鉴定双翅目昆虫的分子生物学方法

摘要

本发明属于分子生物学领域，具体的说是一种鉴定双翅目昆虫的分子生物学方法，该方法提取总DNA；利用DNA条形码通用引物扩增双翅目昆虫的线粒体COI基因前段序列作为标记；并进行物种鉴别的序列特征比对，从而进行物种鉴定。本发明方法能对桔小实蝇、果蝇和丽蝇三种害虫不同生物型以及幼虫或残缺个体进行鉴定，具有准确、迅速、便捷和费用低的特点，相比传统的形态特征鉴定方法，节省了时间也降低费用；本方法对使用的仪器设备要求较低，一般的分子生物学实验室均可进行，比传统的形态学鉴别更准确可靠，并从根本上解决了当前桔小实蝇、果蝇和丽蝇幼虫在检疫过程中较难进行准确鉴定的难题，填补了行业空白，具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体的说是一种鉴定双翅目昆虫的分子生物学方法。

背景技术

桔小实蝇(Bactrocera dorsalis Hendel)是一种世界危害性检疫害虫，该虫寄 主范围较广，能取食香蕉，柑橘，杨桃，番石榴，芒果，茄子，辣椒等46个科250多 种水果和蔬菜。该物种主要以幼虫为害，成虫产卵于果皮下，幼虫孵化后靠取食果肉 发育，被危害的果实会出现腐烂和未熟先黄脱落的症状，严重影响各种水果果实的质 量和品质，甚至失去食用价值。由于该虫具有寄主范围广，繁殖力高，适应能力强， 危害性大的特点，给果蔬业和花卉业造成严重的经济损失，许多国家都将其列为重点 检疫对象，在中国桔小实蝇被列为二类检疫性害虫。

果蝇英文俗名fruit fly或vinegar fly，广泛存在于全球温带及热带气候区， 由于其主食为腐烂的水果，因此在人类的栖息地内如果园、菜市场等地区内皆可见其 踪迹，与桔小实蝇一样，主要以幼虫为害，成虫产卵于果皮下，幼虫孵化后靠取食果 肉发育。除了南北极外，目前至少有1000个以上的果蝇物种被发现，大部分的物种以 各种腐烂的水果或植物体为食，少部分则只取用真菌，树液或花粉为其食物。对水果 的危害主要见于使得樱桃等很多水果种类快速腐烂，从而造成经济损失。

丽蝇是属于双翅目丽蝇科。成虫除在肉、鱼、腐肉上产卵外，也可在人、畜的伤 口内产卵，引起蝇蛆症。这种习性常为偶然现象，但在有些种类中则为固有的特性。 一般卵生，少数蚴虫，即产生活的幼虫，繁殖数量极大。对人体有危害，除了造成骚 扰外，部分种类具医学上的重要性，例如大头金蝇可机械性地传播肠道传染病，蛆症 金蝇是专性蝇蛆症的病原昆虫，引起人畜的蝇蛆症，在经济上有重要意义。丽蝇是芒 果重要的授粉昆虫，农民会以无食用价值的鱼头等，吸引丽蝇前来产卵，并为其授粉， 以增加产量。由于引致人类及动物蝇蛆病的成因主要是来自狂蝇总科、丽蝇及麻蝇科， 故此丽蝇很多成为治疗此病的研究对象。单单铜绿蝇在澳大利亚每年就造成超过1.7 亿美元的经济损失。在人类发生的蝇蛆病主要分类6种：皮肤及皮下、面部、伤口或 创伤、胃肠道、阴道及一般的蝇蛆病。蝇蛆病的幼虫一般都是在一龄阶段。现时唯一 的治疗方法是清除蛆虫，让病人自行康复。

由于桔小实蝇、果蝇和丽蝇同属双翅目昆虫，其卵、幼虫和蛹很难鉴定；传统的 物种鉴别主要依赖于专业的昆虫分类学家花费大量时间和精力整理积累后所描述的形 态特征，存在较大的局限性，不仅费时费力，而且常受主观因素干扰，极易混淆出错。 其次，传统的鉴别方法难以展开针对三种幼虫或残缺个体的鉴别。

快速而准确的物种鉴定是科学经济的防治害虫的必要前提和基础。由于我国大部 分地区农业生产均采取间混套作(intercropping/interplanting)模式，且桔小实蝇 具有寄主范围广，繁殖力高的特点，使得这三种害虫常常得以同域混合发生。因此有 必要寻找一些快捷、准确鉴别这三种害虫的分子生物学方法，从而应用于检疫和及时 有效地控制其给能源作物生产带来的危害。

