一种太湖新银鱼微卫星DNA分子标记的引物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种太湖新银鱼微卫星DNA分子标记的引物及其制备方法。所述太湖新银鱼微卫星DNA分子标记的引物包括：如序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.38所示的引物。所述制备方法包括：将太湖新银鱼的基因组的酶切片段经第一次PCR扩增后与生物素重复探针杂交，将杂交产物通过磁珠富集法筛选出微卫星片段，将微卫星片段经过克隆和阳性鉴定后进行测序，得到相应的微卫星位点序列；设计引物，引物与太湖新银鱼的基因组进行PCR扩增；将扩增产物采用电泳分离，再经过固定、银染处理；挑选出多态性位点的微卫星引物。利用该制备方法得到的19对引物能在太湖新银鱼的样本中扩增出条带清晰、多态性高的微卫星条带，有助于对太湖新银鱼从遗传学的角度去分析其入侵适应机制。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种太湖新银鱼微卫星DNA分子标 记的引物及其制备方法。

背景技术

太湖新银鱼(Neosalanxtaihuensis)属鲑形目，银鱼科，新银鱼属，是长江 中下游及其附属湖泊重要的小型经济鱼类，主要生活在敞水区的中上层，其终 生以浮游动物中的枝角类和挠足类为主要食物。由于银鱼便于冷冻、晒干、储 藏、运销，在国内外具有广阔的市场，是优良的绿色食品。

太湖新银鱼作为我国最广泛的移植对象，移植到我国不同大小湖泊和水库 中，由于其自身的生物学特性快速适应当地环境成为外来入侵种。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：

太湖新银鱼入侵机制的研究主要是在遗传学方面，但是，现有技术中对于 太湖新银鱼从遗传学的角度去分析其入侵成功的研究还未开展。

发明内容

为了解决现有技术中对太湖新银鱼的入侵机制的研究还未开展的问题，本 发明实施例提供了一种太湖新银鱼微卫星DNA分子标记的引物及其制备方法。 所述技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种太湖新银鱼微卫星DNA分子标记的引物，包括：

