动物源细菌的酰胺醇类药物耐药基因四重PCR检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种动物源细菌的酰胺醇类药物耐药基因四重PCR检测试剂盒。本发明提供了检测细菌对酰胺醇类药物耐药性的引物组，由引物对1、引物对2、引物对3和引物对4组成；本发明的实验证明，本发明根据细菌中主要的4个酰胺醇类药物耐药基因（cfr、fexA、fexB、floR）的核苷酸序列设计合成4对相应的特异性PCR引物，利用四重PCR对待检测细菌中酰胺醇类药物耐药基因进行扩增，具有高效、快速、成本低、实用性强等特点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及动物源细菌的酰胺醇类药物耐药基因四重 PCR检测试剂盒。

背景技术

抗生素药物在控制人类和动物传染性疫病以及降低传染病发病率和死亡率方面 起到了关键性作用。但随着动物饲养的集约化程度的逐渐提高，用药量不断增大，使 得细菌耐药性产生和传播更加迅速，从而为细菌性疾病的治疗带来了极大的挑战。目 前细菌耐药性问题已成为全球范围内临床用药、新型药物研究开发等领域最为热点的 问题之一。

酰胺醇类药物包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，此类药物因其抗菌谱广、吸收 快、体内分布广泛在兽医临床上发挥着举足轻重的作用。酰胺醇类药物作用机制主要 是通过与50S亚基结合，阻断肽酰转移酶的作用，干扰带有氨基酸的氨基酰-tRNA终 端与50S亚基结合，从而使新肽链形成受阻，抑制蛋白质合成。

随着对氯霉素和甲砜霉素的潜在毒性、残留和耐药性的研究的深入，包括中国在 内的许多国家已陆续禁止其在兽医临床上的应用。20世纪90年代，美国先灵-葆雅公 司研制的新合成酰胺醇类广谱抗生素投入市场，结构的改造与修饰使得氟苯尼考在安 全性和有效性方面比氯霉素和甲砜霉素有着明显的优势，主要用于治疗牛、猪、禽及 鱼类的细菌性疾病（大肠埃希氏菌、克雷伯氏杆菌、溶血性巴氏杆菌、多杀性巴氏杆 菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、胸膜肺炎放线杆菌及伤寒沙门氏菌等）。1999 年4月氟苯尼考在我国批准上市，广泛应用于畜禽养殖业，逐渐成为应用最广泛的兽 用抗生素之一。但随着用药的增多，临床上对氟苯尼考耐药的菌株也不断出现，这势 必给临床治疗带来严重威胁。

细菌耐药性检测对于指导临床精确用药，及时诊断治疗具有重要的意义。传统的 耐药检测是用纸片扩散法（K-B法）、MIC稀释法和E试验来检测细菌耐药的表型，虽 然该方法能够直观的观察到细菌对某种药物的敏感和耐药，但首先需要对细菌进行分 离培养和纯化，并且操作繁琐、经验依赖性强、耗时较长，远远不能够满足临床快速 诊断和治疗的需要。同时，由于传统的方法是在体外人为条件下对基因型的表达型进 行检测，因此对其产生影响的不确定因素较多，且仅能检测细菌的表型耐药特性，不 能检测其隐型耐药性。

随着越来越多的分子生物学技术被应用于耐药性的检测，不仅为临床耐药性检测 提供了快速敏感且更加可靠的方法，同时也在解释耐药机制方面起着关键作用，为开 展动物源病原菌耐药性监测与流行病学研究以及新型抗生素的开发研制提供了重要的 科学依据。起初，常规的PCR技术结合探针鉴定或电泳分析对单个耐药基因的检测上 发挥了重要的作用。但在临床上，即使是同一类抗生素的耐药也可能是由于不同的机 制，即使是同一种机制也可能是由不同的耐药基因引起的，并且由于一些耐药基因的 可转移性，临床菌株显示出越来越多的多重耐药，而传统的单重PCR由于检测指标单 一，远不能满足临床检测的要求，因此，多重PCR应运而生，实现了多目标的检测。

