一株基因工程菌及其在生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用

摘要

本发明公开了一株基因工程菌，该菌命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09，其已于2014年5月7日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为：CCTCC NO：M2014186。本发明还公开了所述基因工程菌在利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用。实验证明本发明菌株具有明显利用秸秆水解液高产(2R,3R)-2,3-丁二醇的能力，为工业上规模化开发利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇提供基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一株基因工程菌及其在生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用，尤其涉及一株 基因工程阴沟肠杆菌及其在利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用。

背景技术

2,3-丁二醇广泛应用于化工、食品、燃料及航天航空等多个领域(Syu M J.,Appl. Microbiol.Biotechnol.,2001,55,10-18)。2,3-丁二醇在常温下是一种无色无味的液体，有 三种同分异构体：meso-2,3-丁二醇、(2R,3R)-2,3-丁二醇和(2S,3S)-2,3-丁二醇；其中旋光性 的(2R,3R)-2,3-丁二醇在手性化合物的不对称合成中有着重要作用，而且能够作为防冻剂 使用(Celinska and Grajek,Biotechnol.Adv.2009,27,715–725)。

木质纤维素由于其可替代性和可循环性，被认为是利用微生物生产化学品的理想原 料(Ji et al.,Biotechnol.Adv.2011,29,351–364)。因此，近年来关于利用源自木质纤维素 的糖类生产2,3-丁二醇的生物技术得到广泛关注(Wang et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol. 2010,87,965–970)。木质纤维素水解液中主要含有葡萄糖和木糖，由于葡萄糖的存在会 抑制2,3-丁二醇生产微生物对木糖的利用，往往会降低木质纤维素水解液原料的利用效 率，从而造成2,3-丁二醇生产成本的提高。已有报道通过表达环磷酸腺苷受体蛋白(CRP) 突变蛋白实现木糖和葡萄糖的同时利用来生产2,3-丁二醇(Ji et al.,Appl.Microbiol. Biotechnol.2011,89,1119–1125)，但由于产量和生产强度较低，无法满足工业生产需求。

目前报道的众多生产2,3-丁二醇的野生菌株中，仅多粘类芽孢杆菌产生光学纯的 (2R,3R)-2,3-丁二醇，该菌株以葡萄糖为碳源，补料分批发酵能够产生111.0克/升的 (2R,3R)-2,3-丁二醇，纯度达到98％，为目前报道(2R,3R)-2,3-丁二醇的最高产量，但其需 要高浓度的有机氮源(et al.,Bioresour.Technol.2012,124,237–244)，增加了生产 成本。在生产(2R,3R)-2,3-丁二醇基因工程菌方面，大肠杆菌工程菌能够利用葡萄糖产9.5 克/升的(2R,3R)-2,3-丁二醇，产量较低(shen et al.,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2012,39, 1725–1729)；而酿酒酵母能够补料分批发酵利用葡萄糖和半乳糖产生100.0克/升的 (2R,3R)-2,3-丁二醇，纯度达到98％，其生产强度仅为0.33g/[L h](Lian et al.,Metab.Eng. 2014,23,92–99)。并且上述菌株由于木糖利用能力较弱，不能有效的利用木质纤维素 水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇。

基于此，迫切需要寻找更好的方法，以实现利用木质纤维素水解液来进行(2R,3R)-2,3- 丁二醇的高效生产。

发明内容

针对上述现有技术中，菌株利用木质纤维素水解液困难，(2R,3R)-2,3-丁二醇的产量 低，难以大规模生产的不足，本发明要解决的问题是提供一株可利用木质纤维素水解液 生产(2R,3R)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其在生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用。

本发明所述的基因工程菌为基因工程阴沟肠杆菌，该菌命名为阴沟肠杆菌 (Enterobacter cloacae)SDM09，其已于2014年5月7日保藏于“中国典型培养物保藏 中心”(中国.武汉.武汉大学)，保藏号为：CCTCC NO：M2014186。