Nt38正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；

Nt38反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；

Nt39正向引物如序列表中SEQ ID NO.3所示；

Nt39反向引物如序列表中SEQ ID NO.4所示；

Nt43正向引物如序列表中SEQ ID NO.5所示；

Nt43反向引物如序列表中SEQ ID NO.6所示；

Nt45正向引物如序列表中SEQ ID NO.7所示；

Nt45反向引物如序列表中SEQ ID NO.8所示；

Nt49正向引物如序列表中SEQ ID NO.9所示；

Nt49反向引物如序列表中SEQ ID NO.10所示；

Nt50正向引物如序列表中SEQ ID NO.11所示；

Nt50反向引物如序列表中SEQ ID NO.12所示；

Nt52正向引物如序列表中SEQ ID NO.12所示；

Nt52反向引物如序列表中SEQ ID NO.14所示；

Nt54正向引物如序列表中SEQ ID NO.15所示；

Nt54反向引物如序列表中SEQ ID NO.16所示；

Nt55正向引物如序列表中SEQ ID NO.17所示；

Nt55反向引物如序列表中SEQ ID NO.18所示；

Nt56正向引物如序列表中SEQ ID NO.19所示；

Nt56反向引物如序列表中SEQ ID NO.20所示；

Nt57正向引物如序列表中SEQ ID NO.21所示；

Nt57反向引物如序列表中SEQ ID NO.22所示；

Nt59正向引物如序列表中SEQ ID NO.23所示；

Nt59反向引物如序列表中SEQ ID NO.24所示；

Nt61正向引物如序列表中SEQ ID NO.25所示；

Nt61反向引物如序列表中SEQ ID NO.26所示；

Nt63正向引物如序列表中SEQ ID NO.27所示；

Nt63反向引物如序列表中SEQ ID NO.28所示；

Nt67正向引物如序列表中SEQ ID NO.29所示；

Nt67反向引物如序列表中SEQ ID NO.30所示；

Nt70正向引物如序列表中SEQ ID NO.31所示；

Nt70反向引物如序列表中SEQ ID NO.32所示；

Nt71正向引物如序列表中SEQ ID NO.33所示；

Nt71反向引物如序列表中SEQ ID NO.34所示；

Nt74正向引物如序列表中SEQ ID NO.35所示；

Nt74反向引物如序列表中SEQ ID NO.36所示；

Nt79正向引物如序列表中SEQ ID NO.37所示；

Nt79反向引物如序列表中SEQ ID NO.38所示。

另一方面，本发明提供了一种上述的引物的制备方法，所述方法包括：

将太湖新银鱼的基因组的酶切片段经第一次PCR扩增后，得到第一次扩增 产物，所述第一次扩增产物与生物素重复探针杂交，获得杂交产物，将所述杂 交产物通过磁珠富集法筛选出所述太湖新银鱼的基因组中的微卫星片段，将所 述微卫星片段经过克隆和阳性鉴定后进行测序，得到相应的微卫星位点序列；

针对所述微卫星位点序列设计引物，将所述引物与所述太湖新银鱼的基因 组进行第二次PCR扩增，得到第二次扩增产物，设计所述引物的参数为：所述 引物的长度为18-25bp，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率为30-70％，退火温度大于 50-65℃，预期经所述第二次PCR扩增后的扩增片段的长度为100-350bp；

将所述扩增产物采用质量分数为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将 分离后的扩增产物经过固定、银染处理并记录结果；

观察结果，挑选出能扩增出条带清晰的且多态性高的所述扩增产物对应的 引物，所述引物序列如序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.38所示的引物。

具体地，所述第一次PCR扩增条件为：预变性94℃5min；94℃45S，53℃ 45S，72℃1min，循环20次；最后延伸72℃10min。

具体地，所述第二次PCR扩增的程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性40 秒；59℃退火30秒，72℃延伸40秒，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。

具体地，所述第二次PCR扩增的反应体系为：如序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.38所示的引物各0.2μM，0.2mM dNTP，1×PCR Buffer，2.0mM Mg²⁺， Taq酶0.5U，10-50ngDNA模板，用灭菌蒸馏水补足到总体积到10μL。

进一步地，所述DNA模板为随机挑选的所述太湖新银鱼的样本。

具体地，所述电泳分离条件为：电压1000V，电泳时间90-120min。

具体地，所述生物素重复探针如序列表中SEQ ID NO.39-SEQ ID NO.41所 示。

具体地，采用酚氯仿抽提所述太湖新银鱼的基因组，将抽提出的所述太湖 新银鱼的基因组通过MseI酶进行酶切，获得所述太湖新银鱼的基因组的酶切片 段。

具体地，所述通过磁珠富集法筛选出所述太湖新银鱼的基因组中的微卫星 片段的方法为：将重量为1-2mg的磁珠用300μl TEN100buffer洗涤3次；再用 40μl TEN100buffer重悬所述磁珠，将所述杂交产物加入重悬后的所述磁珠中， 在室温下反应30min并轻轻搅动，使所述磁珠与所述太湖新银鱼的基因组中的 微卫星片段特异性结合；使用400μl TEN1000buffer室温洗涤所述磁珠3次， 再用400μl0.2×SSC/0.1％SDS缓冲液室温洗涤所述磁珠3次；向所述磁珠中加 入50μl灭菌蒸馏水，混匀，将混均后的所述反应液放置于95℃水中水浴5min， 用磁架固定所述磁珠后，吸取所述反应液中的上清液，所述上清液中含有所述 太湖新银鱼的基因组中的微卫星片段。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一 种太湖新银鱼微卫星DNA分子标记的引物及其制备方法，该引物能在太湖新银 鱼的样本中扩增出条带清晰、多态性高的微卫星条带，使得本发明提供的引物 能够应用于太湖新银鱼的种群的遗传结构和遗传变异水平等方面的研究，采用 微卫星分子标记可以对太湖新银鱼的种群遗传学研究提供较为丰富的遗传基础 信息，同时能够对太湖新银鱼从遗传学的角度去分析其入侵适应机制。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中Nt38位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24个 太湖新银鱼的DNA的银染图；

图2为本发明实施例中Nt39位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24个 太湖新银鱼的DNA的银染图；

图3为本发明实施例中Nt43位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24个 太湖新银鱼的DNA的银染图；

图4为本发明实施例中Nt45位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24个 太湖新银鱼的DNA的银染图；

图5为本发明实施例中Nt49位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24个 太湖新银鱼的DNA的银染图；

图6为本发明实施例中Nt50位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24个 太湖新银鱼的DNA的银染图；

