沙门氏菌和大肠杆菌的培养基和培养方法以及用于检测沙门氏菌和大肠杆菌的方法

摘要

在实施例中公开了培养基、用于补充培养基的成分和用于培养生物样品的方法。在实施例中，所述方法是用于检测细菌的方法，并且在实施例中所述细菌包含沙门氏菌(salmonellaspp)，并且在实施例中包括大肠杆菌(E.coli spp)。在实施例中所述培养基和成分包含烷醇胺和复合钴胺素。

说明书

背景技术

1.技术领域

本发明公开的主题涉及用来培养微生物和检测微生物的培养基和方法。

2.相关文献

1.Roof,D.M.,and J.R.Roth.1988.Ethanolamine utilization in Salmonella typhimurium. J.Bacteriol.170:3855-3863.

2.Roof,D.M.,and J.R.Roth.1989.Functions required for vitamin B12-dependent  ethanolamine utilization in Salmonella typhimurium.J.Bacteriol.171:3316-3323.

3.Chang,G.W.,and J.T.Chang.1975.Evidence for the B12-dependent enzyme  ethanolamine deaminase in Salmonella.Nature254:150-151.

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5.Kofoid,E.,C.Rappleye,I.Stojiljkovic,and J.Roth.1999.The17-gene ethanolamine (eut)operon of Salmonella typhimurium encodes five homologues of carboxysome shell  proteins.J.Bacteriol.181:5317-5329.

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7.Chapter4entitled Isolation and identification of Salmonella from,meat,poultry and  eggs products in USDA/FSIS Microbiology Laboratory guidebook,3^rd Edition,Rev.#4, http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_4_05.pdf

8.Chapter5B entitled Detection and Isolation of non-O157Shiga-toxin Producing  Escherichia coli(STEC)from Meat Products in USDA/FSIS Microbiology Laboratory  guidebook,3^rd Edition,Rev.#1,http://www.fsis.usda.gov/PDF/Mlg_5B_01.pdf

9.Chapter5entitled Salmonella in FDA Bacterial Analytical Manual,8^th Edition, November2011Version,

http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/ucm070149.htm

发明内容

在第一个实施例中公开了包含具有生物有效浓度的复合钴胺素和烷醇胺的培养 基。

在实施例中，所述复合钴胺素选择由钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素、羟钴 胺素和氰钴胺素组成的组。

在实施例中，所述烷醇胺是乙醇胺。

在实施例中，公开了细菌培养基。

在实施例中所述细菌为沙门氏菌(salmonella spp)或大肠杆菌(E.coli spp)。

在实施例中，所述细菌为鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、大肠杆菌 157(E.coli157)、志贺毒素大肠杆菌(Shigatoxin E.coli)或肠出血性大肠杆菌 (Enterohemorrhagic E.coli)。

在实施例中复合钴胺素大于0.002M浓度存在且所述烷醇胺以大于0.001mg/l的 浓度存在。

在进一步的一系列实施例中公开了用于培养生物样品的方法，所述方法包括在 具有生物有效浓度的复合钴胺素和烷醇胺存在的情况下孵育样品的步骤。

在实施例中，所述复合钴胺素选自由钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素、羟钴 胺素和氰钴胺素组成的组。

在实施例中，所述烷醇胺为乙醇胺。

在实施例中，所述方法用于培养细菌。

在实施例中，所述细菌为沙门氏菌（salmonella spp)或大肠杆菌(E.coli spp)。

在实施例中，所述细菌为鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、大肠杆菌 157(E.coli157)、志贺毒素大肠杆菌(Shigatoxin E.coli)或肠出血性大肠杆菌 (Enterohemorrhagic E.coli)。

志贺毒素大肠杆菌在实施例中，所述烷醇胺以大于0.002M的浓度存在且所述 复合钴胺素-以大于0.001mg/l的浓度存在。

所述方法用于检测样品中的沙门氏菌或大肠杆菌。

在实施例中，所述方法用于检测样品中的沙门氏菌或大肠杆菌且所述烷醇胺为 乙醇胺。

在实施例中，所述方法进一步包含PCR、凝集素结合、样品扩散、侧向扩散、 抗体结合、侧向层析或分步层析。

在进一步一系列的实施例中，公开了用于在培养基中优先培养沙门氏菌和大肠 杆菌的方法，所述方法包括向培养基补充具有生物有效浓度的复合钴胺素和烷醇 胺。

在进一步一系列的实施例中，公开了用于补充培养基的配方，所述配方包含复 合钴胺素和烷醇胺。

在实施例中，所述复合钴胺素选自由钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素、羟钴 胺素和氰钴胺素组成的组。

在实施例中所述烷醇胺为乙醇胺。

在实施例中所述配方的用途是用于细菌的生长。

在实施例中，细菌为沙门氏菌（salmonella spp)或大肠杆菌(E.coli spp)。

在进一步一系列的实施例中公开了用于检测生物样品中志贺毒素大肠杆菌鼠伤 寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、大肠杆菌157(E.coli157)、志贺毒素大肠杆菌 (Shigatoxin E.coli)或肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli)的方法，所述方 法包含在具有生物有效浓度的乙醇胺和复合钴胺素存在的情况下培养样品，所述复 合钴胺素选自由钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素、羟钴胺素和氰钴胺素组成的 组。

此处所述主题的特征和优势将通过下述优选的实施例的详细描述而变得更加明 显，如附图所示。将认识到，公开和请求保护的主题可在各方面进行修改，只要不 脱离权利要求的范围。因此，附图和说明书被认为是说明性的，而不是限制性的且 所述主题的完整范围记录在权利要求书中。

优选实施例的详细说明

术语

在本公开中，“包含”一词被用在非限制性句子中表示紧接着该词的内容被包括 进来，但是没有特别提及的内容不代表被排除了。能被理解的是当实施例表示包含 或可能包含特征或特点时，它也可以设想成在实施例替代变体中，所述实施例可以 包括或基本包括符合所讨论的特征。提到某种元素不排除其他元素存在的可能，除 非文章明确要求一种和只有一种元素。

本公开中，通过端点叙述的数值范围包括此范围内所有的数字，包括所有的整 数，所有的小数（例如，1到5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5等）。

