利用无动物血清培养体系大规模扩增人外周血DNT细胞的方法

摘要

本发明涉及一种利用无动物血清培养体系大规模扩增人外周血DNT细胞的方法。包括以下步骤：1）采集人体外周血样品，2）体外分离纯化获得DNT细胞，3）体外培养DNT细胞，4）洗涤、收集DNT细胞，其特征在于：所述的步骤3）依次在培养瓶和培养袋中培养，采用无动物血清培养基，再加上1~10v%的AB血清、1~10v%的自体血浆或1~10v%的人血白蛋白中的一种或多种作为添加蛋白成分。本发明所述方法安全、高效、经济、可产业化、可用于临床应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用无动物血清培养体系大规模扩增人外周血DNT细胞的方法。 

背景技术

TCR⁺CD3⁺CD4^-CD8^-T（Double Negative T，DNT）细胞是近年来发现的一种具有独特调节功能的T细胞亚群。此类细胞具有独特的细胞表型（CD25⁺CD28loCD30⁺CD44^-）和细胞因子表达谱（IFN-r⁺、TNF-α⁺、IL-2^-、IL-4^-、IL-10^-、IL-13^-）。因此，DNT细胞在免疫调节、免疫抑制、自身免疫病、移植物抗宿主病、HIV感染以及抗肿瘤方面有重要作用。然而由于DNT细胞仅占外周血T淋巴细胞的1%~5%，并且缺少有效的方法进行体外扩增，使其研究较少。 

专利号为200680043116.7，专利名称为“扩增双阴性T细胞的方法”的中国专利中公开了一种扩增方法：包括(a)提供包括DNT细胞或者其前体的起始样品；(b) 从起始样品基本上去除CD8⁺和CD4⁺T细胞；(c)在包括能够刺激DNT细胞生长的试剂的培养基中用固定的T细胞促分裂原培养来自步骤(b)的样品；(d)洗涤步骤(c)中得到的细胞，并重悬于包括所述试剂但无T细胞促分裂原的培养基中；和(e)洗涤步骤(d)中得到的细胞，并重悬于包括所述试剂和可溶性 T 细胞促分裂原的培养基中。上述技术方案是基于实验室的科研方法及操作，其主要缺陷是培养基中添加动物血清，给临床应用带来潜在危险。DNT前期培养用6孔板或24孔板以及后期采用培养瓶扩增培养，其培养操作繁琐，细胞瓶占用空间大，操作耗时耗力，增加污染的几率，不适宜产业化；另外，其整个培养过程中繁琐的细胞收集、离心、洗涤等操作程序，也不适于产业化生产和管理的优化。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的不足而提供一种安全、高效、经济、可产业化、可用于临床应用的利用无动物血清培养体系大规模扩增人外周血DNT细胞的方法。 

本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：该利用无动物血清培养体系大规模扩增人外周血DNT细胞的方法依次包括以下步骤：1）采集人体外周血样品，2）体外分离纯化获得DNT细胞，3）体外培养DNT细胞，4）洗涤、收集DNT细胞，其特征在于：所述的步骤3）依次在培养瓶和培养袋中培养，采用无动物血清培养基，再加上1 ~10v%的AB血清、1 ~-10v%的自体血浆或1 ~10v%的人血白蛋白中的一种或多种作为添加蛋白成分。本发明采用培养瓶而不是24孔或6孔培养板作为起始培养材料，操作简易可控，减少污染的几率。采用细胞培养袋而不是细胞培养瓶来大规模扩增细胞，由此提高细胞扩增倍数、减少细胞培养空间，有利于产业化生产和管理。采用无动物血清培养基，由此避免了可能造成的种系间病原微生物污染及其它对细胞生长的不利因素，避免了可能带来的安全隐患。 

本发明所述的步骤3）中不收集、离心、洗涤细胞。本发明优化起始培养材料，合理选择培养基种类，因此在细胞扩增过程中无需采用传统的收集、离心、洗涤方式就能创造并维持细胞扩增的良好环境同时减少细胞损失，所以大大简略了细胞培养过程，节省人力、物力和时间，同时减少了细胞污染机会。 