图7为本发明实施例中Nt52位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24个 太湖新银鱼的DNA的银染图；

图8为本发明实施例中Nt54位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24个 太湖新银鱼的DNA的银染图；

图9为本发明实施例中Nt55位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24个 太湖新银鱼的DNA的银染图；

图10为本发明实施例中Nt56位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24 个太湖新银鱼的DNA的银染图；

图11为本发明实施例中Nt57位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24 个太湖新银鱼的DNA的银染图；

图12为本发明实施例中Nt59位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24 个太湖新银鱼的DNA的银染图；

图13为本发明实施例中Nt61位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24 个太湖新银鱼的DNA的银染图；

图14为本发明实施例中Nt63位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24 个太湖新银鱼的DNA的银染图；

图15为本发明实施例中Nt67位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24 个太湖新银鱼的DNA的银染图；

图16为本发明实施例中Nt70位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24 个太湖新银鱼的DNA的银染图；

图17为本发明实施例中Nt71位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24 个太湖新银鱼的DNA的银染图；

图18为本发明实施例中Nt74位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24 个太湖新银鱼的DNA的银染图；

图19为本发明实施例中Nt79位点的微卫星DNA分子标记的引物扩增24 个太湖新银鱼的DNA的银染图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明 实施方式作进一步地详细描述。

实施例

1、太湖新银鱼的基因组中的微卫星序列的获得：

将生物素重复探针和太湖新银鱼的基因组的酶切片段经第一次PCR扩增 后，得到第一次扩增产物，该第一次扩增产物与生物素重复探针杂交，获得杂 交产物，将杂交产物通过磁珠富集法筛选出太湖新银鱼的基因组中的微卫星目 的片段，将微卫星片段经过克隆和阳性鉴定后进行测序，得到相应的微卫星位 点序列。

具体地，采用酚氯仿抽提太湖新银鱼的基因组，将抽提出的太湖新银鱼的 基因组通过MseI酶进行酶切，获得太湖新银鱼的基因组的酶切片段。

具体地，第一次PCR扩增条件为：预变性94℃5min；94℃45S，53℃45S， 72℃1min，循环20次；最后延伸72℃10min。

具体地，通过磁珠富集法筛选出太湖新银鱼的基因组中的微卫星片段的方 法为：将重量为1-2mg的磁珠用300μl TEN100buffer洗涤3次；再用40μl TEN100buffer重悬磁珠，将杂交产物加入重悬后的磁珠中，在室温下反应30min 并轻轻搅动，使磁珠与太湖新银鱼的基因组中的微卫星片段特异性结合；使用 400μl TEN1000buffer室温洗涤磁珠3次，再用400μl0.2×SSC/0.1％SDS缓冲 液室温洗涤磁珠3次；向磁珠中加入50μl灭菌蒸馏水，混匀，将混均后的反 应液放置于95℃水中水浴5min，用磁架固定磁珠后，吸取反应液中的上清液， 该上清液中含有太湖新银鱼的基因组中的微卫星片段。

得到相应的微卫星位点序列具体如下：

＞Nt38如序列表中SEQ ID NO.42所示：

TAACACTGTGATTGGCTCTCTGGAGCTCTGAGGAGATTCTAATGACGA TGCACAATCAGGCAGTGTTTTGTTGGCCAATCCTGTCTCTGCTGTTTTGTTA TTGTTGTTGATGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTCTTGTGGCCTCAGGTACAAC CAAAGATATGAGTTCTTGAAGGCACAAAGGAGAGGTTTTGATGGTTGAGC TGGACTGGTCAGAGACCTTCCCTCCCCTCATGCTGATCTGCAGCATGTGGA TCTGGTCTCCATTCTTACGCTT

编号：1，重复元件：TGT，重复次数：7，起始位置：111。

＞Nt39如序列表中SEQ ID NO.43所示：

TAAGTGGATCTGGGTGAAGCTGTATGTTAGACGGAGGTCAGTGAGTTC GCACACCATGGTGATGGTGGCGTGGGGGGAGGATTGGAAAGACCCTCTGT GGATGTCACGCTAACATGCATACAGGAGTGGCTTTCTACCAACTGCTTTGT ACCAAAGTCTACATCAAATTGTCTTTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGAAG GGAATACATTGATTGTGGTTCTGTTAGATTCTGTTAGAACAATTGGATAGGT GGGAATTATACTAGGTAGAAAAACACTCAACATATATAAGGTGGTTGTGT