多重PCR技术是在反应体系中加入多对引物进行PCR反应，同时扩增一份样本中 的不同DNA序列区域，一次反应能够富集多个目的基因片段，并根据电泳结果中不同 长度片段是否存在来判定是否含有目的基因。多重PCR因其高特异性、高效率、低成 本的优势，已被应用于生命科学的各个领域。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测或辅助检测细菌中耐药基因的引物组。

本发明提供的检测或辅助检测细菌中耐药基因的引物组，由引物对1、引物对2、 引物对3和引物对4组成；

所述引物对1由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单 链DNA分子组成；

所述引物对2由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单 链DNA分子组成；

所述引物对3由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单 链DNA分子组成；

所述引物对4由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单 链DNA分子组成。

上述引物组中，所述引物组中各条引物均为等摩尔比；

所述耐药为耐酰胺醇类药物；所述酰胺醇类药物具体为氟苯尼考或氯霉素；

所述耐药基因为floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一种。

本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测细菌中耐药基因的PCR试剂。

本发明提供的PCR试剂，由上述的引物组、PCR扩增缓冲液和水组成；

所述引物组中的4种引物对中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为0.2μ mol/L；

所述耐药为耐酰胺醇类药物；所述酰胺醇类药物具体为氟苯尼考或氯霉素；

所述耐药基因具体为floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一种。

上述PCR扩增缓冲液为Premix Ex Taq溶液，购自Takara公司Code:D335A， 其各组分及浓度为1.25U/25μl的Taq聚合酶、浓度均为0.4mmol/L的dNTP、浓 度为4mmol/L的Mg²⁺。

本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助检测细菌中耐药基因的PCR试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述PCR试剂；所述耐药为耐酰胺醇 类药物；所述酰胺醇类药物具体为氟苯尼考或氯霉素；

所述耐药基因具体为floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一种。

上述的引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测和/或辅助检测待测细菌是否 含有耐药基因中的应用；

或上述的引物组或上述PCR试剂在制备检测和/或辅助检测待测细菌是否含有耐 药基因产品中的应用；

或上述的引物组或上述PCR试剂在制备检测和/或辅助检测待测细菌是否耐酰胺 醇类药物产品中的应用；

所述耐药为耐酰胺醇类药物；所述酰胺醇类药物具体为氟苯尼考或氯霉素；上述 产品为试剂盒；

所述耐药基因具体为floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一种。

本发明的第四个目的是提供一种检测和/或辅助检测待测细菌是否含有耐药基因 的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述的引物组或上述PCR试剂对所述待测 样品进行四重PCR扩增，检测PCR产物；

若得到的PCR产物具有200bp、348bp、534bp和683bp大小，则待测细菌含有或 候选含有4种耐药基因：floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因；若得到的PCR 产物不具有200bp、348bp、534bp和683bp任一种大小，则待测细菌不含有或候选不 含有4种耐药基因中任一种：floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因；

若得到的PCR产物具有200bp大小，则待测细菌含有或候选含有floR基因；若得 到的PCR产物不具有200bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有floR基因；

若得到的PCR产物具有348bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexB基因；若得 到的PCR产物不具有348bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有fexB基因；

若得到的PCR产物具有534bp大小，则待测细菌含有或候选含有cfr基因；若得 到的PCR产物不具有534bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有cfr基因；

若得到的PCR产物具有683bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexA基因；若得 到的PCR产物不具有683bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有fexA基因；

若得到的PCR产物具有200bp和348bp大小，则待测细菌含有或候选含有floR 基因和fexB基因；若得到的PCR产物不具有200bp和348bp大小，则待测细菌不含有 或候选不含有floR基因和fexB基因；

若得到的PCR产物具有200bp和534bp大小，则待测细菌含有或候选含有floR 基因和cfr基因；若得到的PCR产物不具有200bp和534bp大小，则待测细菌不含有 或候选不含有floR基因和cfr基因；