本公开中，单数形式包括复数的指示对象除非内容另有明确规定。因此，例 如，提及包含“化合物”的配方，包括两种或更多化合物的混合物。

本公开中，“或者”一词在句中包括了“和/或”的含义，除非内容另有明确规定。

本公开中，除非另有指明，所有说明书和权利要求书中列出的用于表示数量或 成分，性质测定等的数字可在所有例证中通过“约”一词进行修改。因此，除非有根 据上下文相反的或必要的指示，本公开中列出的数值参数为可以基于所需性质进行 改变的近似值，本领域技术人员利用现有公开的内容并根据测量和定量的不准确性 可试图获得所述性质。在不限制等同原则适用于权利要求的范围的情况下，至少应 该根据已报道的显著位数的数量以及利用普通的四舍五入方法对每一个数值参数进 行分析。尽管本公开宽范围中列出的数值范围和参数为近似值，列于具体实施例中 所列的数值被广义地理解到一个程度，该程度兼顾本公开的有效性以及本公开和请 求保护的主题与现有技术的区别并存。

本公开中，“培养基”、“肉汤”、“培养液”等均涉及适于培养所需微生物（可以 是细菌或微生物菌株或品种）的营养混合物。在实施例中可以是或者可以包含如本 文所定义的任何核心培养基并且可以用粉末或浓缩形式来制备。

在实施例中，培养基含有pH缓冲液。在一系列的实施例中，所述pH缓冲液是 磷酸二氢钠和磷酸氢二钾的混合物，但是也可以是替代的生物相容的缓冲液，例如 MOPS（也叫3-（N-吗啉）丙磺酸、3-吗啉代丙烷-1-磺酸、3-N-吗啉丙磺酸、 4-吗啉丙磺酸）、和适当的碳酸钙缓冲液，并且能被本领域技术人员熟练选择和操 作以获得所需的培养基pH值。

在实施例中，培养基可以以粉末或浓缩的形式被提供，通常也被称为“粉末”、 “浓缩物”、“粉末培养基”、“培养基粉末”、“培养基浓缩物”、“浓缩培养基”等，它 包含多种成分并适于与定量的水结合以制成特定成分具有所需浓度的液体培养基。 这样的粉末培养基或浓缩培养基可能是完整的，这意味着只需在使用前将它溶于适 量的水（一般是无菌水）。在实施例中另一种情况是，粉末或浓缩培养基可能是不 完整的，这意味着需要添加额外的成分来获得适于使用的完整的培养基。在实施例 中，粉末或浓缩的培养基也包括浓缩的至少部分水合的培养基，它在溶解后形成用 于培养细菌的培养基。可以理解的是，除非文章另有要求，本文所用的“培养基”不 仅包括成分浓度适合培养细菌和微生物的最终培养基，还包括适于稀释的粉末或浓 缩培养基。“Actero沙门氏菌/STEC”扩繁培养基或“AEM”培养基及其近似词语通常 指基于实施例的培养基。

本公开中，“维生素B12”和“钴胺素”具有它们正常的含义且二者都是指拥有图 1A中所示结构式的维生素。其中R代表任何与基本正常维生素B12活性或与用于 此处请求保护的主题的实施例中的活性相兼容的组。在特定的实施例中但不限于的 情况下，以上配位到中央Co2+离子的配体R可以是Me、OH、CN和5’-脱氧腺苷 基。为进一步确定且不限制的情况下，维生素B12的其它名称和具有生物活性的相 关衍生物包括：B-12、B12、B群维生素、Bedumil、钴胺素、氰钴胺素、维生素 B12、维他命B12、B群维他命、氰钴维生素、氰钴胺、维生素B12氰钴胺、复合 钴胺素、羟钴胺素、羟钴胺、Hydroxocobalaminum、羟钴胺维生素B12、 Hydroxocobémine、Idrossocobalamina、甲基钴胺素、甲钴胺、维生素B12α、 Vitadurine、维生素B12、维他命B12、核黄素、维他命B2、啶黄素、黄素、印黄 素、乳黄素、维生素B-2和维生素G。

相似地，“钴胺化合物”应被理解为包括所有与维生素B12或钴胺素的生物性质 基本相当的化合物。例如但不限于，本领域技术人员熟知，在实施例中，关于维生 素B12或复合钴胺素应被理解为包括氰钴维生素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素、羟钴 胺素和其他功能相当的化学物质，本领域技术人员能熟练地鉴别这些物质。

可进一步理解的是，在实施例中，各种钴胺素的修饰或共轭形式可能具有生物 有效性并且为本领域技术人员所熟知，并且可以理解地被包括在“复合钴胺素”中。 广义上，复合钴胺素可以包括任何具有图1B中所示的一般结构的化合物，其中R1, R2,R3,R4,R5,R6,R7,R9,R10,R11,R12,R13,R14,R15可以是相同的或各异的，并 且可以独立地是H或可以是直链或支链的烷基、环基、环烷基并且可以是本领域技 术人员所熟知的各种方式的支链的或替代的，并且可以独立包含或者包含至少0,1, 2,3,4,5,6,7,8或更多碳原子。在特定的实施例中且不限于的情况下，以上配位到 中央Co2+离子的配体R15可以是Me、OH、CN和5’-脱氧腺苷基。

本公开中，“烷醇胺”也被称为“氨基醇”指在烷烃主干上包含醇基和氨基的有机 化合物。非限制性实施例中，烷醇胺包括甲基乙醇胺、乙醇胺、二甲乙醇胺、N-甲 基乙醇胺、氨甲庚醇、乙基异丙肾上腺素、正肾上腺素、丙醇胺、戊胺、鞘氨醇、 具有结构式N(H)R1,R2的二烷醇胺和具有结构式NR1,R2,R3的三烷醇胺。在特定的 实施例中，烷醇胺可以是乙醇胺或者可以包含具有1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多 的碳原子的主干并且可以包含一种以上的氨基或一种以上的羟基或一种以上的氨基 和一种以上的羟基。在实施例中，烷醇胺可以是替代的烷醇胺。在特定的实施例 中，烷醇胺可以是乙醇胺。为进一步明确，乙醇胺的其他名字包括单乙醇胺、2-氨 基乙醇、胆胺、氨基乙醇、2-羟基乙胺、环氧丙醇、乙醇胺、氨基乙醇、2-氨基- 1-乙醇。在特定的实施例中，链烷醇胺选自由丙二醇、单异丙醇、乙二醇、2-1氨 基乙醛、氨基丙腈、乙二胺、2-氨基丙醇、1,2-二氨基丙烷、N-甲氨基乙醇、2-羟 乙基肼、3-氨基-1-丙醇、2-氟乙醇、2-羟乙酰胺、2-氨基乙醇、(R)-(-)1,2-丙二醇 组成的组。