编号：1，重复元件：TTG，重复次数：8，起始位置：175。

＞Nt43如序列表中SEQ ID NO.44所示：

TAAGGGTTACCTCCACTATAAACAATCTGATTCATGCCATTCACAAACC CAACGGTTCTTGTTTGTAAGATCGTTGACTAGCTGCCTTTGTGTTGATACCC AAAGCCAAGTGTGTCTGAATGACGTGTTTTGACGGGTTTGTTCCACCACA CAGGAGCAGAGAGACTGAGGAGGCCAGGATGGAGGAAGAGGAAGATTAT TATTGATCTGCGGTCACAGCACGCCTGACTCACTATCAATTACAATACAGCT TAGCGGCTGGGATCACGGTGCTCTCATACAGCTGCGAAACGTGACAACAA CAACAACAACAACAACAACAACCACCACAACAACAACTACAACAATAAC AACAGTTGTGTTTGCAGCTCGCAATGCAAAAATCCAATCAACAAGGAAGT TCAGCCACCGAGCATTAGATAACCTCTGGACGTCAAGAGCAAAGTCACGC TAACAGACAGGTCTGT

编号：1，重复元件：ACA，重复次数：9，起始位置：296。

＞Nt45如序列表中SEQ ID NO.45所示：

TAAGGGTGCCACTGAGTCCATTGCACTTGGTCAGAAGCTCATGCTGTG ATGCAGCCGTCAGTCTCTCTGTTTCCTTGGAAACGGTCCTCGGCGTCGTTC AGTGGTTATAATCGCAAGTTTTCATCAACAACAACAACAACAACAACAATA AGGTTGGGGTCGAGGAGGGGGGGGGGTCGAGAGGCCTTCACTTGCTGTT GTCGTTCCCTTGTGTTATCTAAGGCTGATTGGT

编号：1，重复元件：CAA，重复次数：8，起始位置：125。

＞Nt49如序列表中SEQ ID NO.46所示：

TAATTGGACATTGTGGAAAAATTGTCCCTAGTGTATGACTGTGTGAGT GAATGGTTGTCTCTATGTTGTCTGTCAATGTCTGTGTGATAGCCGTGCGACT AGCTGGCCCCAGTCCAGGGTGTACCCTGCCTACGGCCCGGAAGTAACTGG GATAGTCTCCAGTCACCCGTGACCCCTAACTGGAATAAGCGGTAGAAAATG AATGAATGAATGAATAGTATGGCACTCAGAAATATCACTTGTTGTTGCTGTT GTGGTTCAGAAACTCGCTATTGTTGTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGT TGTTGCTGCTGTAATACTCGTGCCACAGACTACTGTCTGGCAGAGGCTCAC CT

编号：1，重复元件：GTT，重复次数：10，起始位置：280。

＞Nt50如序列表中SEQ ID NO.47所示：

TAAGGTGGTCCAGTTTTCAGCAAGATAAGTTTGGTTTTGTGCAACAAA AAAATGAAAAGATTTCAACAACAACAACAACAACAACAAACAAGACGGA AAAACAAACAAACAAAAACAACGAACAAAAAGAGAAATCAGTGAACATC TTTAGGTTTCAGTGCATCAGGTGTGACTTGGACTGGCTTGAAGTTTCCCTT CTGCATCCAGGTGATTGTGACCCATAAAGTGCTGCCTGAGTCTGGGTAGAA TTCCTCCAGGCCTGGCCAGGGGTCCTCCCAGTCCACAGGCCCGTGGTCGG TGGAGGGATATGGGGGT

