肿瘤坏死因子-α转化酶的多肽抑制剂的筛选方法及其应用

摘要

一种肿瘤坏死因子-α转化酶的多肽抑制剂的筛选方法及其应用，属于生物医学领域。所述方法先建立合理的TACE与多肽底物的复合物模型，用以指导多肽抑制剂的设计，然后通过检测一系列指标，如结合能力、抑制能力等，筛选出可作为多肽抑制剂的候选多肽；所选出的多肽特异性高，活性强，可进一步用于设计以肿瘤坏死因子-α转化酶为靶标的多肽药物。

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质类药物的相关设计，具体涉及TNF-α转化酶的多肽抑制 剂的筛选，以此构建以TNF-α转化酶为靶标的多肽药物。

背景技术

蛋白质是生物体的主要组成成分之一，是完成各种生命活动的主要物质。在 各种蛋白质中，蛋白酶对生命活动至关重要，几乎所有生物体内的生化反应过程 都由蛋白酶进行催化。生物体内各种蛋白酶的活性具有严格的调控机制，一旦其 调控机制出现问题，造成蛋白酶的活性过高、过低或者是完全失活，都会造成相 应的各类疾病。因此，通过药物来调控蛋白酶的活性，使其恢复和保持在正常水 平，具有非常重要的理论意义和现实意义。以结构为基础的药物设计，是设计以 蛋白质为靶标的药物的一个非常重要的手段。

人体中，有4%左右的蛋白质首先是表达为膜蛋白，然后在相关蛋白酶的作 用下，膜外部分被剪切下来，释放到胞外环境中，发挥相应的生物学功能。这种 生物学过程称为膜外结构域脱落（Ectodomain Shedding），相应的蛋白酶也称为 脱落酶（Sheddase）。肿瘤坏死因子-α转化酶（TACE，TNF-α转化酶）是目前研 究最为深入的脱落酶之一。目前已经发现，人体中有至少七十多种蛋白质的膜外 结构域脱落有肿瘤坏死因子-α转化酶的参与。这些蛋白质包括很多非常重要的疾 病相关蛋白因子，例如肿瘤坏死因子-α（TNF-α），肿瘤坏死因子受体I和受体II， 转化生长因子-α（TGF-α），白介素-6受体-α（IL-6Rα）等，因此肿瘤坏死因子-α 转化酶也成为一个重要的药物靶标。例如，可溶性的高活性TNF-α在类风湿性 关节炎组织中具有明显高于正常组织的表达水平，通过抑制可溶性TNF-α的生 物学活性，已经证明能够有效治疗和缓解类风湿性关节炎的病症，上市的药物包 括依那昔普（Enbrel）、英利昔单抗（Remicade）和阿达木单抗（ＨumiRA）等。 而如果抑制肿瘤坏死因子-α转化酶的生物学活性，那么可溶性的高活性TNF-α 的量也会随之减少，因此同样也能够达到治疗的目的。近些年来，国际上很多公 司针对肿瘤坏死因子-α转化酶开发了很多抑制剂，有些已经进入二期甚至三期临 床。目前对肿瘤坏死因子-α转化酶抑制剂的研究，存在的一个主要问题是，人们 不了解它的目标底物结合方式，目前还没有关于该催化结构域与其多肽底物的复 合物结构的任何报道，因此也不了解其底物特异性与活性的机理。如果能够有一 个合理的复合物结构模型，采用基于结构的药物设计方法，将有可能设计出更好 的具有高特异性的肿瘤坏死因子-α转化酶抑制剂。

发明内容

本发明涉及肿瘤坏死因子-α转化酶（TACE）的多肽抑制剂的筛选方法及其 应用；所述方法先建立合理的TACE与多肽底物的复合物模型，用以指导多肽抑 制剂的设计，然后通过检测一系列指标，如结合能力、抑制能力等，筛选出可作 为多肽抑制剂的候选多肽；所选出的多肽特异性高，活性强，可进一步用于设计 以肿瘤坏死因子-α转化酶为靶标的多肽药物。