上述基因工程菌阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09为革兰氏阴性菌，需氧 或兼性厌氧生长，该菌的较佳培养温度为30±1℃，可以在含有50毫克/升硫酸卡那霉素 的LB培养基上生长。

上述基因工程菌阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09由以如下方法构建。

在阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM CGMCC No.4230中，利用基于同源重 组的pK-bdh质粒，敲除E.cloacae SDM CGMCC No.4230中的bdh基因，得到的重组菌 命名为菌株阴沟肠杆菌SDM01；利用PCR扩增得到短小芽孢杆菌的(2R,3R)-2,3-丁二醇 脱氢酶基因bpbdh和E.cloacae SDM CGMCC No.4230中的Pb启动子，并通过重组PCR， 酶切和连接，构建pET-Pb-bpbdh，其中Pb-bpbdh的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；为 了消除碳代谢阻遏，利用pK-ptsG质粒，敲除阴沟肠杆菌SDM01中的ptsG基因，得到 的重组菌命名为阴沟肠杆菌SDM03；利用PCR扩增得到E.cloacae SDM CGMCC No. 4230中的半乳糖透性酶基因galP和Pb启动子，并通过重组PCR，酶切和连接，构建 pET-Pb-galP，其中Pb-galP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，进一步通过重组pCR和 酶切连接，得到同时表达bpbdh基因和galP基因的pETPb-bpbdh-PbgalP质粒，其中 Pb-bpbdh-PbgalP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；利用pK-frdA和pK-ldhA敲除阴沟 肠杆菌SDM03中的frdA和ldhA基因，得到的重组菌命名为阴沟肠杆菌SDM06；将 pETPb-bpbdh-PbgalP质粒电转化入阴沟肠杆菌SDM06中，得到的重组菌命名为阴沟肠 杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09。

本发明所述基因工程菌在利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用。

选阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09CCTCC NO：M2014186，对其进行 活化。

在无菌条件下，取活化好的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09CCTCC NO： M2014186菌液，以体积比为5～10％的接种量接种到发酵培养基中，在温度30±1℃， pH6.0～8.0、搅拌转速100～500rpm、通气量0.5～2.5vvm条件下培养36～72小时，其 间，待检测培养基中葡萄糖的浓度降至20克/升以下时，补加木质纤维素水解液至培养基 中葡萄糖的浓度为20～50克/升，当检测发酵液中(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度不再增加时， 发酵结束，分离出培养液，按常规方式提取(2R,3R)-2,3-丁二醇；

其中，上述的发酵培养基配方为：1升蒸馏水中含：玉米浆干粉8克，无水乙酸钠5 克，磷酸二氢钾6克，柠檬酸2.4克，氯化钾1克，七水硫酸镁0.5克，金属离子母液溶 液10毫升，0.9％CaCl₂溶液10毫升。金属离子母液的配方为：1升蒸馏水中含：七水 硫酸亚铁2.25克，七水硫酸锌0.75克，一水硫酸锰0.38克。

上述应用中：所述pH范围优选6.0～7.0。

上述应用中：所述搅拌转速优选300～450rpm。

上述应用中：所述通气量优选1.0～2.0vvm。

上述应用中：所述阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09CCTCC NO：M2014186 菌液的活化方法是：

(1)平板培养：将基因工程菌阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09CCTCC NO： M2014186菌株划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂的并含有50毫克/升硫酸卡纳霉 素的LB培养基平板上，30±1℃培养12±2小时；

(2)种子培养：无菌条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然 后接种到含有60克/升葡萄糖和50毫克/升硫酸卡那霉素的发酵培养基中，30±1℃摇床 震荡培养12±2小时，得到阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09CCTCC NO：M 2014186的活化菌液；