编号：1，重复元件：CAA，重复次数：8，起始位置：64。

＞Nt52如序列表中SEQ ID NO.48所示：

TAAGGCAAGCATCTCCGACGGGTGATAGTGCACATGTAGGAAGCAGA CAACAAAGCAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAAC AACAACAACAACAACAACAGGGCACCTGGCTGCGACTTGAAGACAATCC TTCATTAGTTCCCCAGGGGTGAATTCCAGTTCATTACAGCAGCAGTGTAGA CTCCTGGTCTAGCATGCATGTCAGCTGTCAGCTAAGACGCTTTCTCACCGG TCAGTTTCCTTGTCTTTCAGAAGCTGGGCTGTGATCCTGAGGAGGACGGCT TCTTTGACCTCCTCAGCAGGTTCCAGAGCAGCCGTATGGATGACCAGCGCT GCAACTTACATGACACACAGAATGGAGACAAGAATGGCCTTGATGCAGCG GACATCTTATCCTTCAGTGAAATGCTTGGTACAGGCAGATAACAGCTGGCC TCTACACTGGTGCAAAGCTACTGACACTTTCAGTGTTTTCCATTCACTAGAT TCGATTTTCCATTCACTATGGACAT

编号：1，重复元件：CAA，重复次数：19，起始位置：56。

＞Nt54如序列表中SEQ ID NO.49所示：

TAAGTAAGTGGTCAGGCTACGCGGTATAAATCATTTTGATCATTCTACA CTTGGGACCGTGATGGGGGGGCGTGAGGATTTTACGACAGTCGCCCCCCA CGTGAAACTTCACAAACGACCCCCCTTGATTGATCCCTTCAACGTTAGCCA ACCGAATGAAAACACCAGTTGATCCACTCCTTCAAATGAGCAAACAAACC GTTCGGACTGTGAGATAATCTGTGCCGAGTCATCCGCAGGGTGACCTACAG TTAGACCGAGCTCTCCGTGACTAACAACAAGAGGATCACAGGTGCTGGAG GCTAAAACAGGAACGTGGCAGCGTCAGAAGTGACGAGGCACTACGACAC CCAGCAGCCATCTGTGCCCTGAAGATCCAGCTGCTGAACCTGCCAGCCTGT ACTCACTGCCTGTCAAGACAGCAACTGCACAATAGTATTTCTGTTGTTGTT GTTGTTGTTGTTGTTATGTGATTATGCAACATACACTAAGAGAGAGGCTTCC ATGCAGGAATCCCTTCAGGACTATCCATGGATAGTCGCAGGTTCGGAAGAT GCTTCGATCCGAAACCGAAGCGATCGCCGGCTGTACTCACTGAGAGGCAT GAGGATGTTGGGGGGCGGCGTCGTCCGCATTCTCTCCGTCCGACTTGTCTC CGCCCTCCACGTTCGGCTCCACCCTCTCCCGCTTCTCCTTGTGGCCGGACT TGCGTCGGTGGCGTCGCCGGCGGTGGTAGCTCTTGGGCACATGCACGCCG ATGTACACCGTGTGGTGACCTATCACAGCCCAGGAGAAGGCGGGTCAGAT

编号：1，重复元件：TGT，重复次数：8，起始位置：443。

＞Nt55如序列表中SEQ ID NO.50所示：

TAAGTTCAGGGCGTCCACACTTCTCTTCTGTGTGTTCCATTTCTACGCT CGCTTCCTCGTTCTTCTCTTTCCTCTTGGTGTCATGTGACAAAGGCGGGAG CCAGTCTGTTTGTCTGCCAGCTGGCTCCTCCCCCATACCTGTCAGACAGGT GGGAGCATGATGGGGCTTGGTCACACTCCCAGGCGCTCCTCTCCCCCGCTC ACACTAGGAGCTGAAGAGTGCTCGCTACCACAGTAAGACCCTGTGACGGG ATTCCACTGTGCTGGTGTAGAGACAGAAAGCTGCTGCTGCTGTTGTTATTG CTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTACTGTTTTTGAACTGAAGCGGTGG CAAAGTTGACGCTATCGCTGCTGAAGTTAGGAATAAGCTCTCTCTGTTTGC TGTTGTCTGAACACCTGTCCTCTCTTCCCTTTGTCAGAAAGCAGAGATGGA GGAGT

编号：1，重复元件：TGT，重复次数：9，起始位置：305。

＞Nt56如序列表中SEQ ID NO.51所示：

TAAGTATTCTGTCTCGCTTTTTCATTGTGTCCTGCAGAAGTGTGTGCAT AGTGTGGTAAACAGGAAGAGAAGAGGGGGGACTTCTTTGGTTTGTCTGTT GTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGGAGTGAGGTTTTGTTATC CTAAGGACATATAAACAGAAACATACTTATCTGGACATCGGTGTTCACTGA AATCAGTGCAAGGCTCATACTATTATGGAAATAGCAAGACTTGCAATGCAA TGATGACCCTCGATCGTCAATGGGCTATATCTGTGTGTAGGACATATTTTTG TGACCCATGAATCTCATACACCCTGTTCATATGCTCCATCAGGTTCTTTTTA GATCTCATAGAATGAAAGTCATGTAATGTTGTGTAAGCTGTGT