上述筛选方法包括如下步骤：（1）检测候选多肽与TACE的结合能力，选择 能结合的多肽；（2）检测选择出的多肽能否被TACE剪切，选择能被剪切的多肽； （3）检测选择出的多肽抑制TACE细胞活性的能力，选择有抑制效果的多肽。 其中优选的，所述候选多肽选自TACE的底物多肽，如通过计算机辅助蛋白质设 计的方法获得的具有较高亲和力的多肽作为候选多肽、或者现有技术中已公开的 具有亲和力的多肽作为候选多肽。其中优选的，步骤（1）～（3）中，所述选择 是相对于阴性对照进行的。

BLItz单样本分子相互作用分析仪是利用生物膜层干涉技术对生物分子相互 作用进行定量检测的仪器，其基本原理是，首先将一个分子固定到探头上，当另 一个分子与固定的分子相互作用时，会引起光的干涉效应的改变，从而可以被光 探测器检测到。在我们的实验中，TACE通过生物素化后，固定在生物素亲和探 头上，以此固定TACE，用来检测多肽与TACE的结合。为增大检测信号，多肽 合成后与牛血清蛋白BSA进行交联。由此优选的，步骤（1）是为了检测多肽与 TACE的结合能力，其中将TACE进行生物素化，加入BSA偶联的多肽，用BLItz 蛋白相互作用仪进行所述检测；检测完毕后分析数据。步骤（1）对于所有的候 选多肽相同。

为了判断多肽是否能被TACE催化剪切，以及剪切的效率，我们采用高效液 相色谱法（HPLC）进行检测。基本原理是，若多肽能被TACE剪切，则在多肽 与TACE共同孵育后，多肽会被切成两段，酶切位点在多肽（如阳性多肽 PLAQAVRSS）的第5个残基（A）和第6个残基（V）之间，从而多肽在HPLC 上的峰面积以及峰位置都会发生改变。由此优选的，步骤（2）是为了检测多肽 被TACE剪切的效率，其中将所述多肽与TACE孵育后，用HPLC进行所述检 测；检测完毕后分析数据。步骤（2）对于所有的候选多肽相同。

在细胞水平上，我们采用如下原理检测多肽对TACE活性的抑制作用。首先， 用脂多糖（LPS）刺激THP-1细胞，此时，细胞膜上的TACE活性会增加，从而 大量剪切膜结合形式的TNF-a，使TNF-a被释放到培养液中。如果多肽能够抑制 TACE的活性，则当多肽与LPS共同加入时，细胞膜表面的TNF-a要比不加多 肽时多。我们用FITC标记的TNF-a抗体，来探测细胞膜表面的TNF-a的数量， 用流式细胞仪进行计数分析。接着，我们又用MTT法，检测了THP-1细胞释放 到培养液中的TNF-a的量。基本原理是，如果多肽能够抑制TACE，则释放到培 养液中的TNF-a量较少，从而，相同培养液对L929细胞的杀伤效果较弱。由此 优选的，步骤（3）是为了检测多肽抑制TACE细胞活性的能力，检测使用流式 细胞仪法和/或MTT(噻唑蓝)法。步骤（3）对于所有的候选多肽相同。

其中优选的，本发明还通过构建合理的TACE与其多肽底物的复合物结构模 型，设计针对TACE的多肽抑制剂。其技术方案是，利用计算机辅助蛋白质设计 的方法，建立合理的TACE及候选多肽的复合物模型，然后指导多肽抑制剂的筛 选。所述候选多肽的确认包括以下步骤：a通过蛋白质设计软件生成代表多肽的 线性三维结构；b获得TACE的催化结构域的晶体结构；c将上述代表多肽对接 到该催化结构域的活性部位，并分析多肽的序列谱。其中优选的，蛋白质设计软 件优选ROSETTA，但并不排除使用其它类似蛋白质设计软件的可行性；其中优 选的，代表多肽可以来自已知的肿瘤坏死因子-α转化酶的多肽底物，或者通过蛋 白质设计软件获得，如代表多肽可以来自根据肿瘤坏死因子-a转化酶与多肽的对 接结构模型，计算分析得到的亲和力序列谱；其中优选的，肿瘤坏死因子-α转化 酶的催化结构域可来自已知的肿瘤坏死因子-α转化酶的催化结构域，或其它晶体 结构中的肿瘤坏死因子-α转化酶的催化结构域，或者使用序列或结构上高度同源 的蛋白结构。