本发明所述的步骤4）之后将收集到的DNT细胞加入0.9w%的生理盐水袋中，并添加100~1000 IU/ml的重组人白介素2和1 ~5v%的人血白蛋白。添加以上的成分，可大大提高细胞的稳定性，为细胞建立一个良好的细胞保存环境，有效保留细胞的杀瘤活性。 

本发明所述的步骤3）具体过程为： 

0~3天在培养瓶中培养，培养瓶已用1~10 μg/ml的抗人CD3单克隆抗体（克隆OKT3）包被，采用无动物血清培养基，添加50~200 单位/ml的庆大霉素、100~1000 IU/ml的重组人白介素2、1~5 ng/ml的重组人白介素4 、1~20ng/ml的重组人白介素7 、1~20 ng/ml的重组人白介素12、1 ~10v%的自体血浆和1 ~10v%的AB血清；

3~7天在培养瓶中培养，采用无动物血清培养基，添加50~200 单位/ml的庆大霉素、100~1000 IU/ml的重组人白介素2 、1~5 ng/ml的重组人白介素4 、1~20 ng/ml的重组人白介素7、1~20 ng/ml的重组人白介素12 、1 ~5v%的自体血浆和1 ~10v%的AB血清；

7~10天在培养瓶中培养，采用无动物血清培养基，添加50~200 单位/ml的庆大霉素、100~1000 IU/ml的重组人白介素2 、1~5 ng/ml的重组人白介素4 、50~200 ng/ml的可溶性抗人CD3 单克隆抗体、1~20 ng/ml的重组人白介素12、1 ~10v%的自体血浆和1 ~10v%的AB血清；

10~20天在培养袋中培养，采用无动物血清培养基，添加50~200 单位/ml的庆大霉素、100~1000 IU/ml的重组人白介素2、1~5 ng/ml的重组人白介素4、50~200 ng/ml的可溶性抗人CD3 单克隆抗体、1~20 ng/ml的重组人白介素12、1 ~10v%的人血白蛋白和1 ~10v%的AB血清。

本发明对细胞培养过程中各种成分，在0~3天、3~7天、7~10天以及10天以后四个培养时间段，培养基的选择以及所添加的细胞因子、自体血浆、异体血清，以及人血白蛋白的浓度组合和加入顺序作了摸索，获得了最佳培养工艺流程。 

本发明所述的无动物血清培养基为Life Technology 公司的AIM-V培养基、宝日医公司的GT-T551培养基、日本细胞科学研究所的ALyS505N培养基、德国Pan-biotech公司的 PANSERIN701培养基、美国LONZA公司的X-VIVO10培养基或美国LONZA公司的X-VIVO15培养基。上述培养基都是适合人T细胞培养，支持细胞高密度培养，具有很高的细胞成活率和扩增倍数，很高的杀伤活性，且无动物源成分，安全有效，适合于临床应用。 

本发明所述的0~7天，无动物血清培养基选用AIM-V培养基、X-VIVO10培养基或X-VIVO15培养基；10天~20天，无动物血清培养基选用PANSERIN701培养基、GT-T551培养基或ALyS505N培养基。在不同培养时间培养基的选择，经过实验比较其培养条件是最优的，可使细胞大量增殖，增强细胞杀伤活性，并节约成本。 

本发明所述的步骤4）中采用尖底离心瓶收集DNT细胞，接着离心处理，然后用0.9w%的生理盐水洗涤，最后再离心处理。以此去除培养基中含有的细胞因子、细胞碎片和抗生素等物质，避免回输后对人体产生的不良影响。 

本发明与现有技术相比具有以下优点： 

1、可用于临床应用的DNT细胞体外培养方法。

前面所述的DNT专利，涉及的DNT细胞扩增方法，都是基于实验室的科研方法及操作（添加动物血清且操作繁琐，不可用于临床应用）。本发明基于上述专利，经过多次的摸索及创新，形成DNT细胞体外培养的产业化工艺流程，适合于临床应用。 