编号：1，重复元件：TGT，重复次数：12，起始位置：96

＞Nt57如序列表中SEQ ID NO.52所示：

TAATGGTGAGGGTGGAATGGAGGGGAAAAACAGCACCTCTGGGCGGA TTCTCATTCTAAATTAGAAATTTCCAGAAGAACATGAGTTCAACAGCTGCA TATTCAACATGTCACAGTGACCTGCTTCTTCTTCTCTCTGGCCCTCAGGATG ACTCTTCATCAGACAGTGACGATGACAAAAAGAAGAAGAAGAAAAAGAA GAAGAAGAAAAAACAGATGAAGAAGAAAAAGGTTTGGCGTCTAAGAGCA AATCTCTGCCCTGGGTCTCCTAAAGACATACACAGGTTGTGTCATGGTGTT TAGTTTTTACTGTATTTCATCAAAGTTTGTCTGTCTCAGGATTCAGATGATG ATTCAGACAGCGAGAAGGAAAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAAATGAAGA AGAGGAAGGTGTGTGACCAAAGCAAACATGGGATGAAGGTCTCCTTTGGG ACATGCATGGGTTTTGATGTTGTTC

编号：1，重复元件：AAG，重复次数：6，起始位置：372

＞Nt59如序列表中SEQ ID NO.53所示：

TAACTACAGGGCCTGGCTGTGTTCCATCACATGACCCTCTAGTCATGT GCTGCCTCTTGCTACACGTCACATGACAGGTGTTTCTGTGTCCAGGCAGCA GCTCCAAGCTTTAGGGCTCTACACTGGACACTGTCCTGAGACAGAGAGAG GAAGAGAGAAGAAGAAGAAGAAGAGGCACTTCCTGCCTGGAGTGGGCCG AGGAGAGTACAGGCACCATGTGACCAGATCACAGCCTCAGCACATCACTG CCACGTTTCTCTCTCACACACACTCTCAATTCATAAAACAGAAAGCAGTGT CACAGCACAGGCCTGTGAGAGTCCTGACCAGGTGCGACTCAGGAACATGA TATTACCAGGATGCACAGAAACAAGGTCAACTGATGAATTAGTGAAGTGT GACTTGGAATATAATATCCATTTTGATGGCTCCATTATGATGAAGTCATGTGA TTCTGAAGACCCTTATCTCATTGGCTTATCAAAGCACCATATCAAGTTATAA ATATTTGTGTGATGAGTCAGGTAAGGGCTGACAGTCCTGTTCCATCAGTGT GTTTATGGAACAGAACCAGTCAACAAACATGATAGAGACTTATTGTATTTG AGACCTTGAGGAAACAGACAAATATAAAATCCTGTGATT

编号：1，重复元件：AGA，重复次数：6，起始位置：152

＞Nt61如序列表中SEQ ID NO.54所示：

TAACGCCACAGGTTTTCCAAATGAAAGCACAATTGAACCGCTTGCGTA CGCCAACCCCATTTTCTCTCTTCAGCGCGGGATGTCAAGATTCGATGTGCC ATTTCATCCGAGAGGATGTTCCAACGGTAATCTTCAACAACAACAACAACA ACAACAACAAAAAAACGACATGCTCGAGTCAGCAAAGACATTGCTCTGTA AACCTCGTTTGTTATTTGAGTATAGACGTGTTTGGTTCCGAATGGCATCGCG TGTCTCGTTTTGACTGAGTACGCTGGGGAGACGGGTTCGAAAACAGACTT GTCGTGTGTGTGTGTGTGTGGGGGGGGGGGGTATACTTCTACTCTCACGGT CGTCACTGTCGAAGAAAAACCCCTGCAGCCGCAAATACACTATT