其中，上述步骤(1)中所述的LB培养基配方为：1升蒸馏水中含：酵母粉5克，蛋 白胨10克，氯化钠10克，121℃灭菌15分钟。

上述应用中，底物葡萄糖的检测方法是：样品进行设定的稀释后，采用生物传感分 析仪SBA-40C(山东省科学院生物研究所)测定。测定原理为利用固定化葡萄糖氧化酶 膜专一性测定葡萄糖含量。

上述应用中，发酵产物(2R,3R)-2,3-丁二醇的检测方法是：

每500毫升乙酸乙酯中加入0.7毫升异戊醇，作为萃取剂；利用该萃取剂，对发酵液 中发酵产物样品进行等体积萃取，利用涡旋振荡器对萃取的样品震荡30秒钟，然后静置， 取上层样品进行气相检测。具体的气相检测条件如下：

所用气相色谱仪的型号为Agilent6820，氮气作为载气，进样器和检测器的温度均设 为280℃，检测过程的柱温设定为：40℃保持3分钟；然后以每分钟1.5℃的速率升温 到80℃；以每分钟0.5℃的速率升温到86℃；以每分钟30℃的速率升温到200℃。进样 量1.5微升，进行气相检测。

本发明对一株高产2,3-丁二醇混合物的阴沟肠杆菌进行工程改造，成功实现了将其具 有利用木质纤维素水解液高产(2R,3R)-2,3-丁二醇的能力，并以此重组菌株即阴沟肠杆菌 SDM09发酵秸秆水解液获得高产(2R,3R)-2,3-丁二醇，为工业上规模化开发利用木质纤维 素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇提供基础。

本发明具有的突出特点是：

(1)该工程菌株阴沟肠杆菌SDM09，可同时利用木质纤维素中的木糖和葡萄糖， 原料的利用率大大提高。

(2)本发明方法构建的工程菌株生产(2R,3R)-2,3-丁二醇，培养基的营养组成简单、 生产成本低。

(3)本发明的工程菌能发酵秸秆水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇，最高产量可达到152 克/升以上，纯度大于97％。

附图说明

图1载体pETPb-bpbdh-PbgalP构建过程。

图2阴沟肠杆菌SDM09发酵秸秆水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇过程曲线。●,葡萄糖； ■,生物量；▲,木糖；◆,(2R,3R)-2,3-丁二醇；▼,乙偶姻。

图3阴沟肠杆菌SDM09发酵产物的气相色谱图。

其中：A：标准品气相色谱图，B：阴沟肠杆菌SDM09发酵产物的气相色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步阐明本发明，但不仅限于此。

实施例1：生产(2R,3R)-2,3-丁二醇阴沟肠杆菌工程菌的构建

1.敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh(GenBank:13167657)

采用常规的方法制备阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM CGMCC No.4230的 基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的 小量制备的方法；使用合成的引物Kbdh1-f和Kbdh1-r从上述基因组DNA中PCR扩增得 到2,3-丁二醇合成基因的前段；使用合成的引物Kbdh2-f和Kbdh2-r从上述基因组中PCR 扩增得到2,3-丁二醇合成基因的后段；利用酶切与经过EcoRI和BamHI进行双酶切的 pKR6K质粒进行连接重组转化至大肠杆菌S17-1中，得到的菌株命名为大肠杆菌pK-bdh。

扩增重组引物设计如下：

Kbdh1-f:5’-AAAGAATTCCCAGGTGATGATCTCCAAC携带一个EcoRI位点

Kbdh1-r:5’-TATAAGCTTCAAAACCATCTTTCACCAGG携带一个HindIII位点

Kbdh2-f:5’-TTAAAGCTTGGAGATTGACCGTCAGGTGT携带一个HindIII位点

Kbdh2-r:5’-ATTTGGATCCATAGAGGTGTTTACTTTCCG携带一个BamHI位点。

1)培养需要敲除的目的菌阴沟肠杆菌SDM CGMCC No.4230与携带敲除质粒的大肠杆 菌pK-bdh，同时生长到OD_620nm0.5。将1毫升目的菌培养物离心，生理盐水洗两遍；将 5毫升大肠杆菌培养物离心，生理盐水洗两遍。