2、大大简化细胞培养操作程序，有利于实现规范化、系统化生产。 

本发明所述工艺操作简单、步骤明确、重复性强、可控、出错率低，特别适宜于大规模产业化生产。 

3、最大程度提高细胞扩增倍数，不需要使用血细胞单采机。 

通过本发明方法可在体外高效活化和扩增自身DNT细胞。从30 ml 人外周血1×10⁷~4×10⁷ 单个核细胞开始，可获得8×10⁹~14×10⁹个经活化、扩增后的，以DNT细胞为主的免疫细胞（纯度≥70%）。这种约500倍的高效体外扩增工艺，避免了传统免疫细胞扩增方法中必需使用血细胞分离仪以获取大量起始外周血单个核细胞从而造成对机体免疫系统的破坏。 

4、确保整个培养体系无动物来源成分，提高产品的安全度。 

本发明整个培养体系全程使用无动物血清培养基，由此避免了可能造成的种系间病原微生物污染及其它对细胞生长的不利因素，避免了可能带来的安全隐患。 

5、选择不同无动物血清培养基，优化培养条件，节约成本。 

本发明生产工艺按细胞在不同生长阶段对培养基的不同需求，选择相应的无动物血清培养基，最大程度优化不同培养阶段的培养条件，节约生产成本，利于大规模产业化应用和推广。 

6、细胞制备工艺的标准化生产。 

本发明所述产品生产工艺可保证体外扩增后的DNT细胞获得数量和质量相对一致的产品，DNT细胞纯度大于70%，IFN-γ表达大于50%，有利于终产品质量标准的制定。 

附图说明

图1为本发明工艺流程图。 

图2为采用本发明实施例1所述方法对来自健康供体的DNT细胞的增殖曲线。 

5个健康供体经过20天的培养，从第7天开始，DNT细胞生长速度显著增加，呈对数生长，第20天DNT细胞的增殖倍数达到500倍左右。 

图3-A为本发明实施例1所述方法扩增DNT细胞不同时间点的纯度变化。 

5个健康供体经过20天的培养，在第10天DNT细胞纯度均值就达到85%，在第15天及第20天，DNT细胞纯度均达90%。 

图3-B是以一个健康供体为例，以本发明实施例1所述方法扩增DNT细胞不同时间点的纯度变化。 

在全血（Whole blood）中，DNT细胞即CD3⁺CD4^-CD8^-细胞比例仅为4.9%；第0天，经本发明方法分离纯化后，DNT细胞纯度即CD3⁺CD4^-CD8^-细胞的比例为12.3%；通过本发明方法的培养，在第7天，DNT细胞即CD3⁺CD4^-CD8^-细胞的比例高达84.6%；在第10天，DNT细胞即CD3+CD4-CD8-细胞的比例为86.2%；在第15天，DNT细胞即CD3⁺CD4^-CD8^-细胞的比例为90.6%；在第20天，DNT细胞即CD3⁺CD4^-CD8^-细胞的比例为91.5%。 

图4-A为本发明实施例1所述方法离体扩增的DNT细胞IFN-γ表达分析。 

5个健康供体经过20天的培养，在第15天IFN-γ百分比均值就达到74%，第20天，IFN-γ百分比均值高达87%左右。 

图4-B是以一个健康供体为例，以本发明实施例1所述方法离体扩增的DNT细胞IFN-γ表达分析。 

在第15天，DNT（CD3⁺）细胞中IFN-γ百分比为71.3%；在第20天，DNT（CD3⁺）细胞中 IFN-γ百分比为90.6%。本发明方法扩增的DNT细胞表达大量IFN-γ，有利于杀伤肿瘤细胞。 

图5为本发明实施例1所述方法离体扩增的DNT细胞对K562 及H1975细胞体外杀伤活性分析。 

2株人肿瘤细胞系，K562（人红白血病）和H1975(非小细胞性肺癌)。效应细胞是DNT细胞，采用CCK8细胞增殖抑制法检测。在96孔板中效应细胞按所示比例添加到1×10⁴个靶细胞/每孔中，3复孔。按照下列公式计算特异性杀伤率： 

杀伤率（%）＝[1－（实验孔均值－对应效应细胞孔均值）/靶细胞孔均值]×100%。

计算效应细胞数/靶细胞数（E/T）= 20:1、10:1、5:1、2.5:1时的杀伤活力，发现DNT细胞能够以剂量依赖方式非常有效的杀伤这些肿瘤细胞，即使在低效靶比（5：1）条件下DNT细胞也有很强的杀伤能力。 