自2003年DNA条形码(DNA barcodes)概念出现以来，DNA条形码技术(DNA  barcoding)受到生物分类学领域普遍关注，DNA条形码，也称DNA条形编码，类似于 超级市场商品包装上用于识别商品的粗细、间隔不同的黑白条纹图案，线粒体细胞色 素氧化酶亚基I(mtDNA COI)被用作动物类群的主要条形码序列，基于该基因片段的 昆虫条形码研究在国内外广泛开展，是利用线粒体DNA的细胞色素C氧化酶亚基I基 因(Cytochrome C oxidase I，COI)的前部约650bp长的序列作为标记来实现快速、 准确和自动化地对物种进行鉴定和分类。DNA条形码快速而精确的特点弥补了传统形态 鉴定的诸多不足，使其广泛应用于动物分类鉴定中。但是目前国内外尚无利用DNA条 形码作为分子标记区别鉴定桔小实蝇、果蝇和丽蝇的报道。

因此，本发明首次通过DNA条形码，即扩增测定这三个物种线粒体DNA的COI基 因序列，结合相关软件进行分析处理，实行快速简捷，经济实惠地对三种双翅目昆虫 进行物种鉴定；最终为及时有效的控制桔小实蝇的危害，从而保护其危害的水果和蔬 菜等植物，提高作物产量，降低作物产业成本提供必要的前提和基础。

发明内容

本发明的目的是针对桔小实蝇、果蝇和丽蝇幼虫形态鉴定难，科学鉴别手段缺乏 的不足，提供一种科学有效、简便快捷、准确的桔小实蝇害虫的分子生物学鉴定方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种鉴定双翅目昆虫的分子生物学 方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取双翅目昆虫总DNA；

(2)利用DNA条形码通用引物扩增线粒体COI基因前段序列进行PCR扩增和测序 作为标记；

(3)依据双翅目昆虫的核苷酸的序列特征变异位点进行物种鉴别。

进一步的，步骤(1)中，所述提取双翅目昆虫总DNA的个体为幼虫。

进一步的，步骤(2)中，所述通用引物序列为：

COIF：5’-ggaatagtaggaacatcccttagaa-3’

COIR：5’-acttctgggtgtccaaagaat-3’。

进一步的，所述PCR反应体系为50μl，其中模板DNA约25ng，25ul2×Taq PCR  MasterMix，正反向引物各2pM，加去离子水(ddH₂O)调至终体积50ul；

PCR反应条件如下：95℃预变性2分钟，94℃变性45秒，50℃复性45秒，72℃延 伸45秒，35个循环后，72℃延伸10分钟，4℃保存

本发明的有益技术效果是：

(1)本发明方法能对桔小实蝇、果蝇和丽蝇三种害虫不同生物型以及幼虫或 残缺个体进行鉴定，具有准确、迅速、便捷和费用低的特点，相比传统的形态特 征鉴定方法，大大节省了时间也减少了费用；

(2)本发明方法对使用的仪器设备要求较低，一般的分子生物学实验室均可 进行，比传统的形态学鉴别更准确可靠；

(3)本鉴别方法从根本上解决了当前桔小实蝇、果蝇和丽蝇幼虫在检疫过程 中较难进行准确鉴定的难题，填补了行业空白，具有重要意义。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、采用DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)提取双翅目昆虫桔小 实蝇、果蝇和丽蝇总DNA。为了鉴定幼虫，DNA提取全部测定的是几种双翅目昆虫的幼 虫个体。

2、利用DNA条形码通用引物PCR扩增线粒体COI基因前段序列和序列测定，具体 包括以下步骤：

①PCR扩增和测序所用的引物为：

②PCR反应体系为50ul，其中模板DNA约25ng，25ul2×Taq PCRMasterMix，正 反向引物各2pM，加去离子水(ddH₂O)调至终体积50ul；PCR反应在RoboCycler  Gradient40(Stratagene)热循环仪上完成。

③PCR反应条件如下：95℃预变性2min，94℃变性45秒，50℃复性45秒，72℃ 延伸45秒，35个循环后，72℃延伸10分钟，4℃保存。测序反应按厂家建议的条件， 使用Applied公司的BigDyeTerminator Kit(V2.0)在ABI377自动测序仪(Applied  Biosystems)上电泳测序。正反向分别测序，SEQID NO：1为丽蝇，SEQID NO：2为果 蝇，SEQID NO：3为桔小实蝇。

3、依据序列特征变异位点进行物种鉴别。

经测序仪分析的电泳图谱用DNASTAR中的Seqman结合人工做正反链拼接，用MEGA 软件中的Clustal W排序，序列变异用MEGA6.06进行分析。

表1显示了桔小实蝇、果蝇和丽蝇的核苷酸的序列特征变异位点。位点的序号以 本片段核苷酸位置为基准。变异位点的位置读法为表头数字从上而下读，如桔小实蝇、 果蝇和丽蝇COI基因的第一个变异位点为核苷酸的4号位置，第二个变异位点为核苷 酸序列的12号位置，最后一个变异位点为核苷酸序列的642号位置。

表1

例如在4、12、15号变异位点，我们发现核苷酸序列为TTC的为桔小实蝇，CCT为 丽蝇，TTT为果蝇。我们将根据这些变异位点来进行双翅目昆虫幼虫的分子生物学鉴定。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围 之内。