若得到的PCR产物具有200bp和683bp大小，则待测细菌含有或候选含有floR 基因和fexA基因；若得到的PCR产物不具有200bp和683bp大小，则待测细菌不含有 或候选不含有floR基因和fexA基因；

若得到的PCR产物具有348bp和534bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexB 基因和cfr基因；若得到的PCR产物不具有348bp和534bp大小，则待测细菌不含有 或候选不含有fexB基因和cfr基因；

若得到的PCR产物具有348bp和683bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexB 基因和fexA基因；若得到的PCR产物不具有348bp大小，则待测细菌不含有或候选不 含有fexB基因和fexA基因；

若得到的PCR产物具有534bp和683bp大小，则待测细菌含有或候选含有cfr基 因和fexA基因；若得到的PCR产物不具有534bp大小和683bp大小，则待测细菌不含 有或候选不含有cfr基因和fexA基因。

上述方法中，所述四重PCR扩增的退火温度为55℃；所述检测PCR产物的方法为 电泳检测或测序。

本发明的第五个目的是提供一种引物对。

本发明提供的引物对，为如下4种中的任一种：引物对1、引物对2、引物对3 和引物对4；

所述引物对1由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单 链DNA分子组成；

所述引物对2由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单 链DNA分子组成；

所述引物对3由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单 链DNA分子组成；

所述引物对4由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单 链DNA分子组成。

本发明的实验证明，本发明根据细菌中主要的4个酰胺醇类药物耐药基因（cfr、 fexA、fexB、floR）的核苷酸序列设计合成4对相应的特异性PCR引物，利用四重PCR 对待检测细菌中酰胺醇类药物耐药基因进行扩增，可以一次性筛选出待测细菌是否含 4个酰胺醇类药物耐药基因中任一种或者多种，也可以用来鉴定待测细菌是否耐酰胺 醇类药物；本发明的引物及方法具有高效、快速、成本低、实用性强等特点。

附图说明

图1为四重PCR的扩增结果

图2为菌株W9-2的扩增结果

图3为菌株EF-01的扩增结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的部分菌株及记载该菌株的文献来源及含有的耐药基因如表1 所示：

表1为6株耐酰胺醇类药物菌株文献来源及含有的耐药基因

上述菌株公众均可从中国农业大学获得。

实施例1、用于检测动物源细菌的酰胺醇类药物耐药基因的引物的获得

根据细菌中主要的4个酰胺醇类药物耐药基因cfr（其核苷酸序列为序列9）、fexA （其核苷酸序列为序列10）、fexB（其核苷酸序列为序列11）、floR（其核苷酸序列为 序列12）的核苷酸序列设计合成4对相应的特异性PCR引物，具体如下：

耐药基因cfr的特异性PCR引物对：

For:5’-CTCTAGCCAACCGTCAAG-3’（序列1），

Rev:5’-AAGCAGCGTCAATATCAATC-3’（序列2）；

耐药基因fexA的特异性PCR引物对:

For:5’-ATTCTGGCAAGTGGTAGTC-3’（序列3），

Rev:5’-CCTGGCAACAATATCATTCC-3’（序列4）；

耐药基因fexB的特异性PCR引物对:

For:5’-CCAACGCCAATACAACCA-3’（序列5），

Rev:5’-TCCTGTTCTCGGTGTGAT-3’（序列6）；

耐药基因floR的特异性PCR引物对:

For:5’-GGATGGCAGGCGATATTC-3’（序列7）；

Rev:5’-GAGAAGAAGACGAAGAAGGT-3’（序列8）；

根据现有技术合成上述耐药基因cfr、fexA、fexB、floR的特异引物，用超纯水 稀释，使各条引物的浓度均为10μmol/L。

实施例2、用于检测动物源细菌的酰胺醇类药物耐药基因的引物的应用

一、引物在鉴定细菌的酰胺醇类药物耐药基因或耐药性中的应用

1、动物源细菌耐药性检测及基因组DNA的提取

将上述细菌EF-01、W9-2、LYP-C-BCTb11均进行耐酰胺醇类药物检测：在含10mg /L的氟苯尼考的脑心浸液（BHI）平板划线，37°C过夜培养，能够生长的为耐氟苯 尼考菌，结果细菌EF-01、W9-2、LYP-C-BCTb11均为耐氟苯尼考菌。