本公开中应被理解的是，除文义另有所指外，提及的培养基或溶液包含烷醇胺 或复合钴胺素或烷醇胺或复合钴胺素等可以包括两份、三份或多分烷醇胺或复合钴 胺素或烷醇胺和复合钴胺素。因此根据实施例和非限制性的说明书，培养基包含每 升1克的烷醇胺说明1克可以包含不同烷醇胺的混合物，它们加起来总的重量为1 克。同样地，再次根据实施例和非限制性的说明书，包含1克复合钴胺素的混合物 应当被理解为：所述1克包含一种或多种复合钴胺素成分，例如甲基钴胺素、氰钴 维生素和/或其它复合钴胺素，它们加起来的总量为1克。

本公开中，动词“缓冲”表示在预定范围内，以对本领域技术人员来说显而易见 的方式稳定溶液的pH，所述溶液可以是培养基。名词“缓冲液”指适于稳定溶液pH 的化学制品。

本公开中，“基础”或“核心”培养基或肉汤指包含某些为本领域技术人员所熟知 的基本需要的成分的部分培养液，并且它的具体配方组成是可以变动的只要仍然适 合于所培养的微生物生长。因此在实施例中但无限制性的情况下，核心培养基可以 包含盐、缓冲液和蛋白提取物，并且在实施例中可以包含氯化钠、磷酸二氢钠和磷 酸氢二钠、硫酸镁和氯化钙。在实施例中一升核心培养基可以具有表1所示的通用 配方但是在替代实施例中，核心培养基将或可以包含水、琼脂、蛋白、氨基酸、酪 蛋白水解物、盐类、脂类、碳水化合物、盐类、矿物质、和pH缓冲液中的一种或 多种，并且可以包括提取物例如肉提取物、酵母提取物、胰蛋白胨、植物蛋白胨、 蛋白胨、麦芽提取物，并且在实施例中，培养基可以是或者可以包含LB培养基； 低盐LB培养基（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物和0.5%NaCl），SOB培养基（2% 蛋白胨、0.5%酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl₂、10mM  MgSO₄），SOC培养基（2%蛋白胨、0.5%酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM  KCl、10mM MgCl₂、10mM MgSO₄、20mM葡萄糖），超级肉汤（3.2%蛋白胨、 2%酵母提取物和0.5%NaCl），2xTY培养基（1.6%蛋白胨、1%酵母提取物和0.5% NaCl），Terrific肉汤（TB）（1.2%蛋白胨、2.4%酵母提取物、72mM K2HPO4、 17mM KH2PO4和0.4%甘油），LB或LB Lennox肉汤（1%蛋白胨、0.5%酵母提 取物和1%NaCl）。应被理解的是，在特定实施例中，一种或多种成分可以从所述 核心培养基中省去。在实施例中，培养基可以是简单的、复杂的或指定的培养基并 且可以是扩繁培养基并且可以是以各种本领域技术人员所熟知的不同方式进行补充 的。广义地，本领域技术人员了解所述培养基包含基本适于支持一种或多种微生物 生长的任何成分。

表1：基于实施例的核心培养基的基本配方

在表1中，X和Y是以克为单位的数值。每一组X和Y可以分别是0.0,0.01, 0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.11,0.12,0.13,0.14,0.15,0.16,0.17, 0.18,0.19.0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9, 2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0, 4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5.0,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6.0,6.1, 6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9,8.0,8.1,8.2, 8.3,8.4,8.5,8.6,8.7,8.8,8.9,9.0,9.1,9.2,9.3,9.4,9.5,9.6,9.7,9.8,9.9,10.0,11.0,12.0, 13.0,14.0,15.0,16.0,17.0,18.0,19.0或大于19.0，或任何中间数；并且在特定实施 例中，X到Y的数值范围可以由X和Y的任何值确定。应被理解的是，在特定实 施例中，酵母提取物可以以各种形式被使用且本领域技术人员能够熟练选择Bacto  TM酵母提取物的一系列替代物。通过实施例的方式，在特定的实施例中，胰蛋白 胨、肉提取物和植物提取物可以作为适合的替代物，可以使用替代缓冲液并且在某 些实施例中，可以选择镁盐、钙盐和钠盐的替代物。本领域技术人员能够熟练地对 基础培养基的基本配方进行适当的调整以符合特定的目的。应被理解的是，任何的 和所有的与本文所公开的扩繁有效性相兼容的基础培养基上的变体都应被包括在本 文请求保护的主题范围内。

表2中显示了一种可能的实施例中的核心培养基的配方

表2：基于实施例的核心培养基

本领域技术人员熟知选择适合于所讨论的微生物的温度最有利于所需微生物的 生长。在特定的实施例中培养在约39℃下进行，并且可以将使用的肉汤预热至这 一温度来准备受试样品的接种。在此处公开的实施例中，培养可以在33℃-43℃之 间的任意温度下进行并且可以在约33℃,34℃,35℃,36℃,37℃,38℃或39℃或 40℃或41℃或42℃或43℃或33℃-34℃之间、34℃-35℃之间、35℃-36℃之 间、36℃-37℃之间、37℃-38℃之间、38℃-39℃之间、39℃-40℃之间、40℃- 41℃之间、41℃-42℃之间或42℃-43℃之间或34℃-43℃之间、35℃-42℃之 间、36℃-42℃之间、38℃-42℃之间、或39℃-41℃之间或39℃-40℃之间或 38℃-39℃之间或39℃-40℃之间或40℃-41℃之间或41℃-42℃之间或42℃-43℃ 之间的某个温度下进行。

本公开中，培养基的“扩繁”或“补充”指添加优选的成分（也被称为“补充剂”或 统称为“补充剂”）来促进一种或多种所需微生物的生长、增殖或其它特征，“扩繁 的”或“补充的”培养基是已经过如上所述扩繁过的培养基。“扩繁溶液”或“补充溶液” 或“补充剂”或“添加溶液”指包含这些添加成分的溶液。在实施例中，包含于扩繁溶 液中的所述成分可以包含烷醇胺和复合钴胺素的生物有效组合并且在实施例中所述 烷醇胺可以是乙醇胺，且所述复合钴胺素可以选自由钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴 胺素、羟钴胺素和氰钴维生素组成的组。在特定的实施例中，补充剂可以促进或选 择沙门氏菌或大肠杆菌的生长。应被理解的是，补充剂或扩繁溶液可以包含其有效 成分的浓度，所属浓度基本上为这些成分的最终所需浓度，使得可以在不给所述配 方培养基的核心成分的浓度或体积带来不良或过度的改变的情况下向所述配方培养 基中添加所述补充剂。在实施例中，扩繁培养液可以包含约1mg/ml复合钴胺素或 约0.125mg/ml复合钴胺素或约16.6M烷醇胺，或者可以包含具有相对和绝对浓度 的复合钴胺素和烷醇胺，这样向培养基中添加它们可以生物有效性地促进大肠杆菌 和沙门氏菌的生长。在实施例中，所述烷醇胺可以是乙醇胺并且所述复合钴胺素可 以是钴胺素。