编号：1，重复元件：CAA，重复次数：9，起始位置：134；

编号：2，重复元件：GT，重复次数：8，起始位置：306。

＞Nt63如序列表中SEQ ID NO.55所示：

TAAGCTACCAAAACCTGACCGAGACTGAGAACGCCCATCTGTATCCTA GCAGCAACAACAACAACAACAGCAACAACAACAACAACAACACAGTTGA ACTTGACAAACATGCGTAGATCAAGTTCAGCTTGGTGTCAGACCCCTCACC ATCCTCTCGAAGGGGTCGTCCGTGTGGTTAGCGATGTCCAGCAGCTCGGA GTACTCCAGCTCCTCGCTGACCCTCTGCAGCAGGCAGAGAGGCTCGTTCA GAGCGACCGGCATGGACACGCGGGACAGGTCCTTGCCGATGTTGTTGTAC AGGATGGTCATGATGCCGATGTGGCTGTTGTCCAAGCAGTGGGCAGGCAG GGTGGTCCGACGGCCTGTGTTGGTGGGCACGGCGCTGGGCATGTCTGTTG CTTTGGAAAGGCTTGCGCGATACTGGCTGGTGGCTGTAACTGGTGGTACA GAGAAGAGGTCAGTAAGGAGGGCTAAAGTGT

编号：1，重复元件：CAA，重复次数：5，起始位置：53；

编号：2，重复元件：CAA，重复次数：6，起始位置：71。

＞Nt67如序列表中SEQ ID NO.56所示：

TAAGCACATGTAGCCTACTATATAAAAGCCCTTTTACCAAATTGAGTTA TATTACAATTACGATTGAATACAAGATACAATCCTGCCAACAAAGCTAGCTG CTTGTACGAAATGAATCCACCTAAAAATGTACTGTTTTGAAAGAAAGGCAT TTTTATATTTTGGTCACACAGGGTACAAGAAGGCCCAACTTCAAAGAGCTG GCTAATGACCAGGTGCGCTACCAGCGCTGGCTTCTGAGGAATGAGACCAA GGCCTTCTACACAGCAGTGTACGCTGAGGACATCCGTCAGGGTACCCAGT ACCTGCTCCAGGTGAGATATATCCAGTGATAGATAGATAGATAGATAGATAG ATAGATGGATGTCATTACACTTCATGCAACAAAATTCGGATGATAATTCATC ATCACCATCAACTCCTAACATTTCAAGTGTACTGGAATAGCATTCGAAATGT TGGAATTCCAAGGTAGTAAAGTCCGCAGTTACAAGAAACGACCCTGTTTTA TGTTGAAACAAATCCTACAGCAGGCACTGAGTACTTCCTGT

编号：1，重复元件：GATA，重复次数：7，起始位置：331。

＞Nt70如序列表中SEQ ID NO.57所示：

TAAGCCTCCGTGTTTTATATGTTTGGGGGATTTGGAGCTGTGATATCGA AGTGTCTATTATTTTTCCCAGCAGACAGGCTGTTAGTTGTGCTGAGCGGAA GCCAGAGAGCCTGTGCTGTCTGTCTGTCAGAGCCAGCCGCGTAGAGATGC TGGGGTCTTGTTTGATCTCTAATGAGACTTAGGGAGTCACAGATAAAAATAT ACGGATAGATGGATGGATAGATAGATAGATACATAGATAGATAGATAGATAG ATAGATAGATGGATAGAGTATGTGTTTGTTTGTGCGAGTGGTCTGATTTGAA CCTGCAATGACCAAAATAGGTGAACAGCTTTGGAACAGGATCGTGATAGTT CAGACCAACAACAT

编号：1，重复元件：ATAG，重复次数：7，起始位置：235。

＞Nt71如序列表中SEQ ID NO.58所示：

TAACCCACTTCGTTGTTCCGTTCCATTCTATGTAGTTATTATCCAGTTAT CCTGTCAGACAGTGTCAAAAGGCCATGTGCTCTTAGCCCAGCTGTTAGAA GAAATATAAACATTTCCTTTTATGTATTTCTTTTCTTCAGCTTTCTTTTGGCAT TGCCCTCTGGATGTTACTTCAGGTCTTGACTCCCCTGCTTTTCCCTCCTCCT TGGTCATCTTCCCCCCACACTCAAACCCTCTGTGGATAGATAGTACAGCTTT AGCTTTGCCTTTGTCAGAGTGTAAACTTTCCTTTAGCCAGTGCGTCGATAG TGTTTACTATATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATA GATAGATACTGAACTACTAGCTTGGGAGTCAGATTAATCTGTGAGTTCATGT TTATTTTCTCTAGTATACTGGCCTGGCAACCCTCTCATTCCCCCCGGCATGA AAAGTGTCGGGACAATCACAACCATTTATGTGATACGGGGCAGGGTTGATA CGATGACTACGCAGAGGAGTGCCAT

