具有对抗肺炎链球菌感染的蛋白疫苗组成物及检测样品中肺炎链球菌的方法

摘要

本发明提供一种具有对抗肺炎链球菌感染的蛋白疫苗组成物及检测样品中肺炎链球菌的方法，主要是关于疫苗的开发，以及该疫苗用于制备对抗肺炎链球菌感染的药物组合物的应用，以及检测来自尿、血及脓胸的胸腔积液等样品中是否感染肺炎链球菌。部分肺炎链球菌除了带有两种神经胺酸酶基因(即nanA和nanB)之外，还带有另一种神经胺酸酶基因(即nanC基因)。将三种全长的神经胺酸酶组合一起，提供最好的保护效果来对抗各种血清型肺炎链球菌的感染，以及中和神经胺酸酶的活性，因此可作为一个理想的通用型疫苗应试物。并且可检测样品中的肺炎链球菌，达到良好的功效。同样也定义了缩减的NanA、NanB、NanC而仍具有相当于全长功效的区域，其中对抗NanC血清同样具有抑制NanB活性的交叉保护效果。

说明书

技术领域

本发明提供一种具有对抗肺炎链球菌感染的蛋白疫苗组成物及检测样品中肺炎链球菌的方法，主要是关于蛋白疫苗组成物的开发，来对抗肺炎链球菌的感染，以及检测来自尿、血液、和脓胸的胸腔积液等样品中是否感染肺炎链球菌。更具体地说，本发明是开发通用的蛋白疫苗，来对抗各种血清型肺炎链球菌的感染。>

背景技术

肺炎链球菌是一种革兰氏阳性双球菌，其感染会导致高死亡率和高发病率（特别是在2岁以下的儿童和60岁以上的老人），就全球而言，估计肺炎球菌的感染，每年造成约一百六十万死亡的案例，尽管已有某些疫苗应用于预防肺炎链球菌感染，但因肺炎链球菌感染所导致的死亡率仍是最高的，这些相关的疾病，包括侵入性肺炎链球菌疾病（IPD），如败血症和脑膜炎；下呼吸道感染，如细菌性肺炎；和上呼吸道感染，如急性中耳炎（AOM）。>

溶血尿毒综合症（HUS）是IPD并发症中最严重的疾病之一，主要发生于儿童，而且往往也与溶血性贫血、血小板减少、和急性肾功能衰竭等疾病相关联，这种疾病，通常发生在健康的儿童，是一种最常见于急性肾功能衰竭的小儿身上。依据世界卫生组织（WHO）的报告，急性呼吸道感染一直是全球主要的死亡原因，其中以小区型肺炎链球菌相关的肺炎（CAP）为最主要的症状，可见肺炎链球菌感染的预防和检测是非常重要且必需的。>

虽然目前已有一些检测肺炎链球菌的方法，但主要仍依赖于传统的细菌培养方法，繁琐又费时，如果细菌增殖不够则检测的敏感度不高，或是利用肺炎链球菌检测试剂（如）测试尿液中的肺炎链球菌夹膜C-polysaccharide的成份，但经常出现伪阳性过高的现象，在预防上，目前大都使用疫苗PCV7及PPV23，但因它们都只针对一些肺炎链球菌特定血清型而制备的疫苗，所以反而让非疫苗保护的其他血清型肺炎链球菌逐渐增加，而且这些菌株所造成的感染病症却往往更严重。>

肺炎链球菌所产生的毒性因数有很多种，但只有分泌型的神经胺酸酶A(NanA)被认为与HUS有关，神经胺酸酶能裂解红血球细胞（RBC）、血小板、和内皮细胞 表面上的N-乙酰神经胺酸(或称唾液酸;N-acetylneuraminic acid,or sialic acid)残基，其结果导致Thomsen-Friedenrich抗原（T抗原）的曝露，如此，将允许回圈抗-T抗原的抗体与曝露于细胞上的T抗原反应，因而导致细胞的发炎甚至死亡。另一方面，T抗原从细胞表面的丛聚醣和黏蛋白上曝露后，也将有利于肺炎链球菌的附着，进而促进感染，肺炎双球菌可产生两个或三个不同的neuraminidases(NanA和NanB，或加上NanC)，这三个神经胺酸酶都是分泌型蛋白质，具有典型的胜肽信号链，其中NanA，不像NanB和NanC，还包含了一段能嵌入细胞表面中的C-末端蛋白锚区，在体内研究显示，当NanA的突变株被接种到鼻咽、气管、和肺部后，在12小时内即被清除光，而NanB突变株虽可长时间滞留，但是并没有增加其数量。然而，NanC的作用目前还不清楚。>

自从非疫苗所涵盖的肺炎链球菌血清型感染逐渐增加，而这些菌株的抗药性和毒性也随的增强，因此肺炎球菌感染的问题一直是全球公共卫生的一大挑战，开发新的疫苗和检测的方法，实为公众所殷切企盼，为相关研究者、开发人员须努力研发突破的目标及方向。>

发明内容

本发明的目的在于，提供一种具有对抗肺炎链球菌感染的蛋白疫苗组成物及检测样品中肺炎链球菌的方法，欲解决的技术问题点：肺炎链球菌的感染会导致高死亡率和高发病率，尽管已有某些疫苗应用于预防肺炎链球菌感染，但由肺炎链球菌感染所导致的死亡率仍是最高的。虽然目前已有一些检测肺炎链球菌的方法，但主要仍依赖于传统的细菌培养方法，繁琐又费时，且如果细菌增殖不够，则会导致检测的敏感度低，或是利用肺炎链球菌检测试剂测试尿液中的肺炎链球菌夹膜C-polysaccharide的成份，则会发生伪阳性过高的现象；在预防上，目前大都使用疫苗PCV7及PPV23，但因它们都只针对一些肺炎链球菌特定血清型而制备的疫苗，所以反而让非疫苗保护的其他血清型肺炎链球菌逐渐增加，导致这些菌株所造成的感染病症却往往更严重。>

