生产玻尿酸的益生菌株及其用途

摘要

本发明提供新颖的益生菌株，其为嗜热链球菌TCI633(保藏编号为DSM28121)。本发明还提供一种生产玻尿酸的组合物，其包含具有生产玻尿酸功能的益生菌株。本发明另提供一种关于益生菌株用于生产玻尿酸的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及新颖的益生菌株，以及其应用于生产玻尿酸的用途。 

背景技术

玻尿酸(Hyaluronic acid，HA)属于线性醣胺多醣(glycosaminoglycan)，其含有重复双醣N-乙酰-氨基葡萄糖(N-acetyl-glucosamine)及D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid)，分布于人体的结缔组织、上皮组织和神经组织；此外，玻尿酸为细胞外基质的主要成分，作用于细胞增殖和迁移，还涉及某些恶性肿瘤的进展。 

在人体内，玻尿酸以高浓度的玻尿酸盐形式在皮肤、脐带及玻璃体液中，平均70公斤(154磅)人体内约有15克玻尿酸，但存在于人体的玻尿酸量会因年龄增加而逐渐减少，平均每天的玻尿酸会流失，所以在婴儿时期体内的玻尿酸含量最高，到了25岁时玻尿酸含量只剩65%，到65岁时只剩25%，因此，年轻的肌肤富含玻尿酸所以柔软又有弹性。玻尿酸减少时肌肤会逐渐失去保水能力，除了因年龄增加而需要补充外，现代人因为工作压力及不规则的生活、不均衡的饮食生活、紫外线、上班族长期在冷气房工作等因素，也很容易造成肌肤水份的流失。 

近期在科学研究中已发现，玻尿酸能有效改善皮肤水合作用(hydration)；刺激皮肤中的胶原蛋白生产；可作为一种抗氧化剂和自由基清除剂；保持皮肤的弹性；润滑及缓冲关节；并具有抗菌和抗发炎以及保持眼部组织中的流体，更能有助于保护眼睛。 

玻尿酸独特的吸湿、黏弹性、无抗原性、生物可分解性(biodegradable)及生物兼容性(biocompatible)，因此，玻尿酸已广泛应用在医药、化妆品和特色食品上。通常市售可食用的玻尿酸主要来自于鸡冠以及链球菌的发酵。由于最具有生产力的链球菌一般为不可食用的，目前食品中使用的玻尿酸主要从鸡冠萃取。然而，从鸡冠萃取玻尿酸在食用安全上依然有人畜共通疾病病毒感染的 疑虑，且经过胃及肠道内消化液之后会被酶分解，因而无法经由食物摄取达到显著的效果。 

发明内容

为解决上述问题，本发明提供新颖的生产玻尿酸的益生菌株，其中该益生菌株为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TCI 633(保藏单位：德国莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养收集中心(Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)，保藏单位地址：德国布伦瑞克市38124因霍芬大街7B，保藏编号为DSM 28121，保藏日期为2013年12月2日)，且该益生菌株的来源为母乳。 

本发明还提供一种益生菌株用于制备生产玻尿酸组合物的用途，其中该益生菌株为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TCI633(保藏编号为DSM28121)，且该益生菌株为具有活性或去活性的菌株。 

本发明另提供一种用于生产玻尿酸的组合物，包含：生产玻尿酸的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TCI633(保藏编号为DSM28121)益生菌株，其中这些菌株在肠道内可生产玻尿酸，在肠道产生的玻尿酸可经由肠道吸收，以提升血液中玻尿酸的含量；且这些菌株能在肠道内有效繁殖而增加该益生菌株数量，该益生菌株为具有活性或去活性的菌株。 