编号：1，重复元件：ATAG，重复次数：12，起始位置：320

＞Nt74如序列表中SEQ ID NO.59所示：

TAAGGAGAGTGACAGATTCACCGATGACCTCTGAATGATTTATCTCCG GACACATTCCTGTTTATCAGAGCATCAGATGGCATCAGCATCAGAAAACCA GGGGGGAAGTGTATGAGGGCAGGCAGACAGACAGACAGACAAACAGACA GACAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGAATGACAGTGAGGTAGGCAT GTGGGCAGACAGACAGGTAGACAGACAGACATACCAACACTGACAGGCA GGTAGGCTGGGAGAAAACAGAAACCCAGAAGTGGACCTACAGTGAATCT TCCAGACACCTTCGGACTTCCAGT

编号：1，重复元件：ACAG，重复次数：9，起始位置：142。

＞Nt79如序列表中SEQ ID NO.60所示：

TAAGGCAACAAGACCGCTTTTCCTTTCTGCCCATTTCAGTTCGTTGGA ATCTTTGACGAATATTGTTTTCGGTTGAAGTCGGCGTGTTGTTGTTGTTTGT TTGTTTGTTTGTTTTTCTCCTCCTCGACAACAACAAGTGTTTTATTTCTTCTT GCCGAAGAAGCTGAACCTCTTCTCACGGTCCTTCTCCTTGCCGTCTTTGTT CCGCATGGTGACGCCCCCGGCCTCGGCCGAGCTGGGGGAGATGGGGGGCA TGGTCATGGCTCGGCTGAGGGCCCGGGGTCCCCCGGGGGAGTGGTCCCCT GACCCCACCGGGGGGATGATGGCCTGGATGGAGCGGATCCAGGAGCTCAT CTCCCCCTG

编号：1，重复元件：TTGT，重复次数：5，起始位置：93。

针对微卫星位点序列采用软件Primer3.0设计引物，将引物与太湖新银鱼的 基因组进行第二次PCR扩增，得到第二次扩增产物。

具体地，设计引物的参数为：引物的长度为18-25bp，鸟嘌呤和胞嘧啶所占 的比率为(GC含量)30-70％，退火温度大于50-65℃，预期经PCR扩增后的扩 增片段的长度为100-350bp。

具体地，第二次PCR扩增反应在MJ-100PCR仪上进行，且第二次PCR扩 增的程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒；59℃退火30秒，72℃延伸 40秒，共35个循环；最后72℃延伸10分钟；第二次PCR扩增的反应体系为： 如序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.38所示的引物各0.2μM，0.2mM dNTP， 1×PCR Buffer，2.0mM Mg²⁺，Taq酶0.5U，10-50ngDNA模板，用灭菌蒸馏水 补足到总体积到10μL。

进一步地，第二次PCR扩增的反应体系中的DNA模板为随机挑选的24个 太湖新银鱼的样本。

将扩增产物采用质量分数为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将分离 后的扩增产物经过固定、银染处理并记录结果。其中电泳分离条件为：电压 1000V，电泳时间90-120min。根据扩增产物的不同迁移距离确定每个太湖新银 鱼的基因型，获得如序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.38所示的引物，参见表 1，且19对引物能在太湖新银鱼样本中扩增出条带清晰、多态性高的微卫星条 带，其结果参见图1至图19。

表1为19对引物序列

本发明实施例提供了一种太湖新银鱼微卫星DNA分子标记的引物及其制备 方法，利用该制备方法得到的19对引物能在太湖新银鱼的样本中扩增出条带清 晰、多态性高的微卫星条带，使得本发明提供的引物能够应用于太湖新银鱼的 种群的遗传结构和遗传变异水平等方面的研究，采用微卫星标记可以对太湖新 银鱼的种群遗传学研究提供较为丰富的遗传基础信息，同时能够从遗传学的角 度去分析太湖新银鱼入侵适应机制。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的 精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。