解决问题的技术特点：为改善上述的问题，本发明首先开发一种具有对抗肺炎链球菌感染的蛋白疫苗组成物，其将肺炎链球菌的神经胺酸酶基因所产生的重组神经胺酸酶、生理食盐水及弗氏佐剂Freund’s adjuvant作为免疫接种的组成物，其中重组神经胺酸酶包含NanA蛋白质、NanB蛋白质和NanC蛋白质，其中以生理食盐水调合重组神经胺酸酶浓度，使其和弗氏佐剂具有相同的比重，调合后的神经胺酸酶和弗氏佐剂再以等体积比形成蛋白疫苗组成物。其可用来对抗各种血清型肺炎链球菌的感染。又，本发明另提供一种开发对抗神经胺酸酶抗体来检测样品中肺炎链球菌的方法，包含以下步骤：使用对抗神经胺酸酶NanA蛋白质、 NanB蛋白质及NanC蛋白质的抗体，其中该抗体是指直接取自血清或纯化过的抗体；及透过检测技术检测来自人体或其他生物的脓、血及尿的样品是否存在肺炎链球菌株，其中该检测技术包括西方墨点法Western hybridization、酵素联结免疫吸附反应ELISA、免疫荧光标定immunofluorescence labeling、免疫放射检测法immunoradiometric assay的任一或结合。本发明另一种检测神经胺酸酶受到抑制时的活性的方法，包含以下步骤：使用人类或动物经神经胺酸酶免疫所产生的抗体，其中该抗体是指直接取自血清或纯化过的抗体；将该抗体及一种或多种神经胺酸酶混合在一个样品中，其中该样品为红血球细胞（RBC）或任何种类的细胞品系；及使用流式细胞仪来检测神经胺酸酶的活性，其中所述的活性是以Thomsen-Friedenrich抗原（简称：T抗原）的曝露量来衡量，又该T抗原曝露量的衡量是以荧光素标定的凝集素fluorescein-labeled lectin与T抗原的结合量，来测定神经胺酸酶的活性。>

对照先前技术的功效：根据本发明的研究结果，大部分的肺炎链球菌都带有三种神经胺酸酶基因(即nanA基因、nanB基因和nanC基因)，虽然对抗NanC基因的血清抑制或中和神经胺酸酶的活性并不如抗NanA基因和抗NanB基因血清，但是本发明研究结果发现，当将三种神经胺酸酶组合一起时，却是最好的疫苗试剂，它可以作为一个理想的疫苗应试物，提供最好的保护效果，来对抗各种血清型肺炎链球菌的感染；同时也定义了最佳缩减的神经胺酸酶部分，达到良好的功效。>

有关本发明所采用的技术、手段及其功效，兹举一较佳实施例并配合图式详细说明于后，相信本发明上述的目的及特征，当可由的得一深入而具体的了解。>

附图说明

图1A、图1B、图1C：为本发明肺炎链球菌神经胺酸酶的重组克隆及次克隆的示意图。>

图2、图2A、图2B、图2C：为曝露于红血球细胞上的Thomsen-Friedenrich（TA）抗原示意图。图2D为红血球细胞的凝集效果的显微镜图。>

图3、图3A、图3B、图3C：为采用酵素连结免疫吸附试验（ELISA）来确认鼠的多克隆抗血清分别对神经胺酸酶抗原NanA、NanB及NanC的作用图。>

图4：为疫苗接种试验的结果图，其中是以血清型3的肺炎链球菌感染小鼠。>

图5：为疫苗接种试验的结果图，其中用以感染小鼠的肺炎链球菌血清型包括3(A图)、14(B图)、19A(C图)、6B(D图)、15B(E图)、和23F(F图)。>

图6A、图6B及图6C：为经神经胺酸酶免疫接种的兔子抗血清用来测试对神经胺酸酶活性的抑制示意图。>

图7A、图7B及图7C：为经神经胺酸酶免疫接种的小鼠抗血清用来测试对神经胺酸酶活性的抑制示意图。>

图8A、图8B及图8C：为经缩减的神经胺酸酶次克隆株免疫的小鼠抗血清用来测试对神经胺酸酶活性的抑制示意图。>

图9：为带有nanB和nanC神经胺酸酶基因的野生株相对于突变株在感染后不同时期中，对红血球细胞上的T抗原曝露的比较示意图。>

具体实施方式

本发明首先提供一种开发神经胺酸酶抗体来检测样品中肺炎链球菌的方法，包含以下步骤：使用对抗神经胺酸酶NanA蛋白质、NanB蛋白质及NanC蛋白质的抗体，其中该抗体是指直接取自血清或纯化过的抗体；透过检测技术检测来自人体或其他生物的脓、血及尿的样品是否存在肺炎链球菌株，其中该检测技术包括西方墨点法Western hybridization、酵素联结免疫吸附反应ELISA、免疫荧光标定immunofluorescence labeling、免疫放射检测法immunoradiometric assay的任一或结合。前述的方法更包含使用基因扩增仪PCR来扩增与肺炎链球菌引起溶血尿毒综合症HUS相关联的基因，并检测该与肺炎链球菌引起溶血尿毒综合症(hemolytic uremic syndrome，HUS)相关联的基因的步骤，其中该基因包含nanA基因、nanB基因和nanC基因。本发明的实施详细说明如下：>

