用于治疗表达EGFR和N-羟乙酰GM3神经节苷脂(NeuGcGM3)的肿瘤的药物组合物

摘要

本发明涉及用于治疗恶性肿瘤，特别是表达EGFR和N-羟乙酰GM3神经节苷脂这些靶的那些肿瘤的药物组合物，目的是增强针对所述靶的疗法单独所产生的治疗效果。本发明的药物组合物包含针对所述靶中的每一种的抗体和/或疫苗。另外，本发明涉及用于应用本发明的组合物的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及人类医学领域，特别是涉及过表达EGFR和N-羟乙酰 GM3神经节苷脂(NeuGcGM3)的肿瘤的治疗。

现有技术

表皮生长因子受体(EGFR)是在目前的临床评价中最常使用的 分子靶之一。该分子在各种各样的人上皮组织中过表达(Yarden,Y. 和Sliwkowski M.X.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2001,2:127-137)。在 用于抑制EGF受体功能的疗法中两种治疗最常被使用：通过单克隆抗 体(MAb)进行的中和以及抑制酪氨酸激酶活性的小分子(TKI，酪 氨酸激酶抑制剂)(Ciardiello,F.和Tortora G.,N.Engl.J.Med.2008, 358:1160-1174)。虽然还已证明使用VSSP作为佐剂的具有EGFR 的细胞外结构域的疫苗在路易斯肺癌的鼠类模型中产生抗转移效应 (Sánchez Ramírez B.等人,Int.J.Cancer.2006,119:2190-2199)。用 抗-EGFR的单克隆抗体进行的治疗导致了通过中断致癌信号而引起 的肿瘤消退和由Fc受体介导的先天免疫应答机制的诱导(Martinelli, E.等人,Clin.Exp.Immunol.2009,158:1-9)。

已经产生了数种针对人EGFR的单克隆抗体，其中包括西妥昔单 抗(Garrett CR和Eng C.,Expert Opin Biol Ther.2011,11:7,937-49) 和尼妥珠单抗(Mateo C,Immunotechnology1997,3:71-81)。在过 表达EGFR的各种不同肿瘤的疗法中，已经描述了尼妥珠单抗的抗肿 瘤效应(Crombet T等人,Cancer Biol Therapy.2006,5:375-379)， 或者与其他治疗相联合(Crombet T等人,J Clin Oncol.2004, 22:1646-1654；Zhao KL等人,Invest New Drugs.2011年9月8日在 线预先发表)。另一方面，针对鼠类EGFR而产生的单克隆抗体7A7 在路易斯肺癌的治疗中显示出通过T细胞介导的抗肿瘤效应(Garrido  G.等人,Cancer Immunol Immunother.2007,56:1701-1710)。

另一个最多地被研究的靶是神经节苷脂，其是在其结构中包含唾 液酸的鞘糖脂。这些分子存在于正常组织中并且在肿瘤组织中过表达 (Zhang S等人,Int J Cancer73:42-49,1997)。存在两种形式的唾液 酸：N-乙酰化的和N-羟乙酰化的，后者已在人肿瘤中作了描述(Malykh  Y N.等人,Biochimie.2001,83:7623-634)，以神经节苷脂的形式 (Kawai T.等人,1991Cancer.Res.(51)1242-1246)和以N-羟乙酰化 的糖蛋白的形式(Devine P.L.等人,Cancer Research,1991,51:21, 5826-5836)。由于这个原因，已经在大量的恶性肿瘤中鉴定出这些分 子，从而使其成为用于癌症疗法的有吸引力的靶。特别地，NeuGcGM3 神经节苷脂特异地被单克隆抗体14F7所识别(Carr A.等人, Hybridoma,2000,19:3,241-247)。已经通过数种方法在各种不同的 肿瘤中鉴定出该神经节苷脂(Blanco R.等人,ISRN Pathology.2011, Article ID953803,10pag.；Marquina等人,Cancer Research.1996,56: 22,5165-5171)。