在本发明的一个实施例中，其中该组合物为乳制品、饮食补充物、医药组成物、保养品或食品。 

在本发明另提供一种益生菌株的用途，其将本发明的益生菌株或其代谢产物应用于制备提升玻尿酸的乳制品、饮食补充物、医药组成物、保养品或食品。 

本发明提供一种由健康人类母乳中分离纯化培养的益生菌株，该益生菌株具有耐胆盐、耐胃酸、具肠道细胞吸附能力，能顺利运输至肠道持续保有优异活性，且能在肠道内有效繁殖而增加益生菌株数量，具有抑制过敏反应、抗发炎与促进淋巴球活性的优异功效。更特别的是，本发明的益生菌株在肠道内可生产玻尿酸，使人体在服用后体内的玻尿酸含量提升，因此，本发明的益生菌株或其代谢产物可应用于乳制品、医药组合物、饮食补充物、保养品或食品等。 

但以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神与范围所作的等效修饰或变更，均应涵盖于本发明的保护范围中。 

附图说明

图1为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TCI633(保藏编号为DSM 28121)培养在人工肠液中在不同的时间点玻尿酸的含量的数据图。 

图2为嗜热链球菌TCI633(保藏编号为DSM28121)培养在人工肠液中在不同的时间点TCI633菌落数及TCI633菌液的pH值的数据图。 

图3为受试者编号(Volunteer#1)在服用本发明TCI633益生菌的胶囊第0、1、2、4及7天每位受试者血液中的玻尿酸浓度(ng/mL)的数据图。 

图4为受试者编号(Volunteer#2)在服用本发明TCI633益生菌的胶囊第0、1、2、4及7天每位受试者血液中的玻尿酸浓度(ng/mL)的数据图。 

图5为受试者编号(Volunteer#3)在服用本发明TCI633益生菌的胶囊第0、1、2、4及7天每位受试者血液中的玻尿酸浓度(ng/mL)的数据图。 

图6为平均三位受试者在服用本发明TCI633益生菌的胶囊第0、1、2、4及7天每位受试者血液中的平均玻尿酸改变倍数的数据图。 

具体实施方式

益生菌株(probiotic或probiotic bacteria)为一种微生物，其菌体、混合菌株、萃取物或代谢产物对于宿主本身具有正面影响，是通常来自于人体内、有益于肠道健康的活菌，还可指外来补充、对身体可能有益的某些微生物，其中该益生菌株的代谢产物为该益生菌株的分泌物，包含发酵后的培养液。 

本发明为从健康人类母乳中分离筛选出的菌株，纯化培养及菌种鉴定后，该菌株为新颖的菌株，命名为TCI633。经由模拟人工肠液(Artificial intestinal solution，AIS)发现这些菌株具有在肠道内可生产玻尿酸的功效，显示本发明的益生菌株对在肠上皮细胞具有强吸附能力，具有保持皮肤的弹性、润滑及缓冲关节的功效，并可制成有效提升体内玻尿酸的乳制品、饮食补充物、医药组成物、保养品或食品。 

以咔唑法进行玻尿酸的测定 

将培养液以4倍体积的95%乙醇洗涤3次以沉淀出非糖的成分，然后将上清液再溶解在1倍体积的水中进行进一步的分析。本发明根据咔唑法(carbazole method)测定(Bitter and Muir,1962,Anαl Biochem.4:330-334)玻尿酸的分子量测定。玻尿酸先以硫酸水解使己糖醛酸(hexuronic acid)不稳定，再与咔唑试剂反应形成粉红色溶液，以D-葡糖醛酸(D-glucuronic acid)作为标准液；将0.25mL的样本或空白溶液加入至放置冰上的每个试管中，然后将1.5mL 硫酸试剂与四硼酸钠(sodium tetraborate)慢慢加入至每个试管中并充分混合，将试管再移至沸水浴中10分钟，冷却至室温后，将50μL咔唑试剂的液加入到每个试管中。再次把所有的试管以沸水浴5分钟，冷却至室温。各反应物利用分光光度计以525nm波长测量光密度，每公克益生菌的玻尿酸含量计算公式如下︰ 

每公克益生菌的玻尿酸含量(μg)＝(Abs.-0.073)/0.006)×100)×2.07)/((20/100)) 