肺炎链球菌神经胺酸酶基因nanA、nanB和nanC检测：>

神经胺酸酶NanA基因和NanB基因已经被认为是肺炎链球菌的毒力因数的一，然而NanC基因的功能仍不清楚。本发明自一位有溶血尿毒综合症（hemolytic uremic syndrome，HUS）的小孩中所分离到的肺炎链球菌血清型14，发现其全基因组含有的nanC基因，为了证实nanC基因如同nanA基因及nanB基因是一种重要的毒力因数，本发明设计了可为基因扩增仪PCR扩增nanA基因、nanB基因及nanC基因的三组引子对primer sets，用来检测及选殖神经胺酸酶基因，包括nanA(Sequence ID No.1)、nanB(Sequence ID No.2)、及nanC(Sequence ID No.3)，其序列是依据肺炎链球菌血清型14的全基因组序列(NCBI的登录号NC_010582)，尤其用来检测那些具侵入性肺炎链球菌感染症(包括HUS)的样品分离株。>

扩增nanA基因、nanB基因及nanC基因和其缩减的次克隆株的六组引子对的设计：>

设计用来扩增神经胺酸酶基因nanA、nanB及nanC的六组引子对有两种目的：其一是分别用来检测基因nanA、nanB及nanC；其二是将基因片段接入表现载体上。详细的应用请见后述。>

1.扩增nanA基因引子对(序列编号为Seq.ID No.1)>

NanA-ATG-Kpn1:5’-AGATCTGGGTACCATGTCTTATT>

NanA-TAA-Xho1:5’-TGGTG CTCGA>TTGTTCTCTCTTTTTCCCT A>

预期增幅的大小为2964bp。>

2.扩增nanB基因引子对(序列编号为Seq.ID No.2)>

NanB-ATG-Kpn1:5’-AGATCTGGGTACCATGAATA>

NanB-TAA-Xho1:5’-TGGTG CTCGA>TTTTGTTAA ATCATTAATT TC>

预期增幅的大小为2115bp。>

3.扩增nanC基因引子对(序列编号为Seq.ID No.3)>

NanC-ATG-Kpn1:5’-AGATCTGGGTACCATGAAAAAAAAT>

NanC-TAA-Xho1:5’-TGGTG CTCGA>ATTCTTTTTCAGATCTTCA A>

预期增幅的大小为2244bp。>

4.扩增nanA4次克隆株基因引子对(该扩增DNA片段相对应的胺基酸序列为序列编号Seq.ID No.4)>

NanA4-Kpn1:5’-AGATCTGGGTACC>

NanA4-Xho1:5’-TGGTG CTCGA> TGATAGGGTATAGGCATTTT>

预期增幅的大小为2100bp，而相对应的胺基酸(aa)数目为700。>

5.扩增nanB3次克隆株基因引子对(该扩增DNA片段相对应的胺基酸序列为序列编号Seq.ID No.5)>

NanB3-Kpn1:5’-AGATCTGGGTACC>

NanB3-Xho1:5’-TGGTG CTCGA> TTGAGTAGAATCTCCTGATT>

预期增幅的大小为720bp，而相对应的胺基酸(aa)数目为240。>

6.扩增nanC4次克隆株基因引子对(该扩增DNA片段相对应的胺基酸序列为序列编号Seq.ID No.6)>

NanC4-Kpn1:5’-AGATCTGGGTACC>

NanC4-Xho1:5’-TGGTG CTCGA>ACTTGTAGCAATATTAATTT>

预期增幅的大小为975bp，而相对应的胺基酸(aa)数目为325。>

这些引子对的特征为:粗体字代表来自神经胺酸酶基因的序列；底线字GGTACC及CTCGAG分别是KpnI及XhoI的辨识切位元，其目的是用于基因选殖时切位的剪接。至于KpnI及XhoI的辨识切位的5’端序列则有利于KpnI及XhoI酵素的作用。>

肺炎链球菌分离株的神经胺酸酶nanA基因、nanB基因及nanC基因的检测：>

本发明相关的肺炎链球菌感染症都是来自林口长庚纪念医院的临床资料。定义侵入性肺炎球菌疾病IPD的个案通常是指从一般无菌部位，如血液，脑脊液，或胸水中，可以分离得肺炎链球菌。其中于2006年1月至2009年12月期间，年龄都是不到18岁的儿童，因溶血尿毒综合症HUS而住院的患者都是本发明研究的物件，溶 血尿毒综合症的定义都是根据美国疾病控制和预防中心所陈述的方法，其中，检测为溶血尿毒综合症，是以凝血法进行检查，但原已存在的正常纤维蛋白原所造成的弥漫性血管内凝血现象则会被排除，溶血尿毒综合症病人的疾病是以花生凝集素启动T抗原并造成凝集的方法来获得验证。>

本研究选用来自溶血尿毒综合症HUS的病患及非溶血尿毒综合症HUS对照组病患所分离的72株肺炎链球菌，并以本发明的引子对来PCR扩增nanA、nanB及nanC基因的方法，可验证此三种基因在肺炎链球菌中存在的比率。本发明的溶血尿毒综合症HUS病人及非溶血尿毒综合症HUS对照组中的肺炎链球菌分离株之间其神经胺酸酶基因nanA、nanB、及nanC的百分比，结果显示所有的肺炎链球菌都带有nanA基因及nanB基因，然而89%溶血尿毒综合症HUS病患中的肺炎链球菌带有NanC基因；只有41%的非溶血尿毒综合症HUS病患的肺炎链球菌带有nanC基因。因此，本发明的引子对用基因扩增仪PCR扩增nanA基因、nanB基因及nanC基因的方法，可用以验证肺炎链球菌是否存在样品中。>