已经发表了针对肿瘤中的NeuGcGM3的主动免疫疗法，其中使 用分子疫苗NeuGcGM3/VSSP(Estevez F.等人,Vaccine.1999, 18:190-197)，该分子疫苗已经在具有晚期乳腺癌的患者中显示出其 免疫原性能力和其安全性(Carr A.等人,JCO.2003,21:1015-1021)。 另一方面，已经在临床前阶段中证明，其强有力的抗肿瘤(抗转移) 效应由NK和CD8+细胞的细胞应答机制来介导(Labrada M.等人, Expert Opin.Biol.Ther.2010,10:2,153-162)。同时，通过用抗独特 型疫苗(抗独特型单克隆抗体1E10或雷妥莫单抗(Racotumumab)， 其模拟N-羟乙酰化的神经节苷脂)进行免疫接种，在具有非小细胞肺 癌的患者中产生了抗肿瘤效应(Alfonso S.等人,Cancer Biology& Therapy.2007,6:12,1847-1852)。用该疫苗发表的结果证明了其免 疫原性和安全性(Alfonso M.等人,Journal of Immunology.2002,168: 2523-2529)。

在膜的微结构域中的EGFR在肿瘤细胞生长的控制中发挥着非常 重要的作用。已经证明，在体内和在体外，GM3神经节苷脂在各种各 样的细胞系中抑制依赖于EGFR的增殖。GM3抑制EGFR的激酶活 性(EGFR的自磷酸化)。GM3神经节苷脂抑制EGFR的激酶结构 域的自磷酸化。GM3显示出这样的潜在能力，即变构地调节在通过 EGFR二聚体进行信号传导时无活性形式的结构转变，以阻止在配体 结合时细胞内激酶结构域的自磷酸化(Coskun.等人,PNAS.2011, 108:22,9044-9048)。在膜中神经节苷脂的组成的变化在EGFR的信 号转导的调节中是重要的(Zurita AR.等人,Biochem.J.2001,35: 465-472)。

在抗肿瘤疗法的同时或交替应用的医学实践中期望具有前景的结 果(Takeda K.等人,Cancer Sci.,2007,98:9,1297-1302)。但是，并 非所有的抗肿瘤疗法应用规划方案在实践中都给出了积极和协同的结 果。在其中使用抗-EGFR的单克隆抗体(西妥昔单抗)和抗血管内皮 生长因子的单克隆抗体(贝伐珠单抗)连同强有力的化学疗法用药方 案一起的III期的转移性结肠直肠癌临床试验中，癌症的发展恶化， 这还引起相比于仅接受“贝伐珠单抗+化学疗法”的患者而言更严重 的不良事件(Tol J.等人,N Engl J Med.2009,360:6,563-72)。在患 者中应用数种疗法的成功是在对于所述疗法所选择的靶之间的特殊功 能关系、肿瘤位置以及在每种情况下所应用的疗法的性质(抗体、疫 苗等)的结果。

现今，在文献中存在关于在肿瘤细胞中神经节苷脂与EGFR之间 的功能和结构关系的证据。然而，在同一个患者中应用针对EGFR和 神经节苷脂这些靶的疗法的成功之中实际牵涉这种关系既未在临床阶 段中，也未在临床前阶段中谈及。本发明的新颖性在于，首次在临床 前和在临床上证明了在共表达EGFR和NeuGcGM3这些靶的肿瘤中 源自应用抗-EGFR的疗法和抗-NeuGcGM3的疫苗的抗肿瘤活性的协 同增强。

发明描述

本发明涉及用于癌症的药物组合物，其特别地针对EGFR和N- 羟乙酰GM3神经节苷脂这些靶，目的是增强针对所述靶的疗法单独 所产生的治疗效果。在一个实施方案中，本发明包括其靶为N-羟乙酰 GM3的疫苗和针对EGFR的抗体。在另一个实施方案中，本发明包 括其靶为N-羟乙酰GM3的疫苗和其靶为EGFR的疫苗。

在本发明的另外的实施方案中，所述针对神经节苷脂该靶的疫苗 包括诸如下列的疫苗：疫苗NeuGcGM3/VSSP和/或抗独特型疫苗(佐 以氧化铝的雷妥莫单抗)。在另一个实施方案中，本发明包括抗-EGFR 的疗法例如尼妥珠单抗和/或针对EGFR的疫苗。

在另一个实施方案中，本发明包括用于在癌症的治疗中使用的组 合物，其包含针对EGF受体的化合物和针对NeuGcGM3神经节苷脂 的化合物。

在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含与药学上可接 受的赋形剂相混合的上面所描述的化合物中的任一种。

