一种外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌，其分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia.Pastoris)，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，登记入册编号为CGMCC NO：8924，保藏日期为2014年3月17日。本发明还公开了上述酵母工程菌的构建方法和应用。本发明的酵母工程菌经甲醇诱导后，测的粗酶活为27.9U/mL。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达甲酸脱氢酶的工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase,FDH)属于D-2-羟基酸脱氢酶类，广泛存在于甲醇利用型的细菌及酵母中，根据其4级结构辅基构象和类型分为几种不同类型，其中最为重要的一类就是NAD+依赖型甲酸脱氢酶(EC1.2.1.2)，它是NAD⁺/NADH辅酶循环中研究最多的酶。可以在催化甲酸转化为二氧化碳的同时将NAD⁺还原为NADH。该类型的甲酸脱氢酶是由两个相同的亚基所组成，没有包含其他金属离子和辅基，其催化过程中的一个显著的特点就是来自底物的氢离子直接转移到NAD+的烟碱C4原子上，无需酸碱催化步骤。

由于甲酸/甲酸脱氢酶辅酶再生体系具有底物价格低、酶来源广、产物易于从体系中去除和低浓度的底物不影响其他酶活力等优点，所以使得甲酸脱氢酶体系成为最成功的辅酶再生系统，目前已应用于手性化合物的工业生产，工业化大规模的生产应用应该是德国Degussa公司成功利用博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的FDH生产L-叔亮氨酸。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对主流获取甲酸脱氢酶技术上的不足，提供一种能够将目的酶分泌到菌体细胞外的酵母工程菌，以实现为后续快速有效地分离提纯甲酸脱氢酶提供粗酶液，带来降低成本、提高菌体利用率和甲酸脱氢酶工业化生产技术革新的应用价值。

本发明还要解决的一个技术问题是提供上述酵母工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述酵母工程菌的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌，其分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia.Pastoris)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；邮编：100101；登记入册编号为CGMCC NO.8924；保藏日期为2014年3月17日。

上述外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌是转化有重组突变质粒pPICZαA-fdh的分泌型巴斯德毕赤酵母菌，其中，所述的重组突变质粒pPICZαA-fdh是以醇氧化酶-1基因为启动子，并含有甲酸脱氢酶基因和Zeocin^TM抗性基因。

上述外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)应用PCR方法获得甲酸脱氢酶基因(如SEQ ID No：1所示)；

(2)应用常规重组质粒构建方法构建重组质粒pPICZαA-fdh；

(3)将重组质粒pPICZαA-fdh用Sal I线性化后，电击转化入宿主菌巴斯德毕赤酵母中，即构成重组菌；

(4)将上述重组菌经过抗生素筛选和甲醇诱导表达后，即得出能够外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌。

步骤(1)中，使用引物设计软件设计引物并应用PCR方法获得甲酸脱氢酶基因，引物设计软件采用Stratagene公司的在线引物设计软件Primer DesignProgram。

步骤(2)中，所述的重组质粒pPICZαA-fdh是将甲酸脱氢酶基因插入到质粒pPICZαA中形成的重组质粒。具体方法参见Invitrogen公司的Mulit-CopyPichiaExpression Kit操作手册。

步骤(3)中，将重组质粒pPICZαA-fdh用Sal I内切酶线性化后电击转化入宿主菌巴斯德毕赤酵母之前，先将其转化到大肠杆菌中进行扩增。

上述外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌在制备甲酸脱氢酶中的应用。

具体的应用方法为，将外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌CGMCC NO.8924在BMGY培养基中培养至OD₆₀₀为2～6，离心上清后用BMMY重悬至OD₆₀₀为1.0用以诱导表达，维持甲醇浓度为1v/v％，将所得的BMMY菌液诱导产酶96小时。