又，本发明是一种检测神经胺酸酶的活性受到抑制时的方法，包含以下步骤：使用人类或动物经神经胺酸酶免疫所产生的抗体，其中该抗体是指直接取自血清或纯化过的抗体；将该抗体及一种或多种神经胺酸酶混合在一个样品中，其中该样品为红血球细胞（RBC）或任何种类的细胞品系；及使用流式细胞仪来检测神经胺酸酶的活性，其中所述的活性是以T抗原的曝露量来衡量，又该T抗原曝露量的衡量是以荧光素标定的凝集素fluorescein-labeled lectin与T抗原的结合量，来测定神经胺酸酶的活性。其中，前述的方法更包含在低温下让凝集素与细胞作用的步骤，其低温温度为低至4℃或在0～10℃间，可以防止细胞的凝集，进而避免该流式细胞仪管线的堵塞。本发明的实施详细说明如下：>

肺炎链球菌的神经胺酸酶NanA、NanB和NanC的生物功能检测：>

为了分析肺炎链球菌的神经胺酸酶NanA、NanB和NanC的生物功能，本发明利用前述的引子对，选殖基因nanA、nanB及nanC，并表现和纯化这些重组NanA蛋白质、NanB蛋白质和NanC蛋白质。这些蛋白质的生物功能检测包括红血球细胞T抗原的曝露和受质专一性，详细叙述如下:>

基因nanA、nanB及nanC的选殖、表现和纯化：>

请参阅图1所示，为重组克隆示意图，每个PCR扩增的神经胺酸酶基因片段（包括nanA、nanB、及nanC），都是基于肺炎链球菌株CGSP14的基因组序列，将基因克隆到一个表达载体，如pET29b(Novagen,Merck,Darmstadt,Germany)。通过限制性内切酶KpnI和XhoI将DNA切割，并以接合酶接合DNA片段。序号ID（从1号至6号）表示基因的DNA序列和次克隆株的氨基酸序列。依据肺炎链球菌品系CGSP14全基因组序列(NCBI登录号NC_010582)的神经胺酸酶基因nanA(序列编号 Seq.ID No.1)、nanB(序列编号Seq.ID No.2)、及nanC(序列编号Seq.ID No.3)的序列，利用前述用来扩增nanA基因、nanB基因及nanC基因的三组引子对来分别PCR扩增神经胺酸酶基因，并以KpnI及XhoI的限制酶将扩增的DNA片段选殖进入一个表现载体中，本发明只选择一般的载体pET29b(Novagen,MERCK,Darmstadt,Germany)即可(图1A)。而此重组质粒可在大肠杆菌BL21(DE3)中以isopropyl β-D-1-thiogalactopyranos ide(IPTG；最后浓度1μg/mL)来诱导大量表现重组蛋白质，其中使用Luria-Bertani(LB)培养液，在37℃下培养4小时。之后收集菌株，并利用Nickel(Ni2⁺)亲合性色层分析法的Nickel-Chelating树酯(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)将重组蛋白质纯化出来。此重组蛋白质为一融合蛋白质，带有来自pET29b的His-tag部分，可以与Nickel-Chelating树酯结合，因而可以很方便地被纯化出来。另一方面一系列缩减的神经胺酸酶基因(图1B、图1C)也以相同的方法来选殖、表现、和纯化这些次克隆株蛋白质。这些次克隆株包括来自NanA的NanA1(501～780胺基酸序列的区域)、NanA2(501～620胺基酸序列的区域)、NanA3(1～325胺基酸序列的区域)和NanA4(80～780胺基酸序列的区域)，自NanB的NanB3(1～240胺基酸序列的区域)，以及自NanC的NanC1(382～473胺基酸序列的区域)、NanC2(578～663胺基酸序列的区域)、和NanC4(1～325胺基酸序列的区域)。其中的次克隆株NanA4(胺基酸序列为序列编号Seq.ID No.4)则涵盖NanA的LamG(一种lectin凝集素)和唾液酸酶sialidase超级同源家族的区域，而NanB3(胺基酸序列为序列编号Seq.ID No.5)和NanC4(胺基酸序列为序列编号Seq.ID No.6)则分别涵盖NanB和NanC的LamG超级同源家族的区域。因此三个缩减后的区域具有等同其所属的神经胺酸酶全长的生物功效(请见图8的免疫血清对神经胺酸酶活性抑制效果的部分)，所以特别呈现其胺基酸序列。>

利用细胞上T抗原的呈现来确认重组的神经胺酸酶的活性：>

如图2A、图2B、图2C所示，重组的神经胺酸酶活性的检测是利用细胞上T抗原的呈现来评估。凝集素通常被用来识别残糖缀合物(glycoconjugate residues)，如T抗原即为一种残糖缀合物。荧光素标记的花生凝集素(Fluorescein-labeled peanut agglutinin,PNA;Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA94010,U.S.A.)是一般用来检测T抗原的标记物。另外，荧光标记的接骨木黑质凝集素(Fluorescein-labeled Sambucus Nigra lectin,SNA;Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA94010,U.S.A.)及生物素标记的怀槐凝集素II(biotinylated Maackia Amurensis lectin II,MAL II;Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA94010,U.S.A.)则是分别用来辨识α2-6及α2-3唾液酸化联系(sialyl linkages)的标记物。>

为了要检测细胞上的残糖缀合物的量，本发明的研究依据一般的方法，如AABB 标准法(http://freetechebooks.com/ebook-2011/aabb-technical-manual.html)，从健康人身上纯化新鲜红血球(RBC)细胞，约3x10⁷cells/mL来作测试。同时也取用组织培养的细胞株(1x10⁶cells/mL)来测试，如A549(human>TM)和HK-2(human>TM)。培养液选择使用DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)外加Ham F12营养液，并于37℃下与纯化的重组神经胺酸酶(1μg与RBC作用;0.1μg与A549andHK-2作用)作用1～2小时。>