本发明的化合物可用作药物，并且可用于制备药物，包括用于治 疗诸如癌症之类的疾患的药物。

在另一个实施方案中，本发明的治疗组合物可用于治疗癌症，特 别是具有不同位置的人肿瘤。优选地，将本发明的治疗组合物用于治 疗其中同时表达EGFR和神经节苷脂的N-羟乙酰化变体的那些肿瘤。 最优选地，用于治疗肺肿瘤、乳腺肿瘤、消化器官肿瘤、泌尿生殖系 统肿瘤、肉瘤、源自神经外胚层组织的肿瘤和淋巴组织增生病症。

可以制备上面所描述的化合物的任何合适的制剂，以用于通过本 领域已知的方法来进行施用。基于所希望的施用途径和所施用的化合 物的物理特性，可以无需过度实验地实现有用的赋形剂或载体的选择。

根据由治疗患者的医生所决定的，可以使用任何合适的施用途径， 包括但不局限于：肠胃外、静脉内、肌内、透皮、局部和皮下。适合 于每种施用途径的制剂的制备是本领域已知的。

每种物质的制剂常常包含稀释剂，以及在一些情况下，佐剂、缓 冲液、防腐剂等。这些化合物还可以以脂质体或微乳状液的组合物进 行施用。

为了注射，所述制剂可以以常规形式来进行制备，例如：液体溶 液或悬浮液，或者适合于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。 合适的赋形剂包括例如：水、盐水溶液、右旋糖等。

可以单独地或与其他治疗试剂相组合地使用本发明的化合物。在 特别的实施方案中，本发明涉及与用于所治疗的肿瘤类型的常规化学 疗法和/或放射疗法的组合。

在另一个实施方案中，本发明还涉及在癌症的治疗中同时地、分 阶段地或交替地应用针对EGFR和N-羟乙酰GM3神经节苷脂这些靶 的疗法。

分开地，包括在不同的时刻和以不同的频率，施用针对EGFR的 化合物和针对N-羟乙酰GM3神经节苷脂该靶的化合物。这两种化合 物都可以通过已知的任何途径来进行施用，例如通过皮下、静脉内、 真皮内、肌内或腹膜内等途径。在许多实施方案中，至少一种，和任 选地所述两种治疗试剂可以通过肠胃外途径进行施用。

当将本发明的化合物或组合物与其他抗癌试剂相组合地进行使用 时，本发明提供了例如同时的、分阶段的或交替的治疗。因此，本发 明的化合物可以以分开的药物组合物同时地进行施用，并且其中本发 明的化合物可以在其他抗癌试剂之前或之后施用，例如以数秒钟、数 分钟、数小时、数天或数周的差异。

本发明提供了用于控制和/或抑制肿瘤增殖的方法，其包括以对于 控制或减少肿瘤增殖来说有效的量向有此需要的受试者施用在本文中 所描述的化合物的组合。在某些实施方案中，肿瘤增殖疾患与处于不 同临床阶段的肿瘤相关联，只要所述肿瘤共表达EGFR和N-羟乙酰 GM3。在一个特别的实施方案中，本发明涉及肺肿瘤、乳腺肿瘤、消 化器官肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤、肉瘤、源自神经外胚层组织的肿瘤 和淋巴组织增生病症。

本发明还包括用于在需要所述治疗的受试者中治疗癌症的方法， 其包括：向所述受试者施用治疗有效量的对于治疗所述紊乱来说有用 的针对EGFR的化合物，和以对于改善所希望的效果来说有效的量向 所述受试者施用NeuGcGM3疫苗或抗独特型疫苗。根据本发明的改 善涉及所述疾病的临床症状的部分或全部消退或者稳定化。在本发明 的另一个实施方案中，改善涉及减小肿瘤的大小和/或引起受试者的存 活率增加。

在某个实施方案中，本发明包括这样的方法，其包括第一的诱导 阶段和第二的维持阶段。在一个特别的实施方案中，诱导阶段包括以 在大约0.1至大约2mg的范围内的剂量向患者施用抗-EGFR的疫苗， 以可以在大约7天至大约14天的范围内的时间段，在大约8至14周 期间。在该时间段期间，以大约7至14天的间隔，以在大约0.1至大 约2mg的范围内的剂量向患者施用包含NeuGcGM3疫苗或抗独特型 疫苗的抗-NeuGcGM3神经节苷脂的疗法。