采用煮菌法分别提取耐酰胺醇类药物的细菌EF-01、W9-2、LYP-C-BCTb11的基因 组DNA，得到EF-01基因组DNA、W9-2基因组DNA、LYP-C-BCTb11基因组DNA（280μ g/mL）。

将提取的三株菌株基因组各取10μl等体积混合作为阳性对照样品。

2、四重PCR扩增

Premix Ex Taq溶液（Takara公司Code:D335A），其各组分及浓度为1.25U/25 μl的Taq聚合酶、浓度均为0.4mmol/L的dNTP、浓度为4mmol/L的Mg²⁺。

20μlPCR扩增体系为：10μl Premix Ex Taq溶液、0.4μl浓度均为10μmol/L 耐药基因cfr、fexA、fexB、floR的特异性上下游引物对（各条引物在扩增体系中的 终浓度均为0.2μmol/L）和超纯水装入一无菌的PCR反应薄壁管中，加水至总体积为 19.5μl；再向其中加入0.5μl细菌基因组DNA作为模板，即可形成PCR扩增体系。

上述PCR扩增体系的各组分及其终浓度如下（20μl体系的浓度）：0.2mmol/L 的dNTP、2mmol/L的Mg²⁺、0.5U的Taq酶、耐药基因cfr、fexA、fexB、floR的特异 性上下游引物终浓度均为0.2μmol/L和水。

将20μlPCR扩增体系按照如下PCR扩增条件进行扩增，其中模板分别为上述1 得到的阳性对照样品、待测菌株（于2010年在山东省猪场采集的猪源耐氟苯尼考细菌， 将获得的鼻拭子在含有10mg/L的氟苯尼考的脑心浸液（BHI）琼脂平板上划线，37°C 过夜培养，获得的耐氟苯尼考菌株）基因组DNA、阴性对照（水）：

PCR扩增循环参数为：95℃预变性5min，之后32个循环，每个循环为95℃变性 30s、55℃退火30s、72℃延伸40s，循环结束后72℃延伸8min，4℃保存。

得到PCR产物。

取7μl的PCR产物，点样于2%琼脂糖凝胶电泳板孔中，150V电压，电泳25min, 通过凝胶成像系统获取图片。

将电泳条带回收测序，

结果如图1所示，泳道1-4分别为：1号泳道为DL2000DNA Marker，2号泳道为 EF-01、W9-2、LYP-C-BCTb11三株菌混合基因组，3号泳道为阴性对照（水），4号泳 道为待测菌株（待测菌株为2010年在山东省猪场采集的猪源耐氟苯尼考细菌，将获得 的鼻拭子在含有10mg/L的氟苯尼考的脑心浸液（BHI）琼脂平板上划线，37°C过 夜培养，获得的菌株），可以看出，泳道2为EF-01、W9-2、LYP-C-BCTb11三株菌混合 基因组有200bp、348bp、534bp、683bp的条带，说明三种菌株含有的耐药基因可以在 一次反应体系中同时扩增，且不受影响；泳道4仅有200bp的条带，说明待测菌株仅 含有floR基因。

提取待测菌株的基因组DNA，测序，可以看出，待测菌株的基因组DNA的确仅含 有耐酰胺醇类基因floR；

分别提取EF-01、W9-2、LYP-C-BCTb11三株菌的基因组DNA，测序，可以看出， EF-01含有fexB（348bp）+cfr(534bp)，W9-2含有fexA(683bp)+cfr(534bp)， LYP-C-BCTb11含有cfr(534bp)+floR(200bp)。