以流式细胞仪分析重组神经胺酸酶对细胞作用后所呈现的T抗原时，检测10,000-20,000的细胞量，不管是使用那一种的T抗原标记物(如PNA、SNA、或MALII)，都必须在4℃下作用1小时，而非较高的温度(如37℃)，或较长的时间(如过夜)，以必免造成细胞凝集而导致流式细胞仪管线的堵塞。如要检测细胞凝集的现象，可将20μl的T抗原标记物及神经胺酸酶所作用过的细胞置于显微镜下镜检。>

虽然已知神经胺酸酶NanA会造成红血球、血小板和肾小球细胞的T抗原的呈现，然而NanC在毒力因数的角色却尚未被定位，尤其与HUS的关联性则尚未被报导。为了证明NanC在毒力因数所扮演的角色，我们首先证明重组的NanC呈现细胞的T抗原的能力。图2A、图2B、图2C为曝露于细胞上的T抗原示意图，在流式细胞仪上，利用FITC标记的PNA结合凝集素呈现的荧光来检测TA曝露量，数位表明荧光计数的样本，包括未经处理的细胞（以黑框表示），NanA处理组（白），NanB处理组（灰色），和NanC处理组（斜纹）。NanA（0.01μg），NanB（1μg）和NanC（1μg）可以曝露红血球细胞TA的量（见图2A）。NanA、NanB和NanC（全部为1μg）可以曝露A549细胞（见图2B）和HK-2细胞（见图2C）TA的量。20μl分装的PNA凝集素标记的红血球细胞用于流式细胞仪分析，在37℃显微镜下观察，以验证凝集。以NanA、NanB和NanC（0.1μg）处理后，观察红血球细胞的凝集效果（请参阅图2D所示）。故当NanA的使用量大于0.01μg时，其呈现RBC细胞T抗原的能力已达到饱和。并且0.01-μg NanA的活性相当于1-μg NanB及1-μg NanC所能呈现RBC细胞T抗原的能力，即分别是9.4x10²及5.3x10²的倍数。并且在显微镜下镜检RBC细胞受PNA标记物凝集的现象时，发现NanA的凝集程度也比NanB和NanC强很多(请见图2D)，但在对照组中，无神经胺酸酶处理的RBC细胞，即使加入PNA标记物则仍无凝集的现象发生。另外当使用A549细胞时，NanA的活性仅高于NanB及NanC所能呈现细胞T抗原的能力，即分别高于2.2及3.3倍；同样当使用HK-2细胞时，NanA的活性高于NanB及NanC所能呈现HK-2细胞T抗原的能力仅都仅有1.5倍。>

最后，本发明提供一种本发明疫苗组合物用于制备对抗肺炎链球菌感染的药物组合物中的应用，其中，该肺炎链球菌包含所有类型的血清型菌株，所述药物 组合物的施用包含以下步骤：将肺炎链球菌血清型14菌株CGSP14的三种神经胺酸酶基因所产生的重组神经胺酸酶：即NanA、NanB和NanC蛋白质作为免疫接种的组成物，并施打在人类或其他动物等主体中；其中，该主体受到该重组神经胺酸酶的施打会引起肺炎链球菌的免疫反应，可用来免疫该主体以对抗肺炎链球菌的感染。前述的药物组合物的应用更包含使用专一性抗体作为被动免疫的步骤，其中，该专一性抗体是由该主体经神经胺酸酶免疫所产生的神经胺酸酶抗体。又，在该药物组合物中，可添加辅助材料，包括使用所有类型分子的佐剂，以提高免疫反应。本发明的实施详细说明如下：>

重组的神经胺酸酶NanA、NanB和NanC当作抗原，以作为免疫保护的用途：>

为了要发展一理想的疫苗来对抗肺炎链球菌的感染，本发明发展了通用的蛋白质疫苗，即选择使用肺炎链球菌的三种神经胺酸酶当作疫苗，来测试其免疫小鼠的效果，同时本发明也以现有的疫苗PPV23当作对照组。另一方面，经过神经胺酸酶免疫的抗神经胺酸酶血清，也被应用来抑制神经胺酸酶的活性。>