本发明包括这样的方法，其包括在大约6至10周的时间间隔期间 以在大约100至大约400mg的范围内的剂量向患者施用使用抗 -EGFR的被动疗法。在另一个实施方案中，针对EGFR的疗法包括 以大约7至14天的时间间隔，以在大约0.1至大约2mg的范围内的 剂量施用针对EGFR的疫苗。在该时间段期间，患者另外还以在大约 0.1至大约2mg的范围内的剂量接受NeuGcGM3疫苗或抗独特型疫 苗，以大约7至14天的时间间隔。

在另一个实施方案中，本发明的治疗方法的第二阶段包括这样的 治疗规划方案，其被设计用于其作为维持疗法进行施用，而不出现毒 性和/或疾病的临床症状。在维持阶段中，优选地以上面所描述的剂量 和以大约1至3个月的时间间隔施用所述疫苗。在另一个实施方案中， 以大约14天至大约3个月的间隔施用所述被动疗法。可以在大约1 至大约5年的范围内的时间段期间施行所述治疗规划方案。

在一些实施方案中，基本上同时地施用针对EGFR的治疗试剂和 NeuGcGM3疫苗或抗独特型疫苗。有时将针对EGFR的治疗试剂和 NeuGcGM3疫苗或抗独特型疫苗同时地用在受试者上。在一些实施方 案中，可以通过皮下、静脉内、真皮内、肌内或腹膜内途径来施用抗 -NeuGcGM3神经节苷脂的疗法，而通过皮下、静脉内或肌内途径来 施用抗-EGFR的疗法。在其他实施方案中，施用位点由输入淋巴结的 存在来确定。

在另一个实施方案中，在应用所述疗法期间，记录患者的某些生 物化学和成像学参数。优选地，通过使用患者的血液来分析细胞和体 液免疫。血液的抽取以可以从每周至每六个月的频率来进行。

如在本发明中所使用的，“共表达”是指，这两个靶均被表达， 但可以具有或不具有结构邻近关系；对于该定义的操作标准是，借助 于双重染色法、荧光显微镜的使用和允许图像叠加的处理机来测定 EGFR和N-羟乙酰神经节苷脂(NeuGcGM3)的表达。

如在本发明中所使用的，“共定位”是指，这两个靶在结构上邻 近；对于该定义的操作标准是，借助于双重染色法和共聚焦显微镜的 使用来测定EGFR和N-羟乙酰神经节苷脂(NeuGcGM3)的表达。

在另外一个实施方案中，本发明包括针对EGF受体的化合物和针 对NeuGcGM3神经节苷脂的化合物在制备用于按照治疗方案延缓患 者中肿瘤生长的药物中的用途，所述治疗方案包括：

(a)首先，向所述患者施用包含针对EGF受体的化合物的药物， 和

(b)随后，向同一个患者施用包含针对NeuGcGM3神经节苷脂的 化合物的药物。

所述施用可以以该顺序，或者以相反的顺序，其中首先向所述患 者施用包含针对NeuGcGM3神经节苷脂的化合物的药物，和随后向 同一个患者施用包含针对EGF受体的化合物的药物。

在一个特别的实施方案中，本发明包括用于共表达EGFR和 NeuGcGM3神经节苷脂这些靶的肿瘤的疗法的试剂盒，其中所述试剂 盒包含针对EGFR的化合物和针对NeuGcGM3神经节苷脂的其他化 合物的同时的、分阶段的或交替的施用。

在具有不同位置的人肿瘤中EGFR和N-羟乙酰神经节苷脂(NeuGcGM3)的共表达的测定

在肿瘤中EGFR和NeuGcGM3这些治疗靶的表达的测量可以通 过使用本领域中为此类目的而描述的方法中的任一种来进行。所述测 量在具有不同位置和起源的肿瘤中，在先前在福尔马林中固定的肿瘤 样品上或者在新鲜的组织切片上进行。在一个优选的实施方案中，通 过使用用于识别EGFR和GM3的N-羟乙酰化变体的免疫技术来进行 检测。特别地，可以使用免疫组织化学和明视场显微术来分开地免疫 识别这两种分子，或者使用免疫荧光和荧光显微术来测定共表达，或 者使用免疫荧光和共聚焦显微术来测定共定位。