有益效果：本发明所得到的甲酸脱氢酶外源表达酵母工程菌，能够外源表达甲酸脱氢酶到细胞外，使得提纯甲酸脱氢酶的技术要求变得更简便，与传统的破碎细胞后再提纯甲酸脱氢酶工艺条件更加的简便。本发明的酵母工程菌经甲醇诱导后，测的粗酶活为27.9U/mL。

附图说明

图1重组质粒pPICZαA-fdh的结构示意图。

图2诱导表达后的酶活示意图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：目的基因的获得。

根据NCBI上的博伊丁假丝酵母的FDH基因设计引物用于获得甲酸脱氢酶基因，引物设计软件采用Stratagene公司的在线引物设计软件Primer DesignProgram。选用EcoRI和NotI酶切位点，引物设计如下(下划线为酶切位点)：

c.boipp.f5’—GAATTCATGAAGATCGTTTTAGTC—3’

c.boitt.r5’—GCGGCCGCTTATTTCTTATCGTGTTT—3’

表1PCR反应参数

PCR获得目的基因，基因如SEQ ID No：1所示，具体条件如表1所示。

实施例2：重组质粒的构建。

构建出重组质粒pPICZαA-fdh(具体参见Invitrogen公司的Mulit-Copy PichiaExpression Kit操作手册)，由于所设计的用于PCR的引物上带有EcoRI和NotI酶切位点，所以PCR所得的目的基因也应在两端带有相应的两个酶切位点(后经测序后证实)，目的基因经扩增后使用限制性内切酶切出EcoRI和NotI酶切位点的粘性末端，同时将pPICZαA质粒也使用相同的限制性内切酶切出相应的粘性末端，再将两者使用T4连接酶进行连接，经转导到大肠杆菌中扩增后筛选而获得pPICZαA-fdh重组质粒，其结构如图1所示，该质粒为穿梭质粒，之后用于线性化后电转宿主菌。

实施例3：目的DNA的准备和毕赤酵母的电击转化。

将所得的重组质粒在大肠杆菌中进行扩增后提取质粒，用Sal I内切酶进行酶切(具体条件如表2)，获得线性化目的DNA；感受态细胞的制备：接种毕赤酵母的单菌落GS115到含有5mL YPD液体培养基的摇管中，30℃，220rpm过夜培养后转接含有250mL YPD液体培养基的1L大三角瓶，接种量1％，30℃，20rpm培养过夜，直到OD600＝1.36；1500g，4℃条件下1500g离心培养液5min，再用250mL冰浴的无菌水重悬细胞；4℃条件下1500g离心5min，然后用125mL冰浴的无菌水重悬细胞；4℃条件下1500g离心5min，然后用20mL冰浴的1M的山梨醇溶液重悬细胞；4℃条件下1500g离心5min，然后用1mL冰浴的1M的山梨醇溶液重悬细胞，使菌悬液体积大约为1500μL。

表2Sal I内切酶体系

制备好感受态细胞后，运用电转化仪进行电转化。电转化使用2mm电击杯，每个电击杯内加入80μL感受态细胞和10μL的线性化DNA。电转完毕后立即加入1M的山梨醇。30℃水浴静置培养1.5h。涂布于YPDSZ平板上，30oC恒温培养2-3天。电转化条件为电压1.5KV；电容25μF；电阻200Ω；电击时间4～10msec。

实施例4：重组酵母工程菌的诱导表达。

将上述转化子在YPDS+Zeocin^TM平板上筛选表达，挑取单克隆，在BMGY培养基中培养至OD₆₀₀为2-6，离心上清后用BMMY重悬至OD₆₀₀为1.0用以诱导表达。将所得的BMMY菌液用甲醇诱导产酶。维持甲醇浓度为1％，定时取上清测酶活，96小时结束表达。经测定酶活后，酶活参数如图2，可以看出在96小时内，该工程菌所产出的甲酸脱氢酶量呈上升趋势，在96小时的时候粗酶活可达到27.8U/mL。

酶活单位定义：每分钟生成1μmol NADH所需要的酶量为1个酶活单位U。