一种3-脱氢奎尼酸合成酶突变体及其基因和应用

摘要

本发明公开了一种3-脱氢奎尼酸合成酶突变体及其基因和应用。该3-脱氢奎尼酸合成酶突变体是将如序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的蛋白质的第153位、第175位、第177位和第336位氨基酸经过取代为一个氨基酸且具有3-脱氢奎尼酸合成酶活性的由其衍生的蛋白质。本发明的重组3-脱氢奎尼酸合成酶大幅提高了原始出发酶的活性，能够大大提高莽草酸途径中莽草酸的产量。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种3-脱氢奎尼酸合 成酶突变体及其基因和应用。

背景技术

莽草酸（Shikimic acid,SA），化学名为3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸。 它是合成芳香族氨基酸、生物碱、吲哚衍生物及手性药物的前体，其自身具 有镇痛、抗炎及抗血栓形成的作用。

莽草酸的制备方法主要包括：植物提取法、化学合成法和生物合成法。 植物提取法主要是从八角茴香的果实中分离获得莽草酸。虽然八角茴香中的 莽草酸含量高达10%以上，但是八角茴香属于木兰科东方小型树种，仅分布 在全球极少数地区，其生长受温度、湿度和土壤等自然环境的影响较大，导 致植物提取法的产量远远无法满足日益增加的需求。化学合成莽草酸虽有多 种途径，但均工艺复杂且产率不高，如Diels-Alder和逆Diels-Alder反应合 成法的产率都只有15%左右。生物合成法主要是以经过传统诱变和分子育种 获得的重组菌为生产菌株，以葡萄糖等为原料，通过发酵培养合成莽草酸。 3-脱氢奎尼酸合成酶是微生物体内莽草酸合成途径的关键酶之一，其酶活性 的高低与莽草酸产量密切相关。

蛋白质分子定向进化技术，是蛋白质工程的新策略，主要是利用分子 生物学手段在体外改造酶的基因，产生基因多样性，然后结合灵敏的筛选技 术，迅速得到理想的突变体，最终定向选择有价值的非天然酶。其核心技术 为突变体文库构建技术及高通量筛选方法。基于目前植物提取法和化学合成 法均不能满足莽草酸日益增长的需求，而生物合成法产量也不够理想的情况 下，有必要通过基因工程手段对莽草酸的生物合成途径进行研究和改造，以 达到高产莽草酸的目的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的生物合成法中3-脱氢奎 尼酸合成酶活性不够高而导致莽草酸产量不高的缺陷，提供一种3-脱氢奎尼 酸合成酶突变体及其基因和应用。

本发明中利用易错PCR技术对大肠杆菌（Escherichia coli）W3110的 3-脱氢奎尼酸合成酶进行定向改造，并利用对营养缺陷型宿主的基因功能回 补进行高通量筛选，进而考察突变体基因的表达并测定突变体酶活性，最终 获得酶活性显著提高的突变体。

本发明提供的技术方案之一是：一种分离的蛋白质，所述分离的蛋白质 是将如序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的蛋白质的第153位、第175 位、第177位和第336位氨基酸经过取代为一个氨基酸且具有3-脱氢奎尼酸 合成酶活性的由其衍生的蛋白质。

本发明中，所述的分离的蛋白质具有3-脱氢奎尼酸合成酶活性，其为重 组3-脱氢奎尼酸合成酶。较佳地，所述分离的蛋白质为将如序列表中SEQ ID  No:1所示氨基酸序列的蛋白质的第153位的甲硫氨酸突变为苏氨酸 (M153T)；所述氨基酸序列中第175位的脯氨酸突变为苏氨酸(P175T)；所述 氨基酸序列中第177位的谷氨酸突变为甘氨酸(E177G)；所述氨基酸序列中 第336位的亮氨酸突变为丝氨酸(L336S)所得的蛋白质。

本发明中，所述分离的蛋白质的制备方法为本领域的常规制备方法。所 述制备方法较佳地为：从自然界中天然存在的蛋白质中分离获得，从重组表 达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所 述制备方法更佳地为：将编码所述蛋白质的核酸分子克隆到重组载体中，将 所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表 达转化体，即可分离纯化获得所述蛋白质。