2)将上述目的菌与大肠杆菌pK-bdh的菌体一共用100微升生理盐水重悬，将重悬液全 部滴在LB平板(无任何抗性)中间，平板正面放置，过夜培养。

3)将上述平板中的菌落用生理盐水和刮刀刮下，生理盐水洗两遍，进行适当稀释(一般 是10^-2或10^-3)，涂布M9+柠檬酸盐+Kana平板(阴沟肠杆菌SDM GMCC No.4230可利 用柠檬酸盐为唯一碳源，质粒和基因组进行了单交换的目的菌，可在M9+柠檬酸盐+Kana 平板生长；未发生单交换的目的菌，无法在Kana平板生长；带有质粒的大肠杆菌，无法 在柠檬酸盐平板生长)，过夜培养。

4)挑取生长的单菌落，利用上下游引物进行PCR验证，单交换的目的菌，可同时PCR 出长片段(原始基因)和短片段(构建的上下游同源臂)。

5)将正确的单交换目的菌，接种至LB摇管(无任何抗性)，过夜培养。

6)将上述培养液转接至含10％蔗糖的LB摇管中培养两代，适当稀释(一般是10^-6或 10^-7)，涂布LB+12％蔗糖平板，过夜培养。

7)挑取生长的单菌，利用上下游引物进行PCR验证，双交换的目的菌，能PCR出短片 段(构建的上下游同源臂)，挑选正确的双交换菌，进行表型验证，得到正确的敲除菌E. cloacae SDMΔbdh，命名为阴沟肠杆菌SDM01。

M9培养基配方为：1升蒸馏水中含：氯化钠0.5克，氯化铵1克，磷酸氢二钾3克， 磷酸氢二钠3克，七水硫酸镁0.246克，柠檬酸三钠10克。

2.过表达(2R,3R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因bpbdh

1)采用常规的方法制备菌株B.pumilus LN146的基因组DNA，该过程可参考科学出 版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法，提取B.pumilus  LN146的基因组DNA；使用合成的引物Bp-f和Bp-r从B.pumilus LN146基因组DNA中 PCR扩增得到(2R,3R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因bpbdh。使用合成的引物Pb-f和Pb-r从实施 例1中E.cloacae SDM CGMCC No.4230基因组中PCR扩增得到Pb启动子，利用重组 PCR进行重组得到Pb-bpbdh片段。

扩增重组引物设计如下：

Pb-f:5’-AAAGGATCCATCTAAAACGTCTCAAACCA携带一个BamHI位点

Pb-r:5’-TGCCAGCGTAGTGCTTTCATGCTCGTCCTCTTCAACTTTA

Bp-f:5’-TAAAGTTGAAGAGGACGAGCATGAAAGCACTACGCTGGCA

Bp-r:5’-AAACTCGAGTTATTCAGCACTAACTAAAA携带一个XhoI位点。

上述Pb-bpbdh片段的DNA序列长度为1143个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。

2)将重组后的Pb-bpbdh片段与pET28a进行BamHI和XhoI的双酶切和连接，得到 pETPb-bpbdh质粒。

3)利用含有0.7毫摩尔每升EDTA的LB培养基培养阴沟肠杆菌SDM01到OD_620nm0.5。将30毫升目的菌培养物离心，超纯水洗两遍，并用300微升的超纯水重悬，得到阴 沟肠杆菌SDM01的感受态细胞。然后再2000伏，200欧姆，20微法拉条件下，将质粒 pETPb-bpbdh电转化至阴沟肠杆菌SDM01，涂Kana抗性LB平板，挑取的转化子，然 后提质粒酶切验证，得到正确的转化子E.cloacae SDMΔbdh/pETPb-bpbdh，命名为阴沟 肠杆菌SDM02