因此，可以采用上述耐药基因cfr、fexA、fexB、floR的特异性上下游引物对组 成的引物组或者PCR试剂对待测细菌进行如下检测：

检测待测细菌是否含有耐酰胺醇类药物基因：floR基因、fexB基因、cfr基因和 /或fexA基因：

若得到的PCR产物具有200bp、348bp、534bp和683bp大小，则待测细菌含有或 候选含有4种耐药基因：floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因；若得到的PCR 产物不具有200bp、348bp、534bp和683bp任一种大小，则待测细菌不含有或候选不 含有4种耐药基因中任一种：floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因；

若得到的PCR产物具有200bp大小，则待测细菌含有或候选含有floR基因；若得 到的PCR产物不具有200bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有floR基因；

若得到的PCR产物具有348bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexB基因；若得 到的PCR产物不具有348bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有fexB基因；

若得到的PCR产物具有534bp大小，则待测细菌含有或候选含有cfr基因；若得 到的PCR产物不具有534bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有cfr基因；

若得到的PCR产物具有683bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexA基因；若得 到的PCR产物不具有683bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有fexA基因；

若得到的PCR产物具有200bp和348bp大小，则待测细菌含有或候选含有floR 基因和fexB基因；若得到的PCR产物不具有200bp和348bp大小，则待测细菌不含有 或候选不含有floR基因和fexB基因；

若得到的PCR产物具有200bp和534bp大小，则待测细菌含有或候选含有floR 基因和cfr基因；若得到的PCR产物不具有200bp和534bp大小，则待测细菌不含有 或候选不含有floR基因和cfr基因；

若得到的PCR产物具有200bp和683bp大小，则待测细菌含有或候选含有floR 基因和fexA基因；若得到的PCR产物不具有200bp和683bp大小，则待测细菌不含有 或候选不含有floR基因和fexA基因；

若得到的PCR产物具有348bp和534bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexB 基因和cfr基因；若得到的PCR产物不具有348bp和534bp大小，则待测细菌不含有 或候选不含有fexB基因和cfr基因；

若得到的PCR产物具有348bp和683bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexB 基因和fexA基因；若得到的PCR产物不具有348bp大小，则待测细菌不含有或候选不 含有fexB基因和fexA基因；

若得到的PCR产物具有534bp和683bp大小，则待测细菌含有或候选含有cfr基 因和fexA基因；若得到的PCR产物不具有534bp大小和683bp大小，则待测细菌不含 有或候选不含有cfr基因和fexA基因。

检测待测细菌是否耐酰胺醇类药物（具体为耐氟苯尼考）：

若得到的PCR产物具有200bp、348bp、534bp、683bp中的至少一种，则待测细菌 耐酰胺醇类药物或候选耐酰胺醇类药物；

若得到的PCR产物不具有200bp、348bp、534bp、683bp中的任一种，则待测细菌 不耐酰胺醇类药物或候选不耐酰胺醇类药物。

二、特异性检测

1、耐酰胺醇类药物检测

耐氟苯尼考检测：取6株耐酰胺醇类药物菌株EF-01、W9-2、3-38、LYP-C-BCTb11、 W3、EH-1和6株酰胺醇类药物敏感菌株S1-S6（均于2012年采集宁夏屠宰场健康猪的 肛拭子），进行耐氟苯尼考检测，具体如下：菌株在普通不含有药物的BHI（脑心浸液 培养基）平板上能够生长，且在含有10mg/L的氟苯尼考的脑心浸液（BHI）琼脂平 板上不能生长，则氟苯尼考敏感；菌株在普通不含有药物的BHI（脑心浸液培养基） 平板上能够生长，且在含有10mg/L的氟苯尼考的脑心浸液（BHI）琼脂平板上能生 长，则耐氟苯尼考；

耐氯霉素检测：取6株耐酰胺醇类药物菌株EF-01、W9-2、3-38、LYP-C-BCTb11、 W3、EH-1和6株酰胺醇类药物敏感菌株S1-S6，进行耐氯霉素检测，具体如下：菌株 在普通不含有药物的BHI（脑心浸液培养基）平板上能够生长，且在含有32mg/L的 氯霉素的脑心浸液（BHI）琼脂平板上不能生长，则氯霉素敏感；菌株在普通不含有药 物的BHI（脑心浸液培养基）平板上能够生长，且在含有32mg/L的氯霉素的脑心浸 液（BHI）琼脂平板上能生长，则耐氯霉素；