在本发明的优选的实施方案中，可以通过使用在专利EP  0586002B1中所描述的单克隆抗体ior egf/R3m(5-20μg/ml)来检测 EGFR，和通过使用在专利EP 0972782B1或US 6,429,295中所描述的 单克隆抗体14F7m(5-25μg/ml)来检测NeuGcGM3。在本发明的一 个实施方案中，对于分开地免疫识别这两种分子(简单染色)，可以 使用Dako,LSAB^R System,Peroxidase,DAB(Dako,Carpinteria, California,USA)作为检测系统。

考虑到EGFR位于肿瘤细胞的细胞质膜上而N-羟乙酰GM3位于 膜中和细胞质内，因而当反应的强度等于或大于20％的阳性时，将可 认为该免疫识别是阳性的。

在一个优选的实施方案中，这两种分子的共表达可以通过使用双 重染色技术来进行检测并且可以用荧光显微术来进行分析，仅在其中 先前对于这两种分子的分开的免疫识别的结果为阳性的那些肿瘤样品 中。而这两种分子的共定位可以通过使用双重染色技术来进行检测并 且用共聚焦荧光显微术来进行分析。在一个优选的实施方案中，EGFR 的免疫识别通过下述方式来进行：与单克隆抗体ior egf/R3m(5-20 μg/ml)温育1小时，随后与缀合至罗丹明的IgG抗体(Dako, Carpinteria,California,USA)进行温育。在另一个优选的实施方案中， NeuGcGM3的免疫检测通过下述方式来进行：使用经生物素化的单克 隆抗体14F7(5-20μg/ml)，30分钟，随后为缀合至FITC的链霉抗 生物素蛋白(Dako,Carpinteria,California,USA)。

下面的实施例显示了本发明的优选的实施方案，并且因此用于举 例说明本发明，但无论如何不应当被认为是一种限制。

附图简述

图1.在不同的鼠类肿瘤中，将EGFR与NeuGcGM3神经节苷脂 共定位。在由路易斯表皮样癌诱导的肺转移中(A-C)和在鼠类骨髓 瘤P3-X63-Ag.8653中(D-F)EGFR和NeuGcGM3神经节苷脂的共 定位(C和F)。

图2.抗-EGFR的疗法(7A7Mab)与抗-NeuGcGM3神经节苷脂 的疫苗(NeuGcGM3/VSSP)一起的应用协同地增加了携带路易斯肺 癌的C57BL/6小鼠的存活率。

图3.在具有非小细胞肺癌的患者中，对于针对EGFR的被动疗 法(尼妥珠单抗)和抗-NeuGcGM3神经节苷脂的疫苗(雷妥莫单抗/ 氧化铝)的客观应答。

图4.在具有腹膜后-胰周的血管外皮细胞瘤的患者中，对于抗 -EGFR的疗法(尼妥珠单抗)和抗-NeuGcGM3神经节苷脂的疫苗 (NeuGcGM3/VSSP)的令人惊讶的临床应答。

实施例

实施例1：在不同的人肿瘤中EGFR和NeuGcGM3神经节苷脂的共表达的测量

将肿瘤样品在经缓冲的中性的福尔马林中进行固定，并通过石蜡 包埋技术进行处理，这是本领域技术人员已知的。将所获得的厚度为 5微米的组织切片在60℃下保持30分钟，脱石蜡，并且在一系列的逐 渐下降的酒精中进行再水化，在蒸馏水中保持10分钟并用TBS洗涤 5分钟。用商业溶液(Dako,Carpinteria,California,USA)将组织总 蛋白质的反应性封闭30分钟。通过使用单克隆抗体ior egf/R3m(20 μg/ml)1小时来免疫检测EGFR。NeuGcGM3的免疫识别通过使用单 克隆抗体14F7(20μg/ml)30分钟来进行。在一抗的反应后，在两种 情况下，均使用检测系统Dako,LSAB^R System,Peroxidase,DAB (Dako,Carpinteria,California,USA)。使组织切片脱水，并且使用 采用迈尔氏苏木精(Dako,Carpinteria,California,USA)的对比染色。 通过用洗涤溶液TBS(1X)代替一抗(单克隆抗体ior egf/R3m或单 克隆抗体14F7)来获得阴性对照，和使用输乳管癌作为阳性对照。