在实施例中，扩繁培养基的制备可以包含向约1升的所述培养基中加入约4ml 的0.125mg/ml复合钴胺素溶液以及约2ml16.6M烷醇胺溶液，并且在实施例中， 所述烷醇胺可以是乙醇胺且所述复合钴胺素可以是钴胺素。然而，本领域技术人员 熟知这些量可以改变以适应特别的要求，并且在替代实施例中，所述最终扩繁培养 基可以包含约1x10^-6,2x10^-6,3x10^-6,4x10^-6,5x10^-6,6x10^-6,7x10^-6,8x10^-6,9x10^-6,1x10^-5, 2x10^-5,3x10^-5,4x10^-5,5x10^-5,6x10^-5,7x10^-5,8x10^-5,9x10^-5,1x10^-4,2x10^-4,3x10^-4,4x10^-4, 5x10^-4,6x10^-4,7x10^-4,8x10^-4,9x10^-4,1x10^-3,2x10^-3,3x10^-3,4x10^-3,5x10^-3,6x10^-3,7x10^-3, 8x10^-3,9x10^-3,1x10^-2,2x10^-2,3x10^-2,4x10^-2,5x10^-2,6x10^-2,7x10^-2,8x10^-2,9x10^-2,1x10^-1, 2x10^-1,3x10^-1,4x10^-1,5x10^-1,6x10^-1,7x10^-1,8x10^-1,9x10^-1,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20, 30,40,50,60,70,80,90,1x10²,2x10²,3x10²,4x10²,5x10²,6x10²,7x10²,8x10²,9x10², 1x10³,2x10³,3x10³,4x10³,5x10³,6x10³,7x10³,8x10³,9x10³或大于9x10³g/l的复合钴 胺素，并且在特定的实施例中，所述复合钴胺素可以在一定范围内，该范围的上下 限由上述的任何值决定，并且可以是约1x10^-3g/l，并且在特定实施例中可以在 1x10^-4-1x10^-1g/l之间或1x10^-4-1g/l之间或可以大于1x10^-4g/l、1x10^-3g/l、1x10^-2g/l 或1x10^-1g/l。同样地，本领域技术人员熟知，扩繁培养基中烷醇胺的浓度可以是近 似或大于0.02M烷醇胺，但在特定的实施例中，所述扩繁培养基可以包含至少或大 于约1x10^-6,2x10^-6,3x10^-6,4x10^-6,5x10^-6,6x10^-6,7x10^-6,8x10^-6,9x10^-6,1x10^-5,2x10^-5, 3x10^-5,4x10^-5,5x10^-5,6x10^-5,7x10^-5,8x10^-5,9x10^-5,1x10^-4,2x10^-4,3x10^-4,4x10^-4,5x10^-4, 6x10^-4,7x10^-4,8x10^-4,9x10^-4,1x10^-3,2x10^-3,3x10^-3,4x10^-3,5x10^-3,6x10^-3,7x10^-3,8x10^-3, 9x10^-3,1x10^-2,2x10^-2,3x10^-2,4x10^-2,5x10^-2,6x10^-2,7x10^-2,8x10^-2,9x10^-2,1x10^-1,2x10^-1, 3x10^-1,4x10^-1,5x10^-1,6x10^-1,7x10^-1,8x10^-1,9x10^-1,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40, 50,60,70,80,90,1x10²,2x10²,3x10²,4x10²,5x10²,6x10²,7x10²,8x10²,9x10²,1x10³, 2x10³,3x10³,4x10³,5x10³,6x10³,7x10³,8x10³,9x10³乙醇胺或或具有生物活性的前体 或修饰形式，并且在特定的实施例中可以包含2x10^-3-2x10^-1M之间的烷醇胺，并且 在实施例中可以包含2x10^-3-2M之间的烷醇胺，并且在实施例中，所述烷醇胺可以 是或可以包含乙醇胺。在基于实施例的扩繁培养基的特定实施例中，所述烷醇胺的 浓度可以大于约0.001M,0.002M,0.01M,0.02M,0.1M或0.2M，并且所述复合钴胺 素的浓度可以大于约0.001mg/ml,0.01mg/ml或0.1mg/ml。

本公开中，“培养条件”表示用于培养微生物的参数，并且包括化学成分和所述 培养基的物理性质以及温度、搅拌、封闭和培养周期和任何其它能影响微生物生长 的因素。因此在特定的实施例中，培养可以在33℃和43℃下的任何温度或在 33℃-43℃之间的任何温度下进行，并且可以在约33℃,34℃,35℃,36℃,37℃, 38℃,39℃,40℃,41℃,42℃或43℃下进行或在33℃-34℃之间、34℃-35℃之 间、35℃-36℃之间、36℃-37℃之间、37℃-38℃之间、38℃-39℃之间、39℃- 40℃之间、40℃-41℃之间、41℃-42℃之间、或42℃-43℃之间进行或者在34 ℃-43℃之间、35℃-42℃之间、36℃-42℃之间、38℃-42℃之间或39℃-41℃之 间或39℃-40℃之间或38℃-39℃之间或39℃-40℃之间或40℃-41℃之间或41℃- 42℃之间或42℃-43℃之间的某一个温度下进行或在任何其他适于目标细菌生长的 温度范围内进行。在特定的实施例中，所述培养温度可以约为39℃。可理解的是， 43℃以上的温度和33℃以下的温度也可以用于利用本文公开的培养基培养微生 物，但是已经发现，当需要培养大肠杆菌或沙门氏菌时，43℃-33℃温度范围之外 的温度可以相对促进其它非所需微生物的生长或对于促进目标微生物的生长的效果 较差。培养基的pH通常设于7-8之间，并且例如在特定的实施例中为或约为7.0, 7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9,8.0,8.1,8.2,8.3,8.4,8.5,8.6,8.7,8.8,8.9或9.0 或可以在上述任何两个值之间的范围内。因此在特定的实施例中，培养基的pH在 以7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8或7.9为下限且以7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7, 7.8,7.9,8.0,8.1,8.2,8.3,8.4,8.5,8.6,8.7,8.8,8.9或9.0为上限的范围内。在某个实施 例中，所述培养基的pH在7.8-8.4之间，在另一实施例中，所述培养基的pH在 7.9-8.3之间，并且在又一个实施例中，所述培养基的pH在8.0-8.2之间。