具体实施方式

实施例1

人DNT细胞

1、采集人体外周血样品。

从健康供体收集30~60ml外周血到含肝素化管中。 

2、体外分离纯化 

按照厂商说明书，利用Rossettsep?试剂盒（Stem Cell Technologies Inc），通过与RBC的Rosetting去除CD4⁺、CD8⁺ T细胞。血液样品用抗人CD4和CD8去除鸡尾酒试剂标记，在室温下孵育20分钟，然后血液在50ml离心管与等体积Ficoll-Hypaque的密度梯度分层。在2500rpm离心25分钟后，在Ficoll和血浆的界面收集已去除PBMC中CD4⁺CD8⁺的细胞，即DNT细胞，用0.9%生理盐水洗涤1次。

3、体外培养DNT细胞。 

1）将步骤2获得的DNT细胞在75cm²培养瓶中以1~6×10⁶ 个/ml细胞在X-VIVO10培养基中37oC和5%CO₂培养3天，所述的培养瓶已用抗人CD3单克隆抗体（克隆OKT3 ）（ 10 μg/ml）包被，所述在X-VIVO10培养基包含了庆大霉素（ 60 单位/ml）、重组人白介素2（500 IU/ml）、重组人白介素4 （2 ng/ml）、重组人白介素7 （8 ng/ml）、重组人白介素12 （5 ng/ml）、自体血浆（5 v%）和AB血清（6 v%）。 

2）第3天传至另一个75cm²培养瓶，在相同条件以1~6×10⁶ 个/ml细胞在X-VIVO10培养基继续培养4天（75cm²培养瓶满可传至175cm²培养瓶），所述X-VIVO10培养基包含了庆大霉素（ 60 单位/ml ）、重组人白介素2 （ 500 IU/ml）、重组人白介素4 （2 ng/ml）、重组人白介素7 （8 ng/ml）、重组人白介素12 （5 ng/ml）、自体血浆（2 v%）和AB血清（ 6 v%）。 

3）第7天，在175cm²培养瓶传瓶，以1~6×10⁶ 个/ml细胞在X-VIVO10培养基继续培养3天，所述X-VIVO10培养基包含了庆大霉素（60 单位/ml）、重组人白介素2 （500 IU/ml）、重组人白介素4 （2 ng/ml）、可溶性抗人CD3 单克隆抗体（ 50 ng/ml）、重组人白介素12（ 5 ng/ml ）、 自体血浆（ 5 v% ）和AB血清（6 v%）。 

4）第10天2个175cm²培养瓶入袋培养，以1~6×10⁶ 个/ml细胞在ALyS505N培养基中继续培养至第20天,所述ALyS505N培养基包含了庆大霉素（ 60 单位/ml）、重组人白介素2 （500 IU/ml）、重组人白介素4 （2 ng/ml）、可溶性抗人CD3 单克隆抗体（50 ng/ml）、重组人白介素12（5 ng/ml）、人血白蛋白（5 v%）和AB血清（6 v%）。 

4、洗涤、收集DNT细胞。 

第20天，收获DNT细胞，用250ml尖底离心瓶收集细胞，离心，用0.9w%生理盐水洗涤，离心。 

5、制成DNT细胞制剂。 

将步骤4之后收集到的DNT细胞加入100ml的0.9w%的生理盐水袋中，并添加500 IU/ml的重组人白介素2和2 v%的人血白蛋白。 

实施例2

人DNT细胞

1、采集人体外周血样品。

从健康供体收集30~60 ml外周血到含肝素化管中。 

2、体外分离纯化 

按照厂商说明书，利用Rossettsep?试剂盒（Stem Cell Technologies Inc），通过与RBC的Rosetting去除CD4⁺、CD8⁺ T细胞。血液样品用抗人CD4和CD8去除鸡尾酒试剂标记，在室温下孵育20分钟，然后血液在50ml离心管与等体积Ficoll-Hypaque的密度梯度分层。在2500rpm离心25分钟后，在Ficoll和血浆的界面收集已去除PBMC中CD4⁺CD8⁺的细胞，即DNT细胞，用0.9%生理盐水洗涤1次。