本发明提供的技术方案之二是：一种分离的核酸，所述核酸是编码上述 分离的蛋白质的核酸分子。

其中所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，所述制备方法较佳 地包括：从自然界中提取天然存在的编码上述分离的蛋白质的核酸分子，通 过基因克隆技术获得编码上述分离的蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序 列合成的方法得到编码上述分离的蛋白质的核酸分子。

如本领域技术人员所知：编码上述分离的蛋白质的核酸分子的碱基序列 可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系 物。所述的多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该分离的蛋白质的核酸分子 的碱基序列的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来 制得。

本发明提供的技术方案之三是：一种包含上述核酸的重组表达载体。

其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述 的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规 的各种载体。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等， 本发明所述载体优选Novagen公司的质粒pETDuet-1。

本发明提供的技术方案之四是：一种包含上述重组表达载体的重组表达 转化体。

其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为：将上述重组表达载体转 化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主 微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的编码 所述的分离的蛋白质的基因能够被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳 地为：大肠杆菌(E.coli)，更佳地为大肠杆菌BL21(DE3)。将前述重组表达 质粒转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株。其中 所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转 法。

本发明提供的技术方案之五是：一种重组3-脱氢奎尼酸合成酶的制备方 法，其中包括如下步骤：培养上述的重组表达转化体，从培养物中获得重组 3-脱氢奎尼酸合成酶。

其中所述制备方法较佳地为：将上述重组大肠杆菌接种至LB培养基， 37℃振荡培养过夜后，按1%的接种量接种至LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀值达到0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5mM，诱导培养4h后，将菌液于 12000r/min下离心5min，弃上清得到菌体，然后用10mM磷酸甘油盐溶液 （含0.25mM CoCl₂，0.5mM NAD⁺，pH6.6）按1.5ml/g菌体的比例重悬菌 体，菌悬液于冰浴中超声破碎，12000r/min4℃下离心20min，取上清，上 清液用10mM磷酸钾溶液（含0.25mM CoCl₂，pH6.6）于4℃下透析24h 后，即可得到高效表达的重组3-脱氢奎尼酸合成酶。

本发明提供的技术方案之六是：上述分离的蛋白质或上述重组表达转化 体在生产莽草酸中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发 明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

随着流感病毒亚型的连续爆发，莽草酸作为合成抗流感特效药“达菲” 的主要原料变得供不应求。本发明的重组3-脱氢奎尼酸合成酶具有3-脱氢奎 尼酸合成酶的活性，是生物合成莽草酸途经中的关键酶。本发明的重组3- 脱氢奎尼酸合成酶大幅提高了原始出发酶的活性，其酶活性较野生型3-脱氢 奎尼酸合成酶提高了30%，从而能够大大提高莽草酸生物合成途径中莽草酸 的产量。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1为M9固体平板上3-脱氢奎尼酸合成酶（aroB）基因缺失及回补对 菌体生长的影响，其中，1：大肠杆菌BL21（DE3）；2～4：aroB基因缺失 型大肠杆菌BL21（DE3）；5～8：利用质粒pETDuet-aroB进行基因功能回 补的aroB基因缺失型大肠杆菌BL21（DE3）。

图2为aroB基因缺失型大肠杆菌BL21（DE3）表达aroB基因突变体的 SDS-PAGE电泳图，M：蛋白质分子量标准（宽）；1～6：含有质粒pETDuet-aroB 的aroB基因缺失型大肠杆菌BL21（DE3）；7：aroB基因缺失型大肠杆菌 BL21（DE3）。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明对大肠杆菌（Escherichia coli W3110）3-脱氢奎尼酸合成酶基因 （该基因名称：aroB，其在GenBank中的登录号为12930302）进行定向进 化，利用易错PCR技术构建3-脱氢奎尼酸合成酶基因突变体文库，并以3- 脱氢奎尼酸合成酶营养缺陷型菌株为宿主通过基因功能回补对其基因突变 体文库进行筛选，进而考察生长良好的突变体的基因表达量和酶活性，最终 获得一株酶活性显著提高的突变体。