具体为：按照以上方案进行复合物模型的构建，本发明首先从众多已知的肿 瘤坏死因子-α转化酶多肽底物中，确定使用TNF-α的前体蛋白proTNF-α中的目 标序列（PLAQAVRSS）作为代表对象。但该选择并不排除其它底物多肽作为代 表对象的可能性。同时，也不排除利用短一些或长一些的多肽或者蛋白质作为代 表对象的可能性。然后将底物序列PLAQAVRSS通过蛋白质设计软件ROSETTA 生成线性的三维结构。然后在PDB（Protein Data Bank）数据库中，从1BKC（PDB  ID）中获得肿瘤坏死因子-α转化酶的催化结构域的晶体结构。因为肿瘤坏死因 子-α转化酶的催化结构域的结构很稳定，而且在结构上与基质金属蛋白酶 （MMP）等的催化结构域具有很高的结构同源性，所以该选择并不排除使用其 它晶体结构中的肿瘤坏死因子-α转化酶的催化结构域作为对象，或者使用序列或 结构上高度同源的蛋白结构作为对象的可行性。在ROSETTA程序（PLOS ONE 6(4):e18934,2011；J Mol Biol402:460-467,2010;J Mol Biol380:742-756,2008） 中，将上述多肽底物对接到该催化结构域的活性部位，并分析多肽底物的序列谱。 其中，利用计算机分析序列谱计算多肽与蛋白的理论亲和力，通过亲和力强弱进 行选择。其中该ROSETTA软件的选择，并不排除使用其它类似蛋白质设计软件 的可行性。

根据上述复合物结构模型，我们分析发现，多肽底物与TACE的静电相互作 用对其结合能力有很大的影响，因此，我们对上述天然多肽底物进行了设计，发 现了下述多肽有良好的结合能力和抑制TACE活性的效果。

实验过程中，我们用两条多肽作为对照。一条是上述来自于TNF-a的天然 底物多肽PLAQAVRSS（SEQ ID NO：1），作为阳性对照；另一条是来自于文献 （Caescu CI,Jeschke GR,Turk BE(2009)Active-site determinants of substrate  recognition by the metalloproteinases TACE and ADAM10.Biochem J424:79–88.） 的、不被TACE剪切的多肽PRYEAYKMG（SEQ ID NO：2），作为阴性对照。 上述对照对于所有的候选多肽相同。

本发明还涉及一种设计以肿瘤坏死因子-α转化酶为靶标的多肽药物的方法， 包括将上述方法筛选获得的候选多肽用于设计所述多肽药物。本发明还涉及通过 上述筛选方法获得的多肽，包括PLAAAVRSS（SEQ ID NO：3）、PLAQAVFSS （SEQ ID NO：4）、PRAEAVQSR（SEQ ID NO：5）、PLAAAVFSS（SEQ ID NO： 6）等。本发明还涉及将上述多肽在设计以肿瘤坏死因子-α转化酶为靶标的多肽 药物中的应用。

附图说明

现对本发明有关附图进行描述，其中：

图1：多肽PLAAAVRSS与TACE的结合能力结果；从图中可以看出，阴性对照 多肽PRYEAYKMG与TACE的结合能力很弱，而阳性对照多肽PLAQAVRSS具 有较好的结合，候选多肽PLAAAVRSS则具有较高的结合能力，以及较慢的解 离速度。这说明，PLAAAVRSS与TACE能够较好的结合。

图2：阳性多肽被TACE酶切后的HPLC结果；其中黑色为酶切前，灰色为酶切 后；通过峰面积计算，阳性多肽被酶切的效率约为80%。

图3：阴性多肽与TACE共孵育后的HPLC结果；其中黑色为酶切前，灰色为酶 切后；阴性多肽在孵育前后没有变化，即不能被TACE酶切。

图4：多肽PLAAAVRSS与TACE共孵育后的HPLC结果；其中黑色为酶切前， 灰色为酶切后；多肽能够被TACE酶切，但效率只有62%，比阳性多肽80%要 弱。