实施例2：解除葡萄糖效应E.cloacae工程菌的构建

按照实施例1中的基因敲除方法，在阴沟肠杆菌SDM01的基础上进行ptsG基因的 敲除，得到E.cloacae SDMΔbdhΔptsG。

1.敲除葡萄糖磷酸转移酶基因ptsG(GenBank:13169500)

以实施例1中提取的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM CGMCC No.4230的 基因组DNA为模板；使用合成的引物KptsG1-f和KptsG1-r从E.cloacae SDM基因组DNA 中PCR扩增得到ptsG的前段。使用合成的引物KptsG2-f和KptsG2-r从E.cloacae SDM 基因组中PCR扩增得到ptsG合成基因的后段，利用重组PCR进行重组，使重组后的基 因缺失中间部分。得到重组片段酶切与经过EcoRI和BamHI进行双酶切的pKR6K质粒 进行连接重组转化大肠杆菌S17-1，得到大肠杆菌S17-1pK-ptsG。该菌株用于阴沟肠杆菌 SDM01中的ptsG基因敲除，具体操作条件同实施例1，其中扩增重组引物设计如下：

KptsG1-f:5’-AAAGGATCCATGTTTAAGAATGCATTTGCT携带一个BamHI位点

KptsG1-r:5’-CAGAATCGCGTGGATAACGTATCACACCCGTGAAAATCGC

KptsG2-f:5’-GCGATTTTCACGGGTGTGAT ACGTTATCCACGCGATTCTG

KptsG2-r:5’-GTTGAATTCTTAGCTGTTGCGGATGTATTCATCCAT携带一个 EcoRI位点。

得到的阴沟肠杆菌E.cloacae SDMΔbdhΔptsG命名为阴沟肠杆菌SDM03。

2.重组表达半乳糖透性酶基因galP

1)以实施例1中提取的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM CGMCC No.4230 的基因组DNA为模板，使用合成的引物从E.cloacae SDM基因组DNA中PCR扩增得到 galP合成基因。与Pb(2,3-丁二醇合成启动子，来源于E.cloacae SDM)进行重组得到 Pb-galP片段，并利用BamHI和HindIII酶切连接至pET28a，得到pETPb-galP。

扩增重组引物设计如下：

Pb-f:5’-AAAGGATCCATCTAAAACGTCTCAAACCA,携带一个BamHI位点

Pg-r:5’-TGTTTATTATTGTCAGGCATGCTCGTCCTCTTCAACTTTA

G-f:5’-TAAAGTTGAAGAGGACGAGCATGCCTGACAATAATAAACA

G-r:5’-TTTAAGCTTTTAGTCGTGTGCGCCGATTT携带一个HindIII位点

上述Pb-galP片段的DNA序列长度为1500个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

2)利用引物G-B-f和G-B-r，以pETPb-galP为模板PCR扩增得到Pb-galP的DNA 片段，利用引物B-G-f和Bp-r，以pETPb-bpbdh为模板PCR扩增得到Pb-bpbdh。使用重 组PCR将Pb-galP和Pb-bpbdh重组到一起，然后NcoI/XhoI双酶切，和表达载体pET28a 连接，得到重组质粒pETPb-bpbdh-PbgalP。

G-B-f:5’-TAAGAAGGAGATATACCATGGATCTAAA携带一个NcoI位点

G-B-r:5’-TGAGACGTTTTAGATTTAGTCGTGTGCGCC

B-G-f:5’-GGCGCACACGACTAAATCTAAAACGTCTCA

Bp-r:5’-AAACTCGAGTTATTCAGCACTAACTAAAA携带一个XhoI位点。

上述Pb-bpbdh-PbgalP片段的DNA序列长度为2643个碱基，其核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示。

将所得的重组质粒pETPb-bpbdh-PbgalP电转进入阴沟肠杆菌阴沟肠杆菌SDM03 中，得到E.cloacae SDMΔbdhΔptsG/pETPb-bpbdh-PbgalP，将其命名为阴沟肠杆菌SDM 04。