应被理解的是，pH7-9范围之外的pH在实施例中仍是可用的，但是所述培养 的效率和选择性可能会受到不利影响。接种完样品之后，按所需的周期进行培养， 但是发现在实施例中，7小时的培养周期已经足够将沙门氏菌或大肠杆菌扩繁到足 够的能利用常规方法进行检测的数量。然而，在基于特殊目的的替代实施例中，培 养周期或长或短并且达到或低于1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14小时等。本 领域技术人员能熟练选择适合的培养周期以符合特定要求。

本公开中，“微生物”指细菌，其可以是致病菌，并且在实施例中为沙门氏菌或 大肠杆菌。在特定的实施例中，所述沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌，且所述大肠杆菌 为大肠杆菌157、志贺毒素大肠杆菌(STEC)或肠出血性大肠杆菌(EHEC)。

本公开中，微生物“检测”指无论微生物或微生物变化是否能被实际检测到，对 微生物在生物样品中存在或变化进行观察的过程。换句话说，因为微生物或微生物 水平变化而测试样品的行为即“检测”，即使该微生物被确定不存在或低于灵敏度水 平。检测是定量、半定量或不定量观察并且基于与一种或多种对照样品的比较。检 测能被应用于任何样品，其中微生物的存在或不存在能得到确定，并且在特定的实 施例但不限于前述的一般性的情况下，样品是或者包含生物物质的任何形式并且可 以包含土壤或非土壤物质、肉类、家禽肉、鱼肉、海鲜、蔬菜、水果、乳制品、牛 奶、蛋、包装食品、罐头食品、瓶装食品或包裹的食品或刷卡垫或抹布。应被理解 的是，各种检测方法都可以实现并且本领域技术人员能熟练地在这些方法中选择并 实施。在特定的实施例中，检测通过PCR、实时PCR、外源凝集素、简易扩散、横 向扩散、免疫检测、侧向层析或分步层析或包括EIA和ELISA分析的方法进行并且 可以包括结合荧光或比色法检测，可以包括免疫层析技术，并且可以结合分子技术 例如DNA杂交和PCR分析。在实施例中，检测通过FoodChek^TM’s MICT^TM检测方 法和装置进行，其中的富集培养物的一部分需要被加热以杀灭目标分析物。加载加 热样品于侧向层析盒中，该侧向层析盒由包含连接于抗体的可结合病原体抗原的纳 米级磁性颗粒的样品/结合垫组成。测试还包括一个窄条带的二抗，该窄条带又叫捕 获区。毛细层析将加载的液体从样品垫流动至结合垫，在结合垫上目标细菌与抗体 包被的颗粒相结合。这种免疫混合物流入检测带进入捕获区。结果造成捕获区上的 磁性颗粒累积。如果目标抗原不存在，则不会形成免疫混合物，颗粒也不会在捕获 区累积且检测结果呈阴性。往下游方向，对照线，以相同的条带款式固定了不同的 试剂，用于证明了测试是正确进行的且试剂都是有活性的。所述层析盒在能够检测 低浓度的磁性颗粒的仪器中被读取。检测器在沿着测试条带的磁场中能感知细微的 变化，因为它在一组传感线圈下通过。所述线圈在交替方向上缠绕以便通过结合于 测试线或对照线的磁性颗粒产生有特征的信号轮廓。所述仪器将检测信号与编码在 条形码中的正阈值进行对比并报告结果是正还是负，每个层析盒上都贴有所述条形 码。所述结果在仪器的液晶显示屏上显示并打印，或传送至相关的电脑。除了所有 的分析参数之外，所述条形码编码了测试名称、批号和有效日期，这些随着测试结 果被打印出来。本领域技术人员熟知各种用于检测沙门氏菌、大肠杆菌和其它微生 物的认可的检测程序，并能熟练地将适当的这些检测方法与本文公开的培养和培养 方法相结合。通过说明而非限制的方式，在特定实施例中，可能的检测方法包括或 使用了对比文献US6483303;US6597176;US6607922;US6927570;US7323139中的 任何一篇中公开的主题，提到了用于测试或测定微生物是否存在的MICT技术的实 施例，这些文献中的公开内容在此以引用的方式全部并入本文中，并且进一步解释 了可在本文的实施例中选择使用的FoodChek^TM’s MICT^TM检测方法。

本公开中，“生物有效”指化合物、化学成分或混合物或化合物或化学成分的组 合拥有所需的生物效果。因此关于烷醇胺和复合钴胺素的生物有效混合物或组合表 示所述混合物拥有优先促进所需微生物生长的所需效果，并且在实施例中，所述微 生物可以是大肠杆菌或沙门氏菌的一种或多种。

本公开中，用于一种或多种化学物质或成分的“浓缩的”一词指制备浓度明显高 于所需的工作浓度的包含化学物质或成分或化学物质或成分的混合物。因此，例 如，如果所需的化学物质的浓度是0.02M，那么该化学物质的合适的浓缩溶液浓度 可以是20M，以便，例如，向培养基中添加浓缩溶液能获得所需的工作浓度而不显 著改变培养基中其它成分的浓度。

本公开中，一种特定微生物的“优先促进生长”和“优先培养”特定微生物等词语 指培养条件，该培养条件下相对于其它微生物更优先有利于促进或支持特定微生物 的生长。因此在实施例中，公开了导致沙门氏菌和大肠杆菌优先于其它微生物的增 长和分化的方法和培养基。因此这些词语代表条件，其中样品中特定的微生物相对 于其它微生物的生长得到提高，使得其它微生物的生长被抑制或增加，但这两种情 况下所需的被促进的微生物的比例在培养中都相对高于其它微生物。在实施例中， 培养中的目标微生物的生长可以是排他的或基本排他的。

本公开中，“样品”和“生物样品”具有与它们的内容相一致的相同的最广泛的可 能的含义，并且一般指但不限于任何由于一种或多种目的微生物存在而需要被检测 的物质，并且包括所有这类主题不管它是否包含任何微生物或任何目的微生物以及 不管它是否包含沙门氏菌或大肠杆菌。在实施例中，样品可以通过取一片或一部分 获得或通过棉签、擦拭、过滤、涂片的方式来获得，这些方式能被本领域技术人员 熟练理解、操作和选择。在特定的实施例中，样品是或者包含食品材料或是或者包 含植物或动物材料或是或者包含肉类、海鲜、鱼肉、蔬菜、水果、沙拉、速食食品、 蛋类、乳制品、组合和非组合食物材料、罐头食品或其它任何形式的生鲜的、生的、 煮熟的、未煮熟的、冰冻的、冷却的、土壤、排骨、罐头、热加工的、干燥的、保 藏的、提炼的或任何腌制的食品。在进一步的实施例中，样品可以取自环境、表面、 容器或场所，其中它需要确定目的微生物是否存在，例如但不限于，厨房表面、厨 具表面、食品储存容器、餐具、冷藏室、冰箱、显示容器、包装材料、活的植物和 动物以及其它环境、场所、表面或任何用户感兴趣的材料。本领域技术人员能理解 并采取合适的方法选择、获得并处理实施例中使用的任何样品。在优选的实施例中， 样品为肉类、鱼肉、海鲜、蔬菜、蛋类或乳制品等样品。