经过上述检测，菌株EF-01、W9-2、3-38、LYP-C-BCTb11、W3、EH-1耐氟苯尼也 耐氯霉素；

菌株S1-S6为对氟苯尼考敏感也对氯霉素敏感。

6株耐酰胺醇类药物菌株的记载的文献来源和经过基因组测序后的含有的耐药基 因的结果如下表1所示。

2、PCR检测

分别提取6株耐酰胺醇类药物菌株EF-01、W9-2、3-38、LYP-C-BCTb11、W3、EH-1 和6株酰胺醇类药物敏感菌株S1-S6的基因组DNA作为模板，用上述一的2的PCR扩 增体系及PCR扩增条件进行扩增，得到PCR产物。

取7μl的PCR产物，点样于2%琼脂糖凝胶电泳板孔中，150V电压，电泳25min, 通过凝胶成像系统获取图片。

将电泳条带回收测序，

检测待测细菌是否含有耐酰胺醇类药物基因：floR基因、fexB基因、cfr基因和 /或fexA基因：

若得到的PCR产物具有200bp、348bp、534bp和683bp大小，则待测细菌含有或 候选含有4种耐药基因：floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因；若得到的PCR 产物不具有200bp、348bp、534bp和683bp任一种大小，则待测细菌不含有或候选不 含有4种耐药基因中任一种：floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因；

若得到的PCR产物具有200bp大小，则待测细菌含有或候选含有floR基因；若得 到的PCR产物不具有200bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有floR基因；

若得到的PCR产物具有348bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexB基因；若得 到的PCR产物不具有348bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有fexB基因；

若得到的PCR产物具有534bp大小，则待测细菌含有或候选含有cfr基因；若得 到的PCR产物不具有534bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有cfr基因；

若得到的PCR产物具有683bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexA基因；若得 到的PCR产物不具有683bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有fexA基因；

若得到的PCR产物具有200bp和348bp大小，则待测细菌含有或候选含有floR 基因和fexB基因；若得到的PCR产物不具有200bp和348bp大小，则待测细菌不含有 或候选不含有floR基因和fexB基因；

若得到的PCR产物具有200bp和534bp大小，则待测细菌含有或候选含有floR 基因和cfr基因；若得到的PCR产物不具有200bp和534bp大小，则待测细菌不含有 或候选不含有floR基因和cfr基因；

若得到的PCR产物具有200bp和683bp大小，则待测细菌含有或候选含有floR 基因和fexA基因；若得到的PCR产物不具有200bp和683bp大小，则待测细菌不含有 或候选不含有floR基因和fexA基因；

若得到的PCR产物具有348bp和534bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexB 基因和cfr基因；若得到的PCR产物不具有348bp和534bp大小，则待测细菌不含有 或候选不含有fexB基因和cfr基因；

若得到的PCR产物具有348bp和683bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexB 基因和fexA基因；若得到的PCR产物不具有348bp大小，则待测细菌不含有或候选不 含有fexB基因和fexA基因；

若得到的PCR产物具有534bp和683bp大小，则待测细菌含有或候选含有cfr基 因和fexA基因；若得到的PCR产物不具有534bp大小和683bp大小，则待测细菌不含 有或候选不含有cfr基因和fexA基因。

检测待测细菌是否耐酰胺醇类药物（具体为耐氟苯尼考或耐氯霉素）：

若得到的PCR产物具有200bp、348bp、534bp、683bp中的至少一种，则待测细菌 耐酰胺醇类药物或候选耐酰胺醇类药物；

若得到的PCR产物不具有200bp、348bp、534bp、683bp中的任一种，则待测细菌 不耐酰胺醇类药物或候选不耐酰胺醇类药物。

结果如下：

菌株EF-01得到的PCR产物具有348bp和534bp大小，则该菌株含有fexB基因和 cfr基因（该菌株耐氟苯尼考或氯霉素）；提取该菌株的基因组DNA送去测序，含有fexB 基因（序列11）和cfr基因（序列9）；