EGFR的免疫识别位于肿瘤细胞的细胞质膜上，和在细胞质内和/ 或在细胞的细胞质膜中检测到NeuGcGM3神经节苷脂。

双重染色法。检测EGFR，用单克隆抗体ior egf/R3m(抗-EGFR)， 接着与缀合有FITC的链霉抗生物素蛋白(Dako,Carpinteria, California,USA)一起进行温育。而检测NeuGcGM3，用经生物素化 的单克隆抗体14F7(抗-NeuGcGM3)，和随后用缀合有罗丹明的抗- 鼠类IgG抗体(Dako,Carpinteria,California,USA)。在肿瘤细胞中 这两种分子的共表达用在图像中的黄颜色来进行鉴定。组织切片借助 于与Olympus BX51荧光显微镜(Olympus,Japan)相连接的照相机 来进行分析和数字化。对于经数字化的图像的分析，使用图像处理机 ImageJ1.43u版。

表1显示了其中共表达EGFR和NeuGcGM3神经节苷脂的具有不同 位置的肿瘤。

强度：-阴性，+弱，++中等，+++强。

实施例2：在鼠类肿瘤模型中EGFR和NeuGcGM3神经节苷脂的共表达和共定位的测量

所使用的鼠类肿瘤模型为路易斯肺癌(3LL-D122)和骨髓瘤 P3-X63-Ag8.653(X63)。

为了测定共表达/共定位，进行双重染色。EGFR的免疫识别通过 下述方式来进行：与经生物素化的单克隆抗体7A7(20μg/ml)一起 温育1小时，随后与缀合至FITC的链霉抗生物素蛋白(Dako, Carpinteria,California,USA)一起进行温育。NeuGcGM3的免疫染 色通过下述方式来进行测定：与单克隆抗体14F7(20μg/ml)一起温 育30分钟，随后与缀合至罗丹明的抗-鼠类IgG抗体(Dako, Carpinteria,California,USA)一起进行温育。通过用洗涤溶液TBS (1X)代替一抗(单克隆抗体7A7或单克隆抗体14F7)来获得阴性 对照。共表达通过使用Olympus BX51荧光显微镜(Olympus,Japan) 来进行测定，并且对于经数字化的图像的分析，使用图像处理机 ImageJ1.43u版。共定位通过Flouview FV500共聚焦激光显微镜 (Olympus,Japan)来进行测定。

图1显示了在各种不同的鼠类模型的肿瘤样品中EGFR和 NeuGcGM3的共定位。用经生物素化的单克隆抗体7A7，随后用连接 至FITC的链霉抗生物素蛋白来鉴定EGFR。通过颜色的叠加，黄颜 色鉴定出了在鼠类模型的肿瘤细胞中这两种分子的共定位(C和F)。

实施例3：用疫苗NeuGcGM3/VSSP和单克隆抗体7A7进行治疗的携带路易斯肺癌的C57BL/6小鼠的存活率的测量

自发转移模型。在右足垫中给动物接种在0.05ml的体积中的2 ×10⁵个路易斯表皮样癌(3LL-D122)细胞，这相应于该实验方案的 第0天。在该实验的第3天，将动物随机分成4个实验组，每组10 只动物。在第24天，当肿瘤达到8-9mm的体积时，进行该原发性肿 瘤的外科手术。从第48天起，开始对动物的临床状态进行观察。存活 率的数据通过使用Log-rank检验(p<0.05)来进行分析，并且显示 在卡-迈曲线图中。结果包括3个有着相同条件的实验。

实验组：

没有治疗的对照(T)；

抗-EGFR的被动疗法：单克隆抗体7A7，通过静脉内途径，以在 200μl盐水溶液中的56μg的剂量，在第3、5、7、9、31、33和35 天；

抗-NeuGcGM3的主动疗法：疫苗NeuGcGM3/VSSP，通过皮下 途径，以在200μl中的200μg的剂量，在第7、21、35和47天；

按照对于第2和3组所描述的，抗-EGFR和抗-NeuGcGM3的疗 法的同时施用。

在图2a中显示了，在用路易斯肺癌诱导的肺转移的模型中，抗 -EGFR和抗-NeuGcGM3的疗法的同时施行(第4组)使动物的存活 率相比于其余实验组而言增加了60％。在实验结束后一周，处死存活 的动物(仅在第4组中)并取出肺。目视分析表明，仅一只动物显示 出两个肺转移，此外注意到其余动物的肺是正常的(图2b)。该结果 证明了在其中共定位EGFR和NeuGcGM3的该鼠类肿瘤模型中，所 研究的抗-EGFR和抗-NeuGcGM3的疗法的抗肿瘤活性的强大的协同 作用(参见实施例2)。