实施例3：敲除副产物代谢途径E.cloacae工程菌的构建

1.敲除乳酸脱氢酶基因ldhA(GenBank:13166930)

以实施例1中提取的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM CGMCC No.4230的 基因组DNA为模板，使用合成的引物KldhA1-f和KldhA1-r从E.cloacae SDM基因组 DNA中PCR扩增得到ldhA基因的前段。使用合成的引物KldhA2-f和KldhA2-r从E. cloacae SDM基因组中PCR扩增得到ldhA基因的后段，利用重组PCR进行重组，使重 组后的基因缺失中间部分。得到重组片段酶切与经过EcoRI和SmaI进行双酶切的pKR6K 质粒进行连接重组转化。

扩增重组引物设计如下：

KldhA1-f:5’-GCTGAATTCATCGATGAGCCCCGCGTTAA携带一个EcoRI位点

KldhA1-r:5’-GCTGAAGGTGGTTGGGGGTTGATTGACTCTCAG

KldhA2-f:5’-AGAGTCAATCAACCCCGAACCACCTTCAGCCCCA

KldhA2-r:5’-GCTACCCGGGTATCCTGATTTAGCGAGAGA携带一个SmaI位点。

按照实施例1中的双亲杂交方法，在阴沟肠杆菌E.cloacae SDM03的基础上进行双 亲杂交双交换得到E.cloacae SDMΔbdhΔptsGΔldhA，将其命名为阴沟肠杆菌SDM05。

2.敲除琥珀酸脱氢酶基因frdA(GenBank:13168818)

以实施例1中提取的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM CGMCC No.4230的 基因组DNA为模板，使用合成的引物KfrdA1-f和KfrdA1-r从阴沟肠杆菌E.cloacae SDM 基因组DNA中PCR扩增得到frdA基因的前段。使用合成的引物KfrdA2-f和KfrdA2-r 从阴沟肠杆菌E.cloacae SDM基因组中PCR扩增得到frdA基因的后段，利用重组PCR 进行重组，使重组后的基因缺失中间部分。得到重组片段酶切与经过EcoRI和SmaI进行 双酶切的pKR6K质粒进行连接重组转化。

扩增重组引物设计如下：

KfrdA1-f:5’-CCGAATTCGTGCAAACTTTTCAAGCCGA携带一个EcoRI位点

KfrdA1-r:5’-GACGTCAGTGACCGTCATCGACCAGAAT

KfrdA2-f:5’-CGGTCACTGACGTCGAGAAACGACTGAA

KfrdA2-r:5’-TTTCCCGGGTCAGCCATTCGCCTTCTCCT携带一个SmaI位点。

按照实施例1中的双亲杂交方法，在阴沟肠杆菌E.cloacae SDM05的基础上进行双 亲杂交双交换得到阴沟肠杆菌E.cloacae SDMΔbdhΔptsGΔldhAΔfrdA，将其命名为阴沟肠 杆菌SDM06。

将实施例2构建好的质粒pETPb-bpbdh-PbgalP电转到E.cloacae SDM06中，即得到 最终目的工程菌株E.cloacae SDMΔbdhΔptsGΔldhAΔfrdA/pETPb-bpbdh-PbgalP，命名为阴 沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09。

上述得到的工程菌阴沟肠杆菌(E.cloacae)SDM09已于2014年5月7日保藏于中 国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，保藏中心编号为：CCTCC NO：M2014186。

上述重组阴沟肠杆菌(E.cloacae)SDM09CCTCC NO：M2014186为革兰氏阴性菌， 需氧或兼性厌氧生长，可以用于发酵生产(2R,3R)-2,3-丁二醇。

上述重组阴沟肠杆菌(E.cloacae)SDM09CCTCC NO：M2014186的较佳培养温度 为30±1℃，可以在含有50毫克/升硫酸卡纳霉素的LB培养基上生长。