其中，缩写或数值代表如下： 

Abs.＝益生菌的吸光值 

100＝稀释倍数 

2.07=换算系数 

20/100=菌粉/溶液比 

实施例1从母乳中分离菌株 

嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TCI633(保藏编号为DSM28121)从人类健康的母乳分离。先将新鲜的母乳样本稀释涂抹于MRS-Cys(半胱氨酸)琼脂平板以分离乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)及嗜热链球菌(Streptococcus spp.)；将琼脂平板培养于厌氧37℃的条件下48小时，以图鉴鉴别菌落(colony)型态，从琼脂平板上每个菌落型态至少选择1个代表菌株，共选择5至10个不同菌落型态的菌株，并以显微镜及革兰氏染色预测可能的菌种。 

实施例2筛选菌株 

2.1生化鉴定的方式︰ 

革兰氏染色法(Gram’s stain)，清洗后的细胞以10%中性福尔马林固定30分钟后，以磷酸盐缓冲液清洗4次，对培养中的细胞与待测菌株进行格兰氏染色。 

2.2分子鉴定的方式︰ 

因不同种的微生物种类必有其独特的核酸序列，以细菌而言，同一菌种的16S rDNA基因序列差异极小，故本发明用以鉴定菌种。 

本发明利用16S DNA宽范围(Broad-Range)聚合酶链反应(Simo Nikkari,Fred A.Lopez et al.,Emerging Infectious Disease Journal2002,8,188-194)检测以确认所分离的菌种。先使用taco^TMTotal DNA Extraction Kit(瑞基海洋生物科技股份有限公司，台湾)萃取所分离出菌株的总DNA，这些菌株的16s rDNA使用通用引物(universal primer)包含有︰fD1mod(5′-AGAGTTTGATCYTGGYTYAG-3′，SEQ ID NO:1)及16S1RR-B(5′-CTTTACGCCCARTRAWTCCG-3′，SEQ ID NO:2)、63F(5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′，SEQ ID NO:3)及16S1RR-B(SEQ ID NO:2)、8F2(5′-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，SEQ ID NO:4)及806R(5′-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3′，SEQ ID NO:5)、515F(5′-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3′,SEQ ID NO:6)及13R(5′-AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3′,SEQ ID NO:7)进行聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），反应条件如下︰10mM Tris-HCl pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200μM dNTP、2.5U PE AmpliTaq LD DNA polymerase(莱富生命科技股份有限公司，美国)、5μL菌株DNA以及每个引物20pmol，总反应体积为50μL。扩增反应以94℃进行3分钟后，以94℃变性30秒、56℃退火30秒、及72℃延伸30秒进行30至36个循环，再以72℃延伸7分钟，PCR产物以电泳胶进行分析。接着，PCR产物使用TA或TOPO选殖系统(莱富生命科技股份有限公司，美国)进行选殖。使用ABI PRISMTM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit(莱富生命科技股份有限公司，美国)和核酸自动测序分析仪进行分析。将测序后的结果，利用GeneBank生物信息数据库及生物信息工具AutoAssembler(莱富生命科技股份有限公司，美国)进行搜寻16S rDNA比对，以确认此菌株序列片段为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)命名为TCI633(SEQ ID NO:8)益生菌株。 

将以甘油保存的TCI633益生菌株接种在MRS培养基(1%，v/v)培养16至24小时，再将菌株转移至含有20g/L至60g/L葡萄糖、5g/L至30g/L蔗糖、10g/L至20g/L酵母菌萃取物5g/L至10g/L蛋白胨(peptone)、2.5g/L至8g/L磷酸氢二钾(K₂HPO₄)、1g/L至2g/L氯化钠(NaCl)及0.5g/L至1.2g/L七 水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)的培养基，在37℃的条件下培养48小时。 

实施例3人工肠液(AIS)模拟实验(in vitro) 