实施例4：经历了用抗体尼妥珠单抗和疫苗雷妥莫单抗/氧化铝进行的疗法的癌症患者的存活率的测量

考虑到在人肺肿瘤样品中EGFR和NeuGcGM3神经节苷脂这些 治疗靶的经常的共定位/共表达这样的发现(实施例1)，和在实施例 3中所显示的临床前证据，我们着手研究了在具有肺癌的患者中用抗 -EGFR的疗法(抗体尼妥珠单抗)和抗神经节苷脂的疗法(抗独特型 疫苗，雷妥莫单抗/氧化铝)进行的同时治疗，所述具有肺癌的患者已 经接受了关于每个肿瘤位置的标准疗法并且此外还已经遇到了疾病的 进展。

表2显示了在疫苗雷妥莫单抗(1E10/氧化铝)或其与尼妥珠单抗 的组合的扩大的(同情的)使用计划中的试验结果。在其中观察了具 有处于晚期阶段的(复发的和/或转移的)非小细胞肺癌(NSCLC) 的患者的存活率。要强调的是，患者为这样的患者，其已经接受了所 有的经建立的标准治疗路线，仅对于非癌特异性的姑息疗法易感，并 且在包括在该试验中的时刻遇到了疾病的进展。在同时接受针对所述 两个靶的疗法的患者组中，观察到在治疗两年时的总体存活率的显著 的增加，相比于仅接受单一疗法的那些而言。

表2.在治疗两年时，通过应用抗-EGFR的疗法(抗体尼妥珠单抗) 和抗神经节苷脂的疗法(抗独特型疫苗，雷妥莫单抗/氧化铝)增加了 具有非小细胞肺癌的患者的存活率。

图3显示了在具有NSCLC的患者中对于针对EGFR的被动疗法 (尼妥珠单抗)和抗-NeuGcGM3神经节苷脂的疫苗(雷妥莫单抗/氧 化铝)的客观应答，所述具有NSCLC的患者，如前面所提及的，已 经接受了所有的经建立的标准治疗路线，仅对于非癌特异性的姑息疗 法易感，并且在包括在该试验中的时刻遇到了疾病的进展。图3A显 示了在诊断时刻肿瘤的位置和扩展范围。在图3B中，指出了在应用 治疗两年时计算机辅助轴向体层摄影术(CAT)的结果，其中仅可以 用与肺气肿大泡相关的透明度增加的面积来评价成纤维细胞应答的面 积，并且未观察到肺肿瘤损伤。相同的放射学图像保持相等，直至3 年后。该结果显示了非常晚期的肿瘤的令人惊讶的完全缓解，作为该 疗法的结果。

实施例5：在经历了用抗体尼妥珠单抗和疫苗NeuGcGM3/VSSP进行的治疗的具有腹膜后-胰周的血管外皮细胞瘤的患者中的临床应答的测量

图4显示了对于放射疗法和化学疗法无应答的具有腹膜后-胰周 的血管外皮细胞瘤(软组织肿瘤)的患者的腹部的连续计算机辅助体 层摄影术。在这之中，在最初的诊断后18个月，应用抗-EGFR的疗 法(尼妥珠单抗)和抗神经节苷脂的疗法(疫苗NeuGcGM3/VSSP)。 患者具有在脐周区域中的强烈的疼痛和跳动的肿瘤块，以及超过15 公斤的体重丧失。图4A和4B相应于所述疗法开始的时刻；图4C和 4D相应于在三年后的评价。在应用治疗后三年，观察到疾病的稳定化， 因为在两个图像中，肿瘤块保持相同的大小。另外，在72个月的评价 中，患者保持着并入其工作寿命的优异的生活质量，具有肿瘤块减小 的倾向。总之，观察到作为对于所应用的治疗的应答的令人惊讶的临 床益处。

用在本发明中所描述的抗-EGFR和抗神经节苷脂的免疫疗法进 行治疗的癌症患者在长的治疗时间段期间显示出优异的耐受性(没有 重大的毒性)。该疗法有利于疾病的稳定化，提高生活质量，增加无 进展的时间和因此提高患者的总体存活率。所描述的疗法具有比传统 地在用抗-EGFR或抗神经节苷脂的单一疗法进行治疗的患者中所观 察的效果更好的效果。