下述实施例中所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

实施例13-脱氢奎尼酸合成酶基因的突变体文库的构建

（1）设计用于易错PCR扩增3-脱氢奎尼酸合成酶基因的引物，上游引 物B1（如SEQ ID No:2所示）的序列为 5’-AAAACCATGGAGAGGATTGTCGTTACTCTCGG-3’，下游引物B2（如 SEQ ID No:3所示）的序列为 5’-GACAAAGCTTACGCTGATTGACAATCGGCAAT-3’，分别含有Nco I和 Hind III酶切位点。

（2）以大肠杆菌W3110（购自E.coli Genetic Stock Center，Yale  University，即耶鲁大学大肠杆菌保藏中心）的基因组为模板，利用引物B1 和B2在Taq DNA聚合酶的催化下进行PCR扩增，获得3-脱氢奎尼酸合成 酶基因片段，琼脂糖凝胶回收第一轮易错PCR获得的基因片段，并以其为 模板进行第二轮易错PCR。PCR反应体系（20μl）如下：Taq DNA聚合酶 （5U）0.2μl，染色体基因模板0.5μl，Mg²⁺（25mM）4μl，Mn²⁺（5mM） 0.4μl，dATP（10mM）0.4μl，dTTP（10mM）2μl，dGTP（10mM）0.4μl， dCTP（10mM）2μl，上游引物B1（20μM）0.5μl，引物B2（20μM）0.5μl， 10×PCR缓冲液（不含Mg²⁺）2μl，ddH₂O7.1μl，以上试剂均购自上海捷瑞 生物工程有限公司。扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s，58℃ 退火40s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃再延伸10min。

（3）用Nco I和Hind III对经两轮易错PCR扩增的3-脱氢奎尼酸合成 酶基因片段和载体pETDuet-1（Novagen公司）进行双酶切，琼脂糖凝胶电 泳回收目的片段，利用T4连接酶（TaKaRa公司）于16℃过夜连接，连接 产物转化3-脱氢奎尼酸合成酶基因缺陷型菌株（构建过程见实施例2）并涂 布于含有100mg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养12～16h，待单 菌落长出后，将平板放于4℃保藏备用。

实施例23-脱氢奎尼酸合成酶基因突变体文库的筛选

（1）3-脱氢奎尼酸合成酶基因缺陷型菌株的构建

将表达Red重组酶的质粒pKD46（购自耶鲁大学大肠杆菌保藏中心，该 质粒信息在文献Baba T,Ara T,Hasegawa M,et al.Construction of Escherichia  coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection Mol Syst  Biol2006:2-8中有披露）导入E.coli BL21(DE3)，在含有100mg/mL氨苄青霉 素的LB固体平板上筛选转化子（培养温度为30℃）。将转化子接种LB液体培 养基，30℃200r/min下振荡培养，当菌体OD₆₀₀达到0.2时加入1mM L-阿拉 伯糖诱导表达Red重组酶，诱导时间不少于1h，OD₆₀₀约为0.6时收获菌体， 制备感受态细胞。利用电转化法将用于同源重组的片段导入感受态细胞内。 用于同源重组的片段是以BR1（5’-GCGGCTCTGTGAAATCCC-3’）和BR2 （5’-GTTGTTGACCATCCGTTGC-3’）为引物（BR1和BR2的序列分别如 SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示），以大肠杆菌3-脱氢奎尼酸合成酶突变株 E.coli JW3352-1（购自耶鲁大学大肠杆菌保藏中心，该菌株信息在文献Baba  T,Ara T,Hasegawa M,et al.Construction of Escherichia coli K-12in-frame, single-gene knockout mutants:the Keio collection Mol Syst Biol2006:2-8中有 披露）的基因组为模板获得的含有卡那霉素抗性的PCR片段。然后，迅速向 电转后的感受态细胞中加入1ml LB培养基，30℃培养1h后升温42℃继续培养 1h，取适量培养后的菌液涂布含有25mg/mL卡那霉素的LB固体平板。次日， 通过点种试验选择具有卡那霉素抗性但不具有氨苄青霉素抗性的转化子，以 菌落PCR的方法验证3-脱氢奎尼酸合成酶基因的缺失，并测序。测序结果表 明3-脱氢奎尼酸合成酶基因缺陷型菌株构建成功。