实施例中的培养基

在实施例中公开了包含具有生物有效浓度的复合钴胺素和烷醇胺的培养基。在 所述实施例的变体中且不限所述实施例的其它变体，所述复合钴胺素选自由钴胺 素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素、羟钴胺素和氰钴胺素组成的组。在所述实施例的特 定变体中，所述烷醇胺是乙醇胺。在实施例中，所述培养基是细菌培养及且在实施 例中，所述细菌是或者包括沙门氏菌和大肠杆菌或前述中的任何一种。在所述实施 例特定的变体中，所述细菌是或者可以包括鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌157、志贺 毒素大肠杆菌或肠出血性大肠杆菌。

在所述实施例特定的变体中，所述复合钴胺素存在的浓度大于0.002M并且所 述烷醇胺存在的浓度大于0.001mg/l。

在一系列的变体中，所述大肠杆菌是大肠杆菌157并且所述沙门氏菌是鼠伤寒 沙门氏菌，并且在实施例中，所述生物样品是可以是肉类样品和碎肉的食品样品。

实施例：

配方的非限制性示例的使用和组成以及基于实施例的培养基示例的使用如下：

为了制备培养基，将14,2g粉末核心培养基要素悬浮于1升的蒸馏水中。基于 示例的核心培养基的配方示于表3。分装至最终的容器中并在121℃下高压灭菌15 分钟。冷却至室温。在使用之前，添加2mL/L乙醇胺溶液（补充剂1）和0.5mL/L 维生素B12（补充剂2）。充分混合。这些补充剂进一步示于表4。所述培养基的 pH在7.9和8.5之间，目标值约为8.2。

应被理解的是提供成分的生产商信息只为示例而不为限制。本领域技术人员熟 知，相同或等同的材料或适合的等级可以从替代能源范围内获得且本领域技术人员 能熟练确定表3中列出的成分的适合的替代物。

表3：基于所述实施例的核心培养基成分

表4：添加至核心培养基以形成使用的最终培养基的补充剂

质量控制

性能：测试与鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028和大肠杆菌O157:H7ATCC43895孵育 的10mL/L的培养基。二者都能在一段适宜的孵育周期后在培养基上生长。阴性对 照是在没有接种体的情况下与相同的培养基孵育同样或更长的时间。应该显示没有 明显的细菌或微生物生长迹象。

当前述混合物（也被称为“基础”或“核心”肉汤或“培养基”）冷却后，添加用于 扩充或补充所述核心肉汤的成分，所述成分包含乙醇胺和维生素B12。在实践中， 所述乙醇胺和维生素B12可以在使用前添加至所述培养基中。本领域技术人员了 解，所述维生素溶液和乙醇胺在使用前应该灭菌。在实施例中，通过将1mg/mL维 生素B12和浓缩的乙醇胺混合制备所述维生素B12溶液，并且维生素B12溶液在使 用之前需要过滤灭菌。

本领域技术人员应熟知为了方便，所述基础肉汤或完整的肉汤可以制备成浓缩 物，在需要使用时再用灭菌水溶解。

然后，在实施例中生物样品被加入所需体积的扩繁培养基并在所需温度下保持 一段时间。当微生物被检测出是沙门氏菌时，那么在实施例中所述培养基温度在 38℃-40℃之间，而在进一步的变体中为约39℃。在实施例中，所述培养在所需的 温度下保持所需的时间周期，并伴随所需的或必要的搅拌。当所述培养的目的是检 测目标微生物，那么7个小时或更长的培养周期足以满足大部分测试程序但是在特 定变体实施例中可以选择至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10小时或更多的时间周期。然而，本 领域技术人员能根据特定目的必要和需要来熟练调整培养条件的周期、搅拌和温 度。

基于实施例的培养方法

在进一步的实施例中，公开了用于培养生物样品的方法，所述方法包含在具有 生物有效浓度的复合钴胺素和烷醇胺存在的情况下孵育样品的步骤。在实施例的变 体中，所述培养基是根据一个培养基实施例的培养基。在特定的实施例中，所述复 合钴胺素选自由钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素、羟钴胺素、氰钴胺素组成的 组；并且在实施例中，所述烷醇胺是乙醇胺。基于实施例的方法可以是用于培养细 菌的方法。在实施例的变体中所述细菌是沙门氏菌或大肠杆菌或包括这两种菌。在 实施例的变体中，所述细菌包括鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌157、志贺毒素大肠杆 菌或肠出血性大肠杆菌。在实施例的变体中所述烷醇胺存在的浓度可以大于0.002M, 0.02M或0.2M并且所述复合钴胺素存在的浓度可以大于0.001g/l、0.01g/l或0.1 g/l。在实施例中，所述方法是用于在生物样品中检测沙门氏菌和/或大肠杆菌。

在实施例中所述方法包含PCR、凝集素结合、简易扩散、侧向扩散、抗体结 合、侧向层析或分步层析。

在进一步的实施例中所述方法是用于在培养基中优先培养沙门氏菌或大肠杆菌 的方法，所述方法包含使用具有生物有效浓度的复合钴胺素和烷醇胺补充所述培养 基。

基于实施例的培养基补充剂

在进一步的一系列实施例中，公开了培养基的补充成分。在实施例中这样的成 分包含复合钴胺素和烷醇胺。在所述实施例的变体中但不限的情况下，所述复合钴 胺素选自由钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素、羟钴胺素和氰钴胺素组成的组。在 实施例中，所述烷醇胺是乙醇胺。在实施例中，所述成分可用于细菌的生长。在实 施例中所述细菌是或者包括沙门氏菌或大肠杆菌并且在实施例中是鼠伤寒沙门氏 菌、大肠杆菌157、志贺毒素大肠杆菌或肠出血性大肠杆菌。

基于实施例的检测细菌的方法

在进一步的实施例中公开了在生物样品中检测细菌的方法。在实施例中但不限 其他实施例，所述细菌是或包括大肠杆菌和沙门氏菌二者之一或全部。在所述实施 例的特定变体中，所述方法包括在烷醇胺和复合钴胺素的生物有效组合存在的情况 下培养样品。在实施例中，所述复合钴胺素选自由钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴胺 素、羟钴胺素和氰钴胺素组成的组。