实施例4：制备阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09菌株的细胞液体培养物

1、平板培养：将实施例3中所得阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09划线到 含有质量体积比为1.5％琼脂的并含有50毫克/升硫酸卡那霉素的LB平板上，30℃培养 12小时；

2、种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然 后接种到5毫升的含有50毫克/升硫酸卡那霉素的LB培养基中，30℃摇床震荡培养12 小时；

3、摇瓶：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比1～3％的接种量，接 种到30～150毫升含有60克/升葡萄糖和50毫克/升硫酸卡那霉素的发酵培养基中，30± 1℃摇床震荡培养12±1小时，即获得阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09菌株 的细胞液体培养物；

其中，上述步骤1中所述的LB培养基配方为：1升蒸馏水中含：蛋白胨10克，酵母 粉5克，氯化钠10克，121℃灭菌15分钟。

实施例5：阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09工程菌以葡萄糖和木糖为碳 源发酵生产(2R,3R)-2,3-丁二醇

将通过实施例4的方法获得的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09菌株的细 胞液体培养物，以体积比为5％的接种量接种到含有60克/升葡萄糖、20克/升木糖和50 毫克/升硫酸卡那霉素的发酵培养基中，在30℃、pH6.5、300rpm、1.5vvm通气量条件 下发酵。发酵中每隔3小时取样，样品以8,000×g离心10分钟，检测上清中(2R,3R)-2,3- 丁二醇和葡萄糖的浓度，根据葡萄糖浓度补加比例为3:1的葡萄糖和木糖干粉混合物，使 葡萄糖浓度维持在20～50克/升；对上清进行气相色谱分析测定发酵液中(2R,3R)-2,3-丁二 醇的浓度，当(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度不再增加时，停止发酵。

其中，上述步骤中所述的发酵培养基1配方为：1升蒸馏水中含：玉米浆干粉8克， 乙酸钠5克，磷酸二氢钾6克，柠檬酸2.4克，氯化钾1克，硫酸镁0.5克，金属离子母 液溶液10毫升，0.9％CaCl₂溶液10毫升。金属离子母液的配方为：1升蒸馏水中含： 七水硫酸亚铁2.25克，七水硫酸锌0.75克，一水硫酸锰0.38克。

44小时后检测结果显示：(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度为152克/升。

实施例6：阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09工程菌以秸秆水解液为碳源 发酵生产(2R,3R)-2,3-丁二醇

将通过实施例4的方法获得的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09菌株的细 胞液体培养物，以体积比为5％的接种量接种到含有550克/升总糖(葡萄糖和木糖比例为 3：1)的秸秆水解液和50毫克/升硫酸卡那霉素的发酵培养基中，在30℃、pH7.0、450rpm、 2.0vvm通气量条件下发酵。发酵中每隔3小时取样，样品以8,000×g离心10分钟，检 测上清中(2R,3R)-2,3-丁二醇和葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度补加浓缩的秸秆水解液，使 葡萄糖浓度维持在20～50克/升；对上清进行气相色谱分析测定发酵液中(2R,3R)-2,3-丁二 醇的浓度，当(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度不再增加时，停止发酵。

51小时后检测结果显示：(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度为119.4克/升。

实施例7：阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09工程菌以葡萄糖为碳源发酵 生产(2R,3R)-2,3-丁二醇

将通过实施例4的方法获得的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09菌株的细 胞液体培养物，以体积比为5％的接种量接种到含有80克/升葡萄糖和50毫克/升硫酸卡 那霉素的发酵培养基中，在30℃、pH6.0、400rpm、1.0vvm通气量条件下发酵。发酵中 每隔3小时取样，样品以8,000×g离心10分钟，检测上清中(2R,3R)-2,3-丁二醇和葡萄糖 的浓度，根据葡萄糖浓度补加葡萄糖干粉，使葡萄糖浓度维持在20～50克/升；对上清进 行气相色谱分析测定发酵液中(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度，当(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度不 再增加时，停止发酵。

52小时后检测结果显示：(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度达到155.0克/升。