菌株W9-2的PCR产物具有683bp和534bp大小，则该菌株含有fexA基因和cfr 基因（该菌株耐氟苯尼考或氯霉素）；提取该菌株基因组DNA送去测序，含有fexA基 因（序列10）和cfr基因（序列9）；

菌株3-38的PCR产物具有683bp和534bp大小，则该菌株含有fexA基因和cfr 基因（该菌株耐氟苯尼考或氯霉素）；提取该菌株基因组DNA送去测序，含有fexA基 因（序列10）和cfr基因（序列9）；

菌株LYP-C-BCTb11得到的PCR产物具有534bp和200bp大小，则该菌株含有cfr 基因和floR基因（该菌株耐氟苯尼考或氯霉素）；提取该菌株基因组DNA送去测序， 含有cfr基因（序列9）和floR（序列12）；

菌株W3的PCR产物具有348bp和534bp大小，则该菌株含有fexB基因和cfr基 因（该菌株耐氟苯尼考或氯霉素）；提取该菌株基因组DNA送去测序，含有fexB基因 （序列11）和cfr基因（序列9）；

菌株EH-1得到的PCR产物具有348bp大小，则该菌株含有fexB基因（该菌株耐 氟苯尼考或氯霉素）；提取该菌株基因组DNA送去测序，含有fexB基因（序列11）；

S1-S6菌株得到的PCR产物均不具有200bp、348bp、534bp、683bp中的任一种， 因此S1-S6菌株均不含有cfr、fexA、fexB、floR基因中任一种（对氟苯尼考及氯霉 素均敏感）；分别提取S1-S6菌株的基因组DNA送去测序，各菌株的基因组DNA均不含 有cfr（序列9）、fexA（序列10）、fexB（序列11）和floR基因（序列12）中任一 种。

因此，测序结果与本发明的方法一致，说明本发明的方法正确。

三、灵敏度检测

将上述耐氟苯尼考或耐氯霉素的菌株W9-2（含有fexA基因和cfr基因）和EF-01 （含有fexB基因和cfr基因）的基因组DNA溶液的浓度均调为280μg/mL,分别用无 菌水做10倍梯度稀释，共稀释8个梯度，每个梯度分别取0.5μl作为模板，用上述 一的2的PCR扩增体系及PCR扩增条件进行扩增，得到PCR产物。

取7μl的PCR产物，点样于2%琼脂糖凝胶电泳板孔中，150V电压，电泳25min, 通过凝胶成像系统获取图片。

结果如图2和图3所示：

图2为菌株W9-2的扩增结果，其中，泳道1为DL2000DNA Marker；泳道2～9:DNA 模板浓度分别为14.0ng、1.4ng、140.0pg、14.0pg、1.4pg、140.0fg、14.0fg、1.4fg/PCR； 泳道10：ddH₂O。由图2可知，在第6泳道可以看到较为清晰的条带，其检测出的耐药 基因为cfr基因、fexA基因，所对应的DNA浓度为1.4pg/PCR，而第7泳道之后看不 到清晰的扩增条带。

图3为菌株EF-01的扩增结果，其中，泳道1为DL2000DNA Marker；泳道2～9:DNA 模板浓度分别为14.0ng、1.4ng、140.0pg、14.0pg、1.4pg、140.0fg、14.0fg、1.4fg/PCR； 泳道10：ddH₂O。由图3可知，在第6泳道可以看到较为清晰的条带，其检测出的耐药 基因为cfr基因、fexB基因，所对应的DNA浓度为1.4pg/PCR，而第7泳道之后看不 到清晰的扩增条带。

因此，综合两次检测结果判定PCR检测灵敏度为1.4pg/PCR，具有较高的灵敏度。