图5：对多肽PLAAAVRSS进行流式细胞仪分析的结果。A.阳性对照肽的流式 细胞仪结果；B.目标肽的流式细胞仪结果；C.流式细胞分析结果；其中：1640 为培养基，空白为未添加TNF-a抗体或者LPS或者多肽，1肽为阳性对照肽，5 肽为我们的目标肽。可以看出，我们的肽能够使细胞膜表面的TNF-a数量增加， 即通过抑制TACE活性，降低了被TACE酶切的量。

图6：对多肽PLAAAVRSS进行MTT法检测的结果。所测的值越低，则被杀死 的L929细胞越少。其中，1640为培养基空白对照，5肽为我们的目标肽。可以 看出，添加目标肽与LPS进行孵育，对L929细胞有保护作用，即对应的培养液 中TNF-a量较少。

图7：多肽PLAQAVFSS与TACE的结合能力结果；从图中可以看出，阴性对照 多肽PRYEAYKMG与TACE的结合能力很弱，而阳性对照多肽PLAQAVRSS具 有较好的结合。同时，候选多肽PLAQAVFSS的结合能力比阴性对照肽高，且其 解离速度比阳性对照肽慢。因此，该多肽与TACE具有较高的结合能力。

图8：多肽PLAQAVFSS与TACE共孵育后的HPLC结果；其中黑色为酶切前， 灰色为酶切后。多肽能够被TACE酶切，但效率只有61%，比阳性多肽80%要 弱。

图9：对多肽PLAQAVFSS进行流式细胞仪分析的结果。A.阳性对照肽的流式 细胞仪结果；B.目标肽的流式细胞仪结果；C.流式细胞分析结果。其中，1640 为培养基，空白为未添加TNF-a抗体或者LPS或者多肽。1肽为阳性对照肽，7 肽为我们的目标肽。可以看出，我们的肽能够使细胞膜表面的TNF-a数量增加， 即通过抑制TACE活性，降低了被TACE酶切的量。

图10：对多肽PLAQAVFSS进行MTT法检测的结果。所测的值越低，则被杀死 的L929细胞越少。其中：1640为培养基空白对照，7肽为我们的目标肽。可以 看出，添加目标肽与LPS进行孵育，对L929细胞有保护作用，即对应的培养液 中TNF-a量较少。

图11：多肽PRAEAVQSR与TACE共孵育后的HPLC结果；其中黑色为酶切前， 灰色为酶切后。多肽能够被TACE酶切，但效率只有约30%，比阳性多肽80% 要弱。

图12：对多肽PRAEAVQSR进行流式细胞仪分析的结果。A.阳性对照肽的流式 细胞仪结果；B.目标肽的流式细胞仪结果；C.流式细胞分析结果。其中1640 为培养基，空白为未添加TNF-a抗体或者LPS或者多肽。1肽为阳性对照肽，8 肽为PRAEAVQSR。可以看出，我们的肽能够使细胞膜表面的TNF-a数量增加， 即通过抑制TACE活性，降低了被TACE酶切的量。

图13：对多肽PRAEAVQSR进行MTT法检测的结果。所测的值越低，则被杀 死的L929细胞越少。1640为培养基空白对照，8肽为PRAEAVQSR。可以看出， 添加目标肽与LPS进行孵育，对L929细胞有保护作用，即对应的培养液中TNF-a 量较少。

图14：多肽PLAAAVFSS与TACE共孵育后的HPLC结果。黑色为酶切前，灰 色为酶切后。多肽几乎不被TACE酶切，效率只有约5%，比阳性多肽80%要弱。

图15：对多肽PLAAAVFSS进行流式细胞仪分析的结果。A.阳性对照肽的流式 细胞仪结果；B.目标肽的流式细胞仪结果；C.流式细胞分析结果。其中，1640 为培养基，空白为未添加TNF-a抗体或者LPS或者多肽。1肽为阳性对照肽， 10肽为我们的目标肽。可以看出，我们的肽能够使细胞膜表面的TNF-a数量增 加，即通过抑制TACE活性，降低了被TACE酶切的量。

