一种河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法及基于该方法的试剂盒

摘要

本发明公开了一种河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法，包括以下步骤：(1)制备待测品的样品溶液及河豚毒素标准品溶液；(2)取样品溶液0.4mL，加入0.2mLpH维持液，将溶液pH控制在11.6~11.9区间，然后加入0.1mL衍生试剂1和0.1mL衍生试剂2，混匀，水浴加热20min，冷却至室温，加入0.1mL终止液，使溶液pH呈中性，而后用超纯水定容；取样品溶液，加入河豚毒素标准品溶液混匀，然后进行本步骤操作进行荧光衍生；(3)采用配备荧光检测器的液相色谱仪对步骤(2)荧光衍生后的样品溶液和河豚毒素标准品溶液进行分析，对样品溶液中的河豚毒素进行定性和定量。本发明同时公开适用于该方法的试剂盒。该方法用于定性、定量检测水产品中河豚毒素，结果可靠、检测限低。

说明书

技术领域

本发明涉及河豚毒素检测方法及试剂盒，具体涉及一种河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法及基于该方法的试剂盒。

背景技术

河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）是日本学者Dr. Yoshizumi Tahara于1909年首次从河豚肝脏中提取并发现的一种氨基全喹啉化合物神经毒素，分子量约为319.3Da。普遍存在于河豚、织纹螺、蟹、海星、虾虎鱼等海生生物，蝾螈、蛙、蛇等陆栖动物，甲藻、红藻等藻类以及细菌等生物中。TTX毒性极强，1 mg等于4500MU，对哺乳类静脉注射半致死剂量LD50为2～10 μg/kg，皮下注射LD50为10～14μg/kg，对人类的最低急性中毒剂量约为0.2mg，致死摄食剂量0.6～2mg/50kg体重。由于其热稳定性高，普通烹饪手段如在100℃加热难以破坏，常常引发吃食河豚、织纹螺等中毒。小鼠生物法、酶联免疫法（ELISA）、液质联用法（LC-MS）和高效液相柱后衍生荧光检测法（HPLC-FLD）等为河豚毒素检测常用方法，但由于均存在一定的缺陷，如小鼠法不能专一地检出TTX，ELISA容易出现假阳性，LC-MS检测成本昂贵，柱后衍生HPLC-FLD需要配备柱后衍生装置和昂贵联用质谱仪确证。荧光检测技术具有背景干扰低、灵敏度高、精确、成本相对低廉的特点，因此开发一种新型荧光检测手段，将有利于促进河豚毒素的检测工作。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法，该方法用于定性、定量检测水产品中河豚毒素(TTX)，结果可靠、检测限低。

本发明的目的之二是提供基于上述河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法的试剂盒。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现：一种河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法，包括以下步骤：

(1) 制备待测品的样品溶液及河豚毒素标准品溶液；

(2) 荧光衍生：取样品溶液0.4m L，加入0.2m L pH维持液，将溶液pH控制在11.6~11.9区间，然后加入0.1mL衍生试剂1和0.1mL衍生试剂2，混匀，水浴加热20min，冷却至室温，加入0.1mL终止液，使溶液pH呈中性，而后用超纯水定容；取样品溶液，加入河豚毒素标准品溶液混匀，然后进行本步骤操作进行荧光衍生；

(3) 定性和定量检测：采用配备荧光检测器的液相色谱仪对步骤(2)荧光衍生后的样品溶液和河豚毒素标准品溶液进行分析，对样品溶液中的河豚毒素进行定性和定量。

本发明所述步骤(1)中待测品的样品溶液的提取和纯化采用已有技术即可，例如，将待测品均质，用乙酸溶液在水浴超声提取后，所得提取液上河豚毒素亲和层析柱或WCX固体萃取柱等洗脱，获得的洗脱液经水浴氮气吹干后再制成样品溶液。