小鼠对抗肺炎链球菌的免疫作用：>

请先参考图3、图4及图5所示。图3显示采用酵素链结免疫吸附试验（ELISA）来确认鼠的多克隆抗血清对三种神经胺酸酶抗原NanA(图3A)、NanB(图3B)及NanC(图3C)的作用。用ELISA法进行测试，测试老鼠于免疫前(黑框)与免疫后（灰框）其抗血清对神经胺酸酶抗原的作用，而阴性对照组为只加生理食盐水PBS和弗氏佐剂Freund’s adjuvant但无抗原的填加（白框），先将各别的神经胺酸酶NanA、NanB及NanC(10μg/ml，100μl in PBS/小凹洞，4℃，16小时处理)黏附在96小凹洞的ELISA平板上，而后以200-μl10%牛血清(bovine serum albumin,BSA)于室温处理一小时，再将抗神经胺酸酶的血清加入小凹洞中，而这些抗神经胺酸酶的血清组合包括个别的神经胺酸酶（NanA、NanB或NanC）、神经胺酸酶A+B（NanA+NanB）、和三种神经胺酸酶A+B+C（NanA+NanB+NanC），为进行定量抗原抗体的相互作用，本发明使用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（Sigma公司）作为第二抗体，和使用四甲基联苯胺/过氧化（R&D Systems,Minneapolis,MN，美国）为显色底物，而显色底物在ELISA分析仪的最大吸收带为波长405nenometer（EMax,Molecular Devices,Sunnyvale,CA94089，美国），Y轴以对数值来表示。抗体抗原反应以对数值表示。又图4显示疫苗接种试验的结果，将个别或三个不同组合的神经胺酸酶(NanA、NanB和NanC)10μg，被应用作为抗原，免疫小鼠（BALB/C，一个月大）以2周的时间间隔注射四次，并与PPV23疫苗和阴性对照组（生理食盐水PBS+弗氏佐剂Freund’s adjuvant）作比较。3x10³CFU(菌数量)的肺炎链球菌”血清型3”用来感染那些经神经胺酸酶免疫的小鼠。其中，弗氏完全佐剂complete Freund’s adjuvant为首次免疫接种时使用，而 弗氏不完全佐剂incomplete Freund’s adjuvant则为之后的三次免疫接种时使用。分别采用免疫接种的比例为1:1的佐剂与抗原的比率。在四次神经胺酸酶免疫接种小鼠和随后的肺炎链球菌的感染，之后则观查喂食14天内小鼠的存活率（％）变化，其中，n是试验老鼠的数量。又图5显示疫苗接种试验对不同血清型肺炎链球菌感染的结果，将三个不同组合的神经胺酸酶(NanA、NanB和NanC)各10μg作为抗原，分别免疫5只小鼠（BALB/C，一个月大）。>

由图3、图4及图5所示，本发明是利用重组的NanA、NanB及NanC蛋白质当作抗原物，用以免疫小鼠来对抗各种血清型的肺炎链球菌感染。为了比较各种抗原物的免疫效果，各别或组合的神经胺酸酶NanA、NanB及NanC(10-μg抗原/注射；约为0.5毫克/每公斤重的动物体)用以免疫一个月大的BALB/C小鼠，每两周注射一次，共四次，同时多醣体疫苗PPV23(23-valentMerck Sharp&Dohme Corp.,NJ08889,USA)被用来当作正对照组；并且生理食盐水PBS则被当作负的对照组。弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂分别用于第一次及2-4次时与抗原1:1混合，而后再注射小鼠。注射四次共八周后，一方面抽取小鼠的血清，以酵素连结免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法分析抗体-抗原的反应(图3)；另一方面以尾静脉注射方式，将血清型3的肺炎链球菌(3x10³cfu)注入小鼠中感染小鼠，并观察之后14天中小鼠的存活率(图4)；以及血清型3(5x10⁶cfu)、血清型6B(7x10⁸cfu),血清型14(1x10⁸cfu),血清型15B(7x10⁸cfu),血清型19A(7x10⁸cfu)及血清型23F(1x10⁸cfu)，并观察之后15天中小鼠的存活率(图5)。>

为了确认被神经胺酸酶免疫的小鼠中获得抗神经胺酸酶的多克隆(polyclonal)血清的效力，本发明使用96小凹洞的ELISA平板(Corning Incorporated,Corning,New York,USA)分析抗体-抗原的反应，先将神经胺酸酶NanA、NanB及NanC黏附于ELISA平板小凹洞内，再将各种抗神经胺酸酶的多克隆血清加入各小凹洞中，而这些抗神经胺酸酶的血清组合包括个别的神经胺酸酶（NanA、NanB或NanC）、神经胺酸酶A+B（NanA+NanB）、和三种神经胺酸酶A+B+C（NanA+NanB+NanC）。并使用芥末过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（Sigma公司）作为第二抗体，和使用四甲基联苯胺/过氧化（R&D Systems,Minneapolis,MN，美国）来显色(波长405nenometer)（EMax,Molecular Devices,Sunnyvale,CA94089，美国）。>

结果显示经神经胺酸酶免疫的小鼠所产生的抗神经胺酸酶的多克隆血清，相对于对照组(只用PBS混合上弗氏完全佐剂与不完全佐剂)，均能专一地辨识神经胺酸酶，当抗体抗原反应值以对数表示时，均能有3-4对数值的增加。显示以神经胺酸酶是一种理想的试剂来免疫小鼠，产生抗神经胺酸酶的抗体。>

为了发展对付各种血清型的肺炎链球菌的疫苗，本发明使用单一或三种神经胺酸酶的组合当作免疫小鼠的试剂。其将肺炎链球菌的神经胺酸酶基因所产生的重组神经胺酸酶、生理食盐水PBS及弗氏佐剂Freund’s adjuvant作为免疫接种的组成物，其中重组神经胺酸酶包含NanA蛋白质、NanB蛋白质和NanC蛋白质，其中该弗氏佐剂可为完全或不完全的弗氏佐剂complete or incomplete Freund’s adjuvant。该组成物制造步骤为：1.根据动物体的重量来决定神经胺酸酶的剂量，即在每公斤重的动物体施用NanA、NanB及NanC中之一或者几种组成各0.5毫克的神经胺酸酶。2.以生理食盐水调合神经胺酸酶浓度，使其和弗氏佐剂具有相同的比重。3.将经由步骤2调合后的神经胺酸酶和完全或不完全的弗氏佐剂以等体积比调合完成蛋白疫苗组成物，其实施方式为每两周为一间隔施打动物体一次，共四次施打。其中第一次施打使用含完全弗氏佐剂的蛋白疫苗组成物，而其余三次则使用含不完全弗氏佐剂的蛋白疫苗组成物。最后一次疫苗试剂施打后隔两周，再给予不同血清型肺炎链球菌的感染，而感染动物体的方式是以静脉注射法进行。其中使用的菌数分别为3x10³cfu肺炎链球菌血清型3(图4)，5x10⁶cfu血清型3(图5A),1x10⁸cfu血清型14(图5B),7x10⁸cfu血清型19A(图5C),7x10⁸cfu血清型6B(图5D),7x10⁸cfu血清型15B(图5D),1x10⁸cfu血清型23F(图5E)。每天记录小鼠的存活率。>