人工肠液是根据Hasjim等人(Jovin Hasjim,Gautier Cesbron Lacau et al.,Biomacromolecules2010,11,3600-3608)所提出的配方进行修改制成。消化酶包括胰酶(8mg/mL)、α-淀粉酶(13U/mL)和淀粉葡糖苷酶(1.12U/mL)加入到0.2M醋酸缓冲液(0.49mM的MgCl₂及200mM的氯化钙，pH6.0)，以作为人工肠液。将灭菌MRS培养基，然后添加人工肠液，模拟在肠道内细菌生长会摄取日常食物的营养物，加入TCI633培养，并培养在人体温度37℃，以建立人工肠液环境。在不同的时间点收集菌液以监测益生菌株的生长和玻尿酸的产量。 

使用平板计数法进行测定，将不同的时间点收集菌液稀释并转移到MRS琼脂板进行菌落计数。如图1及图2所示，TCI633培养在人工肠液24小时，在人工肠液的玻尿酸最高；且TCI633菌落数最多，菌液的pH值最低，显示出人工肠液内的益生菌株增殖且产生酸性物质。 

本发明涉及一种益生菌株，其为从人体母乳中分离筛选出的菌株，其具有在肠道内可生产玻尿酸的功效，并经前述咔唑法(carbazole method)测定证实该TCI633益生菌株每公克可生产72.74mg的玻尿酸。 

实施例4临床试验(in vivo) 

以三位年纪为25岁至33岁的女性受试者(分别编号Volunteer1-3)进行临床试验，每日给予两次含有10¹⁰CFU剂量的本发明TCI633益生菌的胶囊。在给予该胶囊第0、1、2、4及7天时收集受试者的血清样本以人类玻尿酸免疫分析试剂盒(Human Hyaluronic acid ELISA Kit)(型号CSB-E04805h，厂牌CUSABIO，中国)进行检测。 

将100μL的标准液及样本加入预涂盘(pre-coated plate)中的每个孔洞，再以封膜片覆盖，将该预涂盘在37℃的条件下培养2小时；去除孔洞内的液体，每个孔洞加入100μL一倍的生物素-抗体(Biotin-antibody)，以新的封膜片覆盖，将该预涂盘在37℃的条件下培养1小时；去除孔洞内的液体以洗涤液清洗3 次再静置2分钟；每个孔洞加入100μL一倍的HRP(horseradish peroxidase)-avidin，以新的封膜片覆盖，将该预涂盘在37℃的条件下培养1小时；重复去除孔洞内液体及清洗5次；每个孔洞加入90mL的TMB受质(substrate)且以避光在37℃的条件下培养15分钟至30分钟，每个孔洞加入50μL终止溶液，在5分钟内利用分光光度计以450nm波长测量光密度。 

其结果如图3、图4及图5所示，三位受试者的在服用本发明TCI633益生菌的胶囊第0、1、2、4及7天每位受试者血液中的玻尿酸浓度(ng/mL)明显增加，且平均每位受试者血液中的玻尿酸浓度相较于服用前约增加3至4.5倍。 

除此之外，在一个实施例中，本发明的TCI633益生菌株用于生产玻尿酸的组合物时，TCI633菌株可为具有活性或去活性的菌株，且含TCI633菌株或其代谢产物的该组合物可作为乳制品、饮食补充物、医药组成物、保养品或食品等日常生活易于使用的形式。在一个例示中，本发明的TCI633益生菌株可作为保养品，将该益生菌株经发酵培养后所产生的代谢产物与水相添加物质化，再添加乳化剂均匀搅拌使剂型成型，以充分利用并保护益生菌株提高其安定性；其可根据需要被制成各种适合的剂型，例如︰乳液、乳霜，但不仅限于此。 

综上所述，本发明该的益生菌株除具有耐胆盐、耐胃酸、具肠道细胞吸附能力，能顺利运输至肠道持续保有优异活性外，还能在肠道内有效繁殖而增加益生菌株数量，具有在肠道内可生产玻尿酸的优异功效，可制成有效提升体内玻尿酸的乳制品、饮食补充物、医药组成物或食品。 

生物材料保藏 

国外保藏信息： 

TCI 633保藏于德国莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养收集中心(Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)，保藏单位地址：德国布伦瑞克市38124因霍芬大街7B，保藏日期︰2013/12/02，保藏编号：DSM 28121。