本发明所述步骤(1) 河豚毒素标准品溶液中河豚毒素浓度为20~10000ng/ml。

本发明所述步骤(2)中pH维持液为2mol/L碳酸钠溶液。

本发明所述步骤(2)中衍生试剂1的 pH约为12，包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之间的体积比为5﹕2﹕3，具体地，所述a液为次溴酸钠贮备液：0.67g溴酸钠、3.0 g溴化钠，用蒸馏水溶解并定容至10mL；所述b液为 5mol/L盐酸；所述c液为 4.81mol/L氢氧化钠。

本发明所述步骤(2)中衍生试剂2为20%尿素（w/v）。

本发明所述步骤(2)中终止液为15%磷酸（w/v）。

本发明所述步骤(3)中高效液相色谱检测条件为：色谱柱：反相C-18柱；流动相：50 mmoL/L磷酸二氢铵；检测信号：激发波长233 nm，发射波长370 nm。

本发明的第二个目的通过以下技术措施来实现：基于上述河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法用试剂盒，包括以下试剂：

(1) 衍生试剂1：pH约为12，包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之间的体积比为5﹕2﹕3，所述a液为次溴酸钠贮备液：0.67g溴酸钠、3.0 g溴化钠，用蒸馏水溶解并定容至10mL；所述b液为 5mol/L盐酸溶液，10mL；所述c液为 4.81mol/L氢氧化钠溶液，10mL；

(2) 衍生试剂2：20%尿素溶液（w/v）。

(3) pH维持液：2mol/L碳酸钠溶液；

(4) 河豚毒素标准品贮备液：100μg/mL河豚毒素溶液，内含1mmol/L的柠檬酸盐，pH=5.0；

(5) 终止液：15%磷酸溶液（w/v）。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

（1）本发明首次使用次溴酸钠和尿素与河豚毒素反应，将其定量地转化为一种特定的荧光物质，与传统的使用高浓度碱碱解不同，反应在弱碱性条件下进行，反应条件比较温和。使用高效液相色谱检测时，采用柱前衍生方式，不需要配备柱后衍生装置，检测成本低。

（2）本发明与已有的将河豚毒素与荧光物质（如邻苯二醛）相连接的柱前荧光衍生方法不同，不需要具有荧光信号的试剂参与反应，同时不易受其他物质的干扰，具有很强的特异性，可使用高效液相色谱检测。

（3）本发明将河豚毒素衍生后，检测信号为激发波长233nm、发射波长为370nm。

（4）以无毒的河豚鱼提取液加入TTX标准品0.01μg，荧光衍生处理后，定容至1 mL，高效液相色谱测定，计算得出色谱峰信噪比为4.2，以3倍信噪比计算出本发明提供的方法的检测限，最低检测浓度可达0.008μg/mL，灵敏度高于现有的河豚毒素检测方法。

（5）本发明预制所需衍生试剂，形成试剂盒，方便了使用，同时可避免了因配制人员不同造成的试剂误差。

附图说明

图1 为河豚毒素荧光衍生反应后荧光扫描图谱：TTX经荧光衍生后，固定激发波长为233nm，扫描获得发射光谱，最大发射波长为370nm；固定发射波长为370nm，扫描获得激发光谱，最大激发波长为232.9nm；

图2 为河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测色谱图：衍生物经高效液相色谱反相C-18柱分离，荧光检测器检测（激发波长233nm、发射波长370nm），获得色谱图显示仅有一个主峰，次峰很小可忽略不计，说明荧光衍生物为一种单一物质。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施案例，对本发明所做的的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围内。

在本发明中，若非特指，所有设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。

以下实施例的河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法使用试剂盒，包括以下试剂：

(1) 衍生试剂1：pH约为12，包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之间的体积比为5：2：3，所述a液为次溴酸钠贮备液：0.67g溴酸钠、3.0 g溴化钠，用蒸馏水溶解并定容至10mL；所述b液为 5mol/L盐酸溶液10mL；所述c液为 4.81mol/L氢氧化钠溶液10mL；