结果如图4所示，当同时使用三种神经胺酸酶(NanA、NanB及NanC)为疫苗的试剂时，小鼠的存活率最高，达67%，其效果如同使用现行的疫苗PPV23。但是结果如图5所示，当同时使用三种神经胺酸酶(NanA、NanB及NanC)为疫苗的试剂时，小鼠对付各种血清型(3、14、19A、6B、15B、和23F)的肺炎链球菌感染的存活率，分别高达60%、60%、20%、60%、40%、及40%，其效果都优于使用现行的疫苗PPV23。故一起使用三种神经胺酸酶的组合是一种最具潜力的通用型蛋白质疫苗试剂，可用以对付各种血清型的肺炎链球菌感染。>

该蛋白疫苗组成物可应用于神经胺酸酶酵素的大量工业生产，并成为商品化的产品。此神经胺酸酶酵素可以作为对其专一性受质(substrate)，如唾液酸(Sialic Acid)，的专一性结合和化学反应的应用。>

抗体或免疫后的抗血清对神经胺酸酶活性的抑制作用：>

请先参考图6、图7及图8，显示神经胺酸酶活性受到专一性的抗体所抑制的相关试验，依据”利用细胞上T抗原的呈现来确认重组的神经胺酸酶的活性”单元所描述的方法，即由全长及缩减的重组神经胺酸酶(NanA、NanB或NanC)免疫兔子及小鼠后，所产生的抗神经胺酸酶血清被用来抑制神经胺酸酶的活性。其中，图6A、图6B及图6C为经神经胺酸酶免疫接种的兔子抗血清用来测试对神经胺酸酶活性的抑制作用示意图；又图7A、图7B及图7C为经神经胺酸酶免疫接种的小 鼠抗血清用来测试对神经胺酸酶活性的抑制作用示意图；又图8A、图8B及图8C为经缩减的神经胺酸酶次克隆株免疫接种小鼠的抗血清用来测试对神经胺酸酶活性的抑制作用示意图。以FITC标记的PNA lactin来识别T抗原，并利用流式细胞仪来定量分析神经胺酸酶作用在红血球细胞表面所产生的T抗原曝露量，个别的NanA、NanB和NanC神经胺酸酶分别与不同的抗神经胺酸酶抗血清（30μg/mL）作用，其中还包括已纯化的NanC抗血清，其中，图6A、图7A分别表示兔子及小鼠的抗神经胺酸酶抗血清分别与不同量的NanA作用，这些NanA的测试量分别在图6A中是1μg（黑框）、0.1μg（白框）、和0.01μg（灰框），以及在图7A中是1μg（黑框），以及在图8A中是0.0005μg（黑框）；图6B、图7B图分别表示1μg的NanB分别与兔子及小鼠的抗神经胺酸酶抗血清作用（白框），以及在图8B中是0.005μg（黑框）；图6C、图7C表示1μg的NanC分别与兔子及小鼠的抗神经胺酸酶抗血清作用（灰框），以及在图8C中是0.05μg（黑框）。“*”表示p<0.05，为相对于对照组具有显著性，即免疫前血清的对照处理。>

其中为了更有效率的抑制神经胺酸酶的活性，本发明利用蛋白质A(Protein A Sepharose beads,GE Healthcare)来纯化抗NanC的血清。抑制神经胺酸酶的活性的测定方法如下:>

在10-μl PBS中加入不同量的神经胺酸酶，并与10-μL不同来源的血清，于室温下作用5分钟。为了要量化神经胺酸酶被抑制的活性，本发明以RBC细胞的T抗原呈现的程度作为依据，并利用经FITC荧光标定的PNA凝集素(FITC-labeled PNA lectin)，在4℃下作用1小时，来定量T抗原。特别之处是在4℃及1小时下，凝集素只会与T抗原结合，而不易造成细胞的凝集，如此可避免因细胞团块的形成而造成流式细胞仪分析管线的阻塞，如果神经胺酸酶的活性被专一的抗神经胺酸酶的血清所抑制，则FITC荧光标定T抗原的量将降低。>

如图6A、图6B及图6C的y轴显示，NanB和NanC呈现T抗原的能力似乎远低于NanA，当使用来自兔子的抗神经胺酸酶血清时，本发明的研究发现：0.1-μg和0.01-μg的NanA可被10-μL的抗NanA血清完全的抑制，但1-μg NanA被10-μL的抗NanA血清作用后，仍残余有20%的活性(图6A)；然而1-μg NanB却可被10-μL的抗NanB血清完全的抑制(图6B)；但1-μg NanC却只可被10-μL的抗NanC血清抑制40%的活性，其中，当使用纯化过的30-μg抗NanC抗体时，则可抑制90%NanC的活性(图6C)。>

至于特定的抗神经胺酸酶血清也被用来测试其交叉保护作用。结果发现抗NanA血清并不能抑制NanB和NanC的活性，同样抗NanB和NanC血清也不能抑制NanA的活性(图6A)；然而，抗NanB血清则可以抑制74%NanC的活性；抗NanC血清和纯化的抗NanC抗体相较于免疫前的血清，则分别可以抑制40%及76%NanB 的活性(图6B及图6C)。>