3、体外培养DNT细胞。 

1）将步骤2获得的DNT细胞在75cm²培养瓶中以1~6×10⁶ 个/ml细胞在AIM-V培养基中37oC和5%CO₂培养3天，所述的培养瓶已用抗人CD3单克隆抗体（ 克隆OKT3 ）（8 μg/ml）包被，所述在AIM-V培养基包含了庆大霉素（ 60  单位/ml）、重组人白介素2（200  IU/ml）、重组人白介素4 （1 ng/ml）、重组人白介素7 （2 ng/ml）、重组人白介素12 （10 ng/ml）、自体血浆（5 v%）和AB血清（6 v%）。 

2）第3天传至另一个75cm²培养瓶，在相同条件以1~6×10⁶ 个/ml细胞在AIM-V培养基继续培养4天（75cm²培养瓶满可传至175cm²培养瓶），所述AIM-V培养基包含了庆大霉素（ 60 单位/ml ）、重组人白介素2 （ 200 IU/ml）、重组人白介素4 （1 ng/ml）、重组人白介素7 （2 ng/ml）、重组人白介素12 （10 ng/ml）、自体血浆（2 v%）和AB血清（ 6 v%）。 

3）第7天，在175cm²培养瓶传瓶，以1~6×10⁶ 个/ml细胞在AIM-V培养基继续培养3天，所述AIM-V培养基包含了庆大霉素（60 单位/ml）、重组人白介素2 （200 IU/ml）、重组人白介素4 （1 ng/ml）、可溶性抗人CD3 单克隆抗体（ 120 ng/ml）、重组人白介素12（ 10 ng/ml ）、 自体血浆（ 5 v% ）和AB血清（6 v%）。 

4）第10天2个175cm²培养瓶入袋培养，以1~6×10⁶ 个/ml细胞在GT-T551培养基中继续培养至第20天,所述GT-T551培养基包含了庆大霉素（ 60 单位/ml）、重组人白介素2 （200 IU/ml）、重组人白介素4 （1 ng/ml）、可溶性抗人CD3 单克隆抗体（120 ng/ml）、重组人白介素12（10 ng/ml）、人血白蛋白（5 v%）和AB血清（6 v%）。 

4、洗涤、收集DNT细胞。 

第20天，收获DNT细胞，用250ml尖底离心瓶收集细胞，离心，用0.9w%生理盐水洗涤，离心。 

5、制成DNT细胞制剂。 

将步骤4之后收集到的DNT细胞加入100ml的0.9w%的生理盐水袋中，并添加500 IU/ml的重组人白介素2和2 v%的人血白蛋白。 

实施例3

人DNT细胞

1、采集人体外周血样品。

从健康供体收集30~60 ml外周血到含肝素化管中。 

2、体外分离纯化 

按照厂商说明书，利用Rossettsep?试剂盒（Stem Cell Technologies Inc），通过与RBC的Rosetting去除CD4⁺、CD8⁺ T细胞。血液样品用抗人CD4和CD8去除鸡尾酒试剂标记，在室温下孵育20分钟，然后血液在50ml离心管与等体积Ficoll-Hypaque的密度梯度分层。在2500rpm离心25分钟后，在Ficoll和血浆的界面收集收集已去除PBMC中CD4⁺CD8⁺的细胞，即DNT细胞，用0.9%生理盐水洗涤1次。

3、体外培养DNT细胞。 

1）将步骤2获得的DNT细胞在75cm²培养瓶中以1~6×10⁶ 个/ml细胞在AIM-V培养基中37oC和5%CO₂培养3天，所述的培养瓶已用抗人CD3单克隆抗体（克隆 OKT3 ）（ 5 μg/ml）包被，所述在AIM-V培养基包含了庆大霉素（ 60 单位/ml）、重组人白介素2（1000  IU/ml）、重组人白介素4 （4 ng/ml）、重组人白介素7 （15 ng/ml）、重组人白介素12 （15 ng/ml）、自体血浆（5 v%）和AB血清（6 v%）。 

2）第3天传至另一个75cm²培养瓶，在相同条件以1~6×10⁶ 个/ml细胞在AIM-V培养基继续培养4天（75cm²培养瓶满可传至175cm²培养瓶），所述AIM-V培养基包含了庆大霉素（ 60 单位/ml ）、重组人白介素2 （ 1000 IU/ml）、重组人白介素4 （4 ng/ml）、重组人白介素7 （15 ng/ml）、重组人白介素12 （15 ng/ml）、自体血浆（2 v%）和AB血清（ 6 v%）。 