衍生试剂1是现用现配，即使用时取5 mL a液，准确加入2 mL b液，密封混匀，静置5 min后，准确加入3 mL c液，立即混匀，配制成衍生试剂1，其pH约为12。

(2) 衍生试剂2：衍生试剂2：20%尿素溶液（w/v）12mL。

(3) pH维持液：2mol/L碳酸钠溶液25mL；

(4) 河豚毒素标准品贮备液： 100μg/mL 河豚毒素溶液2mL，内含1mmol/L的柠檬酸盐，pH=5.0；

(5) 终止液：15%磷酸溶液（w/v）12mL。

TTX标准溶液：取一定量TTX标准品贮备液用蒸馏水稀释浓度在20～10000ng/ mL之间。

实施例一结合C18固相萃取柱和WCX固相萃取柱纯化的待测样品中河豚毒素的检测

（1）样品的提取与纯化：称取均质后的河豚肉样品2g，加入10 mL0.1%乙酸，于85℃水浴超声提取10 min，再沸水浴5min，冷却后于4500 r/min离心5 min，取全部上清液过C18固相萃取柱（使用前依次用3mL甲醇、3mL0.1%乙酸活化），再用2mL0.1%乙酸洗涤；收集全部滤过液，用氨水调节至pH=7.0，全部过WCX固相萃取柱（使用前依次用3mL10%氨甲醇、1mL水活化），2mL水洗涤，抽干小柱，用5mL 2%乙酸-甲醇洗脱。洗脱液于80℃水浴氮气吹干后用1 mL水溶解，得样品液。

（2）荧光衍生：取样品液0.4mL，加入0.2mL pH维持液，混匀，使pH为11.7，再分别加入0.1mL衍生试剂1、0.1mL衍生试剂2，混匀，于75℃下水浴20min，冷却，加入0.1mL终止液使溶液pH为中性，加超纯水定容至1mL。另取0.4mL样品液，加入一定量TTX标准液后，按上述操作进行荧光衍生。

（3）检测：采用配备荧光检测器的液相色谱仪对步骤(2)荧光衍生后的样品液和TTX标准品溶液进行分析，检测信号为：激发波长233nm，发射波长370nm；使用标准加入法定量。

高效液相色谱检测条件为：色谱柱:反相C-18柱；流动相:50 mmoL/L磷酸二氢铵；检测信号：激发波长233 nm，发射波长370 nm。

实施例二  结合河豚毒素亲和层析柱纯化的待测样品中河豚毒素的检测

（1）样品的提取与纯化：称取均质后的河豚内脏样品2g，加入10 mL0.1%乙酸，于85℃水浴超声提取10 min，再沸水浴5min，冷却后4500 r/min离心5 min，取全部上清液，用0.5mol/L磷酸氢二钠溶液调节pH至7.4，以2mL/min速度，全部过河豚毒素亲和层析柱（3mL规格），分别用3mL PBS（0.01mol/L，pH=7.4），3mL去离子水洗涤，5mL 1%醋酸洗脱，抽干柱子。洗脱液于90℃水浴氮气吹干后用1 mL水溶解，得样品液。

（2）荧光衍生：取样品液0.4mL，加入0.2mL pH维持液，混匀，使pH为11.7，再分别加入0.1mL衍生试剂1、0.1mL衍生试剂2，混匀，于75℃下水浴20min，冷却，加入0.1mL终止液使溶液pH为中性，加超纯水定容至1mL。另取0.4mL样品液，加入一定量TTX标准液后，按上述操作进行荧光衍生。

（3）检测：采用配备荧光检测器的液相色谱仪对步骤(2)荧光衍生后的样品溶液和TTX标准品溶液进行分析，检测信号为：激发波长233nm，发射波长370nm；使用标准加入法定量。

高效液相色谱检测条件为：色谱柱:反相C-18柱；流动相:50 mmoL/L磷酸二氢铵；检测信号:激发波长233 nm，发射波长370 nm。