另一方面，本发明以系列稀释的抗血清，作用于不同量的神经胺酸酶时，可以抑制50%神经胺酸酶活性，结果发现1、8和32倍稀释的抗NanA血清，分别可以使得1、0.1和0.01μg的NanA，失去50%神经胺酸酶活性。然而16倍稀释的抗NanB血清，可以使得1μg的NanB，失去50%神经胺酸酶活性；以及当抗NanC血清和纯化的抗NanC抗体分别做1和8倍稀释时，则可以使1μg的NanC失去50%神经胺酸酶活性。>

当使用小鼠的抗神经胺酸酶血清，来抑制神经胺酸酶的活性时，其结果与来自兔子的血清是类似的(如图7A、图7B及图7C所示)。10-μL小鼠的抗NanA及NanB血清分别可以完全抑制0.1-μg NanA和1-μg NanB的活性；然而，10-μL小鼠的抗NanC血清相较于免疫前的血清则只可以抑制约50%NanC(1-μg)的活性。>

当进一步使用来自一系列缩减的神经胺酸酶次克隆株免疫小鼠所产生的抗神经胺酸酶血清时(如图8A、图8B及图8C所示)，比较其抑制神经胺酸酶活性的效果，是否能与先前来自经全长神经胺酸酶免疫兔子及小鼠的血清一样(如图6及图7所示)。其结果显示只有次克隆株NanA4、NanB3、及NanC4具有等同全长神经胺酸酶的功效。其中以NanC4免疫小鼠的血清除了可以专一性地抑制NanC神经胺酸酶活性之外，还可以交叉抑制NanB神经胺酸酶的活性。>

NanB和NanC神经胺酸酶的突变株对红血球细胞上T抗原曝露的影响：>

为了证明不只NanA还有NanB和NanC神经胺酸酶同样具有重要的生物功能。先建构NanB和NanC神经胺酸酶的突变株，并将突变株以静脉内注射方式感染小鼠，分析小鼠红血球细胞上T抗原曝露的差异(如图9)。>

为了建构NanB和NanC神经胺酸酶的突变株，先以PCR扩增nanB和nanC基因。类似于图1A所述，使用一般的载体，如TA选殖载体(RBC Biosicience,台湾)，将扩增的基因载入载体中。另一方面以PCR扩增对spectinomycin具有抗性的基因“spc”(GI:1185605;accession number:CVU46202)，再分别接入nanB和nanC基因的MscI及DraI限制酶切位中，并用以转形大肠杆菌，及以spectinomycin来筛选具有spectinomycin抗性的克隆株，即为nanB::spec和nanC::spec的突变克隆株。此突变克隆株的DNA即可用以转形肺炎链球菌6B。因nanB::spec和nanC::spec的突变克隆DNA无法在肺炎链球菌中存活，所以当以spectinomycin来筛选具有spectinomycin抗性的克隆株，即代表此DNA已发生双重组同源交换(double-crossing-over homologous recombination)而嵌插入染色体中，如此分别获得肺炎链球菌6B的nanB和nanC突变株。>

如图9所示为研究肺炎链球菌nanB和nanC突变株对红血球细胞上T抗原曝 露的影响。将nanB和nanC突变株以及野生型6B肺炎链球菌分别以静脉注射法接种BALB/c小鼠，此三种处理都分别接种16只小鼠，并且以PBS作为无任何菌种处理的负对照组。而后在第一(图9A)、第二(图9B)、第三(图9C)、第五(图9D)、和第七天(图9E)时分别采集受测小鼠的红血球细胞，作为T抗原曝露的分析。如先前作为T抗原曝露分析的方法，T抗原曝露可因神经胺酸酶的作用而产生因而可以被FITC荧光标定的PNA lectin凝集素所结合。以此在流式细胞仪的P1门内(gating area)被FITC标定的红血球，除上红血球的总数，即可获得百分比。比较此四种处理的P1荧光标记百分比，结果显示在小鼠的活体中肺炎链球菌nanB和nanC突变株的神经胺酸酶作用在活血球的T抗原上，都显著地比野生型菌株的活性还低。尤其在第二、第五、及第七天时都具有显著的意义(统计分析的p值都小于0.05)。其中在图9F中则是以第七天的结果进一步计算所有测试的红血球T抗原的百分比，即以阳性与阴性的百分比做为呈现的方式；结果同样显示在小鼠的活体中肺炎链球菌nanB和nanC突变株的神经胺酸酶作用在活血球的T抗原呈现上，都显著地比野生型菌株的活性还低。由此可知肺炎链球菌的NanB和NanC神经胺酸酶在小鼠的活体中，同样都具有重要的生物功能。>

综合上述结果显示，不管来自兔子或小鼠所产生的抗神经胺酸酶血清都具有专一性地抑制或中和神经胺酸酶的活性。同时也定义了最佳缩减的神经胺酸酶的次克隆株，其作用等同全长的神经胺酸酶的效果，即免疫小鼠所产生的抗神经胺酸酶血清都具有专一性抑制或中和神经胺酸酶的等效活性。另一方面，只有抗NanB和抗NanC血清具有交叉保护作用，而抗NanA血清则没有此作用。虽然抗NanC血清抑制或中和神经胺酸酶的活性并不如抗NanA和抗NanB血清，以及使用单一种或两种(NanA+NanB)神经胺酸酶，其功效也都不如以三种神经胺酸酶组合一起的使用还要好。显示当使用三种神经胺酸酶组合一起时，会是最好的疫苗试剂。>

前文针对本发明的较佳实施例为本发明的技术特征进行具体的说明；惟，熟悉此项技术的人士当可在不脱离本发明的精神与原则下对本发明进行变更与修改，而该等变更与修改，皆应涵盖于如下申请专利范围所界定的范畴中。>

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