在所述实施例的变体中公开了用于在样品中检测可以是沙门氏菌或大肠杆菌的 方法。在所述实施例的变体中所述方法包含如下顺序的步骤：在一定体积的包含具 有生物有效量的乙醇胺和复合钴胺素的培养基中培养样品；并且检测培养中的大肠 杆菌或沙门氏菌。在所述实施例中，乙醇胺和维生素B12的浓度根据其他实施例来 选择。在实施例中，所述培养在适宜的温度和其他条件下孵育一定时间以便在进行 微生物检测之前使目标微生物生长。在特定的实施例中所述检测包含通过使用 PCR、凝集素、简易扩散、侧向扩散、免疫检测、侧向层析或分布层析（flow  through methods）或可以使用任何其他适合的检测方法检测微生物。

在基于实施例的所述培养基中在适宜的培养条件下培养所述微生物一段时间之 后，目标微生物的存在可以通过对本领域技术人员来说显而易见的一系列方法中的 一种检测出来。这类方法包括但不限于PCR检测、凝集素结合、简单扩散、侧向扩 散、免疫检测、侧向层析或分步层析。不限于的情况下，免疫方法包括免疫沉淀、 杂交、免疫放射分析、关联磁性配体的免疫沉淀或可以包括任何其它合适的免疫学 方法。在特定的实施例中，完整的培养需要被加热或在测试前进行处理以杀灭微生 物。通过所需方法处理被加热的样品以鉴定被加热的样品中是否含有目标微生物的 抗原或核酸序列。

在实施例中所述培养基与FoodChek’s专用测试方法组合使用。所述方法在本文 中指MICT。广义的讲，在所述MICT过程的一个实施例中，扩繁培养物的一部分 可以被加热以杀灭目标分析物。所述加热样品被加载于侧向层析盒中，该侧向层析 盒由包含连接于抗体的可结合病原体抗原的纳米级磁性颗粒的样品/结合垫组成。测 试还包括窄条带上的二抗，该窄条带又叫捕获区。毛细层析将加载的液体从样品垫 流动至结合垫，在结合垫上目标细菌与抗体包被的颗粒相结合。这种免疫混合物流 入检测带进入捕获区。结果造成捕获区上的磁性颗粒累积。如果目标抗原不存在， 则不会形成免疫混合物，颗粒也不会在捕获区累积且检测结果呈阴性。往下游，对 照区，以类似的条带方式固定有不同的试剂，用于证明测试是正确进行的且试剂都 是有活性的。所述层析盒在能够检测低浓度的磁性颗粒的仪器中被读取。检测器在 沿着测试条带的磁场中能感知细微的变化，因为它在一组传感线圈下通过。所述线 圈在交替方向上缠绕以便通过结合于测试或对照线的磁性颗粒产生有特征的信号 谱。所述仪器将检测信号与编码在条形码中的正阈值进行对比并报告结果是正还是 负，每个层析盒上都贴有所述条形码。所述结果在仪器的液晶显示屏上显示并打 印，或传送至相关的电脑。除了所有的分析参数之外，所述条形码编码了测试名 称、批号和有效日期，这些随着测试结果被打印出来。所述MICT方法和装置使用 的实施例列于对比文献US7323139,US6927570,US6607922,US6597176,US6518747, US6483303,US6046585,US6275031,US6437563的一篇或多篇中，法律允许的情况 下，这些文献中的公开内容在此以引用的方式并入本文中。本领域技术人员熟知可 以使用的各种各样的替代的检测方法。

基于实施例的培养基能至少取代分离鉴定沙门氏菌标准程序中的第一扩繁步 骤。

在实施例中，从可能包含低于1cfu的初始接种体开始孵育近7h后可能达到一 些现有检测技术所要求的目标微生物水平（如，约10³-10⁴cfu/ml）。在其他实施例 中达到这种水平也是可能的。在实施例中所述检测可以使用MICT程序。在实施例 中初始样品可以是肉类并且所述样品可以是约375g的肉，而本领域技术人员可以 根据特定的目的识别选择任何合适尺寸和性质的样品。

示例

下述示例作为实施例的说明示出，但不限制请求保护的各种实施例中的主题范 围。

表5显示了用于培养沙门氏菌（也被称作Actero沙门氏菌/STEC扩繁培养基） 培养基的配方。

基于实施例的培养基的成分和使用如下：将14,2g粉末培养基组分悬浮于1升 的蒸馏水中。分装至最终容器中并在121℃下高压灭菌15分钟。冷却至室温。在 使用前，添加2mL/L的乙醇胺溶液（补充剂1）和0.5mL/L的维生素B12（补充剂 2）。充分混合。所述培养基的pH在7.9-8.5之间，目标值为约8.2。

表5：基于示例的核心培养基成分

冷却核心培养基并加入下列成分：

成分 生产商(Cat.#) 规格mL 乙醇胺(溶液)16.6M(补充剂1) Sigma(E0135) 2 维生素B12溶液1mg/ml(补充剂2) Sigma(V6629) 0.5

质量控制

性能：测试与鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028和大肠杆菌O157:H7ATCC43895孵育 的10mL/L的培养基。二者都能在一段适宜的孵育周期后在培养基上生长。阴性对 照是在没有接种体的情况下与相同的培养基孵育同样或更长的时间。应该不出现明 显的细菌或微生物生长迹象。

当所述混合物（也被称为“基础”或“核心”培养基或肉汤）冷却后，添加乙醇胺 和维生素B12。现在只在使用前向培养基加入乙醇胺和维生素B12。本领域技术人 员了解，所述维生素溶液和乙醇胺在使用前应该灭菌。在实践中，通过将1mg/mL 维生素B12和1mg/ml的乙醇胺混合制备所述维生素B12溶液，并且维生素B12溶 液需要过滤灭菌。

本领域技术人员应熟知为了方便，所述基础肉汤或完整的肉汤可以制备成浓缩 物，在需要使用时再用灭菌水溶解。

测试方法

准备325g碎牛肉样品为一份样品。

1.通过将培养基置于培养箱过夜（10-20小时）或在水浴中放置数小时将培养基预 热至39℃。

2.扩繁前，向1L预热的培养基中快速加入2mL乙醇胺和500μL1mg/mL的维生素 B12溶液。通过旋转和翻转充分混匀。

3.向在带过滤装置的均质袋中向两份预热的培养基（包含乙醇胺和维生素B12）中 加入一份样品（例如将650mL补充培养基加到325g碎牛肉中）。

4.在匀浆机3500中以150rpm进行样品匀浆30秒。

5.松散地闭合袋子将样品在水浴中39℃下孵育扩繁7小时。如果是大量样品需要被 分析，则开始记录孵育时间之前核实样品袋之间的水的温度已达39℃。精确控制扩 繁周期对于获得有价值的和准确的结果很重要。