（2）3-脱氢奎尼酸合成酶基因突变体文库的筛选

3-脱氢奎尼酸合成酶基因缺失将导致宿主菌成为营养缺陷型菌株，因 此，可在基本培养基上，以该营养缺陷型菌株为宿主，通过3-脱氢奎尼酸合 成酶基因功能回补实验，对突变体文库进行筛选，从而获得依然具有酶功能 的突变体（图1）。将实施例1中获得的所有单菌落点种M9固体培养基（基 本培养基），37℃下静置培养24h，选取在M9固体培养基上可以生长的菌 落。M9培养基（1L）：5×M9盐溶液200ml，20%葡萄糖20ml，1M MgSO₄2ml，1M CaCl₂0.1ml，琼脂15g。5×M9盐溶液（1L）：磷酸氢二钠（十二 水）75g，磷酸氢二钾15g，氯化钠2.5g，氯化铵5g，用去离子水定容 体积至1L，调节pH至7.4，高压灭菌20min备用。

实施例33-脱氢奎尼酸合成酶基因突变体的表达

将实施例2中M9固体培养基上生长的突变体菌株接种至装有20ml种 子培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养过夜后，按1%接种量接种至新 鲜LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀约为0.6时，加入IPTG至终浓度为1mM， 继续诱导培养4h后将菌液于12000r/min下离心5min，弃上清，菌体用于 SDS-PAGE检测。结果如图2所示，与7号宿主菌相比，1～6号菌株表达了 38kDa的目的蛋白，其表达量较高。

实施例43-脱氢奎尼酸合成酶基因突变体的酶活测定

参照文献（Frost J W,Bender J L,Kadonaga J T,et al.Dehydroquinate  synthetase from Escherichia coli:purification,cloning,and construction of  overproducers of the enzyme.Biochemistry,1984,23(19):4470-4475.）中的方法 进行酶活测定。按照实施例3中的方法收集菌体，用10mM磷酸甘油盐溶 液（含0.25mM CoCl₂,0.5mM NAD⁺,pH6.6）按1.5ml/g菌体的比例重悬菌 体，菌悬液于冰浴中超声破碎，12000r/min4℃下离心20min，取上清。上 清液用10mM磷酸钾溶液（含0.25mM CoCl₂,pH6.6）于4℃下透析24h 后即为粗酶液，用于酶活力测定。2mL酶活测定体系中含有100μM磷酸钾 缓冲液（pH7.4），0.5μM DAHP，0.2μM CoCl₂，0.02μM NAD⁺以及适量粗 酶液，反应温度为37℃（参考自文献Srinivasan PR,Rothschild J,Sprinson DB. The enzymic conversion of3-deoxy-D-arabino-heptulosonic acid7-phosphate to  5-dehydroquinate[J].J Biol Chem,1963,238(10):3176-3182）。反应0min和 30min的反应液各取0.5mL，分别加入0.2mL10%三氯乙酸以沉淀蛋白， 离心取上清，加入显色液2mL，测定548nm处的吸光度，计算差值。酶活 力单位：在上述反应条件下，反应体系中1min内使DAHP减少1μM的酶 量。

酶活测定结果表明3号突变体的酶活性较野生型的酶活性提高了30%。 将该突变体接种LB液体培养基，37℃200r/min下过夜培养，提取质粒，以 上游引物P1（5’-ATGCGTCCGGCGTAGA-3’）和下游引物P2 （5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’）进行测序（P1和P2的序列分别如 SEQ ID No:6和SEQ ID No:7所示），结果表明其突变位点为M153T、P175T、 E177G和L336S。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发 明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。