图16：对多肽PLAAAVFSS进行MTT法检测的结果。所测的值越低，则被杀死 的L929细胞越少。1640为培养基空白对照，10肽为我们的目标肽。可以看出， 添加目标肽与LPS进行孵育，对L929细胞有保护作用，即对应的培养液中TNF-a 量较少。

具体实施方式

本发明下面所述试验方法对筛选所有肽均相同，但仅仅是对本发明所述方法中的 实验方法的进一步说明，并不限于以下内容。

对于本发明所述方法中的实验方法如下：

（1）多肽与TACE结合能力的检测

1首先将TACE蛋白换成不含Tris盐的buffer，如HEPES buffer。

2换完buffer后，根据生物素化的说明书，将TACE进行生物素化。蛋白稀释按 照逐步稀释法，生物素比例一般是蛋白20倍左右，一般生物素化时间约1小时 在常温进行。

3除去多余的生物素，用浓缩管或盐柱换buffer，离心至少4-5次。

4准备不同BSA偶联的多肽各10uM，此反应液稀释。

5用BLItz蛋白相互作用仪进行实验，先用PBS浸生物素化探头15min进行活

化，参数设置和步骤参考以下表格：

表1：TACE-Peptide相互作用一般参数设置表

（2）多肽被TACE剪切效率的检测

1、配Assay buffer(25mM Tris2.5uM ZnCl2,0.005%Brij-35;pH=9.0)；

2、用分析天平秤称多肽，用Assay buffer配多肽母液为1mM（用Assay buffer 配置）；TACE100ng/ul（用Assay buffer配置）；

3、用Assay buffer稀释多肽至终浓度为500uM；

4、配流动相参照多肽公司的流动相配置

含0.1%的TFA水溶液B水相

含0.1%的TFA乙腈溶液A有机相；

5、多肽与TACE以一下反应比例在37度水溶锅中进行反应：

处理前样500uM肽（50ul）+1ul*Assay buffer

处理后样500uM肽（50ul）+1ul*100ng/ul TACE；

3小时后放冰上终止反应；

6、马上上HPLC，上样体积各20ul。多肽上液相色谱仪方法：

A有机相20%-50%

B水相80%-50%

0.8ml/min15min走完。

7、分析数据

（3）多肽抑制TACE细胞活性的检测-流式细胞仪法

1.用THP1细胞前一天晚上铺24孔板。

2.第二天早上同时加LPS1ug/ml，肽20uM(LPS1ug/ul加1ul到一个细胞孔， 5ul*4.2mM肽每个1ml孔)孵育3-4hr。

3.把每两个孔的细胞收一起。5min3000rpm离心，弃上清------>用1ml FBS洗 涤一次，弃上清。

4.用500ul3%人血清IgG封闭15min后，离心弃上清。

5.用（2.5ul*2mg/ml）标准抗体稀释到100ul1%的BSA液中（0.5ug/test） 和收集到的细胞在常温进行孵育30min，避光，注意悬浮混匀。

6.直接加500ul的FBS进行洗涤一次3000rpm5min弃上清。

7.加500ul的PBS的悬浮均匀，避光，上机测试。数细胞数多于5000个。记 录阳性细胞比例。

（4）多肽抑制TACE细胞活性的检测-MTT（噻唑蓝）法

1.将THP-1细胞用无血清培养基饥饿6小时，然后以每孔1x10^5个细胞的密度， 接种到24孔细胞培养板中，培养基最终体积500uL/孔。

2.将L929细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔细胞数1x10^5，培养基体积 100ul。

3.在THP-1细胞中，加入脂多糖（LPS）至200ng/uL，进行刺激6小时。此时， 多肽与脂多糖一起加入。

4.离心收集THP-1细胞培养液上清，该上清中含有被TACE剪切下来的可溶性 TNF-a。将其加入到L929细胞中，每孔100uL。37度孵育20小时。

5.在L929细胞中，加入5g/L的MTT（噻唑蓝）10uL，孵育4小时。

6.吸去上清，每孔加入100uL的DMSO，振荡溶解蓝色沉淀，然后在酶标仪上 读取490nm和570nm处的光吸收值。