3）第7天，在175cm²培养瓶传瓶，以1~6×10⁶ 个/ml细胞在AIM-V培养基继续培养3天，所述AIM-V培养基包含了庆大霉素（60 单位/ml）、重组人白介素2 （1000 IU/ml）、重组人白介素4 （4 ng/ml）、可溶性抗人CD3 单克隆抗体（ 150 ng/ml）、重组人白介素12（ 15 ng/ml ）、 自体血浆（ 5 v% ）和AB血清（6 v%）。 

4）第10天2个175cm²培养瓶入袋培养，以1~6×10⁶ 个/ml细胞在ALyS505N培养基中继续培养至第20天,所述ALyS505N培养基包含了庆大霉素（ 60 单位/ml）、重组人白介素2 （1000 IU/ml）、重组人白介素4 （4 ng/ml）、可溶性抗人CD3 单克隆抗体（150 ng/ml）、重组人白介素12（15 ng/ml）、人血白蛋白（5 v%）和AB血清（6 v%）。 

4、洗涤、收集DNT细胞。 

第20天，收获DNT细胞，用250ml尖底离心瓶收集细胞，离心，用0.9w%生理盐水洗涤，离心。 

5、制成DNT细胞制剂。 

将步骤4之后收集到的DNT细胞加入100ml的0.9w%的生理盐水袋中，并添加500 IU/ml的重组人白介素2和2 v%的人血白蛋白。 

本发明所采用的培养基不局限于上述实施例中的公开范围，一般比较优选的无动物血清培养基为Life Technology 公司的AIM-V培养基、宝日医公司的GT-T551培养基、日本细胞科学研究所的ALyS505N培养基、德国Pan-biotech公司的 PANSERIN701培养基、美国LONZA公司的X-VIVO10培养基或美国LONZA公司的X-VIVO15培养基，这些培养基可以组合使用，更优选的方案是在0-7天选用AIM-V培养基、X-VIVO10培养基或X-VIVO15培养基，10天~20天选用PANSERIN701培养基、GT-T551培养基或ALyS505N培养基。 

无动物血清培养基中的蛋白成分不局限于上述实施例中的公开范围，一般可以添加整个培养基1~10v%的AB血清或1~10v%的自体血浆或1~10v%的人血白蛋白，上述三种成分可以单一的添加也可以两种或三种组合添加。 

无动物血清培养基的具体配方也不局限于上述实施例中的公开范围，一般比较优选的配方为：0~3天采用的无动物血清培养基，培养瓶已用1~10 μg/ml的抗人CD3单克隆抗体（克隆OKT3）包被，添加50~200 单位/ml的庆大霉素、100~1000 IU/ml的重组人白介素2、1~5 ng/ml的重组人白介素4 、1~20ng/ml的重组人白介素7 、1~20 ng/ml的重组人白介素12、1 ~10v%的自体血浆和1 ~10v%的AB血清。 

3~7天采用的无动物血清培养基，添加50~200 单位/ml的庆大霉素、100~1000 IU/ml的重组人白介素2 、1~5 ng/ml的重组人白介素4 、1~20 ng/ml的重组人白介素7、1~20 ng/ml的重组人白介素12 、1 ~5v%的自体血浆和1 ~10v%的AB血清。 

7~10天采用的无动物血清培养基，添加50~200 单位/ml的庆大霉素、100~1000 IU/ml的重组人白介素2 、1~5 ng/ml的重组人白介素4 、50~200 ng/ml的可溶性抗人CD3 单克隆抗体、1~20 ng/ml的重组人白介素12、1 ~10v%的自体血浆和1 ~10v%的AB血清。 

10~20天采用的无动物血清培养基，添加50~200 单位/ml的庆大霉素、100~1000 IU/ml的重组人白介素2、1~5 ng/ml的重组人白介素4、50~200 ng/ml的可溶性抗人CD3 单克隆抗体、1~20 ng/ml的重组人白介素12、1 ~10v%的人血白蛋白和1 ~10v%的AB血清。 

虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。