基，接种4小时后每孔补加1ml完全培养基，37℃， 孵育1天、3天、5天，弃旧培养基，每孔添加50ul MTT与450ul的无血清培 养基的混合液，MTT浓度5mg/ml，37℃孵育4小时，弃培养基，每孔加750ul  DMSO，吹打使结晶溶解后，37℃孵育10分钟，将溶解液转移至96孔板中每孔 100ul(约每孔转移96孔板中的6个孔)，测OD值(490nm、570nm)，如图4；

第六步成骨细胞在Ti-6Al-7Nb表面黏附形态：消化细胞，制备细胞悬液， 计数，调整细胞浓度为5×10⁴cells/ml，将调整好的细胞轻缓的接种到每个钛片 表面，尽量不要溢出周边，每个钛片接5000个cells，100ul培养基(每接种一 个钛片前都要将细胞吹打均匀)，2小时后，每孔补加500ul完全培养基(沿壁 缓慢滴加)，待3天后2.5％戊二醛4℃固定4小时，弃戊二醛，无水乙醇梯度脱 水50％、70％、90％、100％，两次，每个梯度脱水30分钟，完全干燥后送检， 喷金，如图5；

第七步观察成骨细胞在Ti-6Al-7Nb表面黏附：消化细胞，制备细胞悬液， 计数浓度调整至1×10⁵cells/ml，每个钛片表面接种1×10⁴cells，100ul培养基， 待4小时后每孔添加1ml完全培养基，待12小时、24小时、48小时后去除旧 培养基，PBS冲洗三次，每孔加500ul染色剂calcein-AM1mmol/l，37℃下孵 育15分钟，如图6；

第八步成骨细胞在Ti-6Al-7Nb表面分化：消化细胞，制备细胞悬液，计 数调整细胞密度为6×10⁴cells/ml，每个钛片表面接种6000cells/disc，100ul培 养基，每组3个样品，待4小时后补加全培养基2ml/每孔，37℃孵育1天、7 天，待1天、7天后将钛片表面的细胞用0.25％的胰酶消化2-3分钟，加培养基 终止消化，用移液器轻轻吹打，将所有液体转移至离心管中，然后1500r/min，5 分钟，弃上清，留沉淀细胞，再加入1ml PBS轻轻吹打，再次离心1500r/min， 5分钟，弃上清，留沉淀细胞，在沉淀细胞中加入0.4ml PBS轻轻吹打，超声破 碎，将离心管置于超声水浴锅中每3-5秒，超声一次，间隔4次，每次间隔时间 30秒左右，去100μl细胞破碎悬液，置于酶标板上测量520nm波长下的OD值， 如图7。