6.7小时后将样品从水浴中取出并重悬内容物。

一旦样品制备好，就可以使用如上所述的FoodChek’s分析程序或使用任何常规 的测试方法检测沙门氏菌或大肠杆菌了。在一个示例中，所述沙门氏菌可以使用合 适的选择性抗体被检测。在实施例中，使用合适的灵敏的检测方法，灵敏度可以是 1cfu/325g碎牛肉。这种合适的灵敏的检测方法可以包含选择性抗体的使用。

进一步的示例

耗材和试剂：蒸馏/去离子、灭菌水，任何来源；四硫酸肉汤（TT）-加拿大魁北克 省Quelab实验室；Rappaport-Vassiliadis大豆蛋白胨肉汤（RVS）-英国汉普郡 Oxoid；Rappaport-Vassiliadis肉汤（RV）、木糖赖氨酸的Tergitol-4琼脂（XLT4）- 美国新泽西州Difco Becton Dickinson；BG磺胺琼脂（BGS）-美国新泽西州Difco  Becton Dickinson；木糖赖氨酸脱氧胆酸琼脂（XLD）-加拿大魁北克省Quelab实验 室；Hektoen Enteric琼脂（HE）-加拿大魁北克省Quelab实验室；三糖铁（TSI）-美 国新泽西州Difco Becton Dickinson；赖氨酸铁琼脂（LIA）-美国新泽西州BBL  Becton Dickinson；沙门氏菌抗血清-美国新泽西州Difco Becton Dickinson；用于鉴定 肠杆菌的API20E试剂盒-法国Biomérieux,Marcy-L’etoile；塑料接种针和10μL接种 测量杯，任何来源；10mL无菌枪头-任何来源。

装置：固定式培养箱Symphony^TM(VWR,USA)或类似装置-能提供39℃±0.5；固定 式培养箱model1555(VWR,USA)或类似装置-能提供35℃±2.0；水浴锅(美国 Polyscience)或类似装置-能提供39℃±0.5；水浴、循环、恒温控制（美国 Lindberg/Blue）或类似装置-能提供42℃±0.2；水浴、循环、恒温控制（美国 Lindberg/Blue）或类似装置-能提供43℃±0.2；微量吸管-能精确量取500μL-任何来 源；上皿天平用于称取25、100、325g样品-任何来源；匀浆器-Seward model3500 （英国伦敦Seward）或类似装置-用于充分混合扩繁肉汤中的食品样品；涡旋混合器 （美国VWR）。

培养基的一般制备：为了制备Actero沙门氏菌/STEC，将14,2g粉末培养基悬浮于1升 的蒸馏水中并充分混合。分装至最终容器中并在121℃下高压灭菌15分钟。冷却至 室温。在某些情况下已经发现如果培养基在制备后马上使用则无需高压灭菌，这种 情况下则建议使用灭菌水制备培养基。在使用前，在无菌条件下向1升核心培养基 中添加2mL补充剂1（16.6M乙醇胺）和0.5mL/L的补充剂2（1mg/ml维生素B12）。

基于产品说明书的其他培养基制备

其他材料和试剂：添加5%羊血的胰酶大豆琼脂平板（血琼脂）-美国新泽西州BBL  Becton Dickinson；TT肉汤（TT Hajna）-加拿大魁北克省Quelab实验室；胰蛋白胨 大豆琼脂（TSA）-加拿大魁北克省Quelab实验室；胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）-英国 汉普郡Oxoid；平板计数琼脂（PCA）；磷酸盐缓冲盐水（PBS）-英国汉普郡 Oxoid；修饰后的彩虹琼脂（mRBA）-美国加利福尼亚Biolog；琼脂亚硫酸铋 （BS）-美国新泽西州BBL Becton Dickinson；乳糖肉汤-加拿大魁北克省Quelab实验 室；缓冲蛋白胨水（BPW）-美国圣路易斯Fluka Analytical；恒温水浴锅（美国 Fisher Scientific）或类似装置-能提供55℃±0.2。进行上述方法所需的材料、方式和 试剂的进一步的详细说明请见：USDA/FSIS微生物实验室指南，第3版第4章“从肉 类、猪肉和蛋类产品中分离和鉴定沙门氏菌”Rev.#4, http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_4_05.pdf；USDA/FSIS微生物实验室指南，第3版 第5章B“从肉类产品中检测盒分离非O157产志贺毒素大肠杆菌（STEC）”Rev.#1, http://www.fsis.usda.gov/PDF/Mlg_5B_01.pdf；FDA细菌分析手册，第8版，2011年11 月版，第5章“沙门氏菌”， http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/ucm070149.htm。

样品制备：样品的制备取决于样品的类型和尺寸。因此，准备样品的工序选择反映 了这些条件。选定的样品类型的准备方法进一步如下所示：

分析：样品的分析取决于样品的类型。因此选择准备样品的工序应考虑样品类型。

释义及测试结果报告：结果根据美国FDA细菌性分析手册第5章和USDA FSIS微生 物实验室指南章节4.05和5B.01来确定，这两部分对于本领域技术人员来说是熟知的 并且在法律允许的，通过引用的方式全部并入本文中。

内部验证研究：

进行了下述验证研究：

1.活力测试：

为评估两种因素：孵育温度和时间的影响，进行了活力研究。活力变量和它们 各自的范围如表6所示。

方法：通过在选择性琼脂平板上对3份纯培养生长的分析来评估每一组测试范围条 件。选择鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028作为沙门氏菌的代表，并且在XLT4和BGS琼 脂平板上分析结果。选择大肠杆菌0157:H7ATCC43895作为STEC并且在修饰的彩 虹琼脂上进行分析，并且选择粪肠球菌ATCC19433作为非目标菌株且在XLT4、 BGS和修饰的彩虹琼脂上进行分析。

对于3种参数，菌株在添加了5%羊血的胰酶大豆琼脂（也被称为血琼脂）上进 行划线并于35℃±1℃下孵育过夜。将目标菌株的一些菌落转移至9mL的TSB中在 35℃±1℃下放置6-7小时。每一份培养物以1:10的比例稀释于新鲜TSB中并在相同 温度下孵育过夜。然后将这些培养物稀释以在Actero沙门氏菌/STEC Actero沙门氏 菌/STEC肉汤中获得分数接种水平（每份样品0.5CFU）。所述培养物使用除了评估 的参数之外的标准工序生长。

对于非目标菌株采用相同的方法进行培养除了接种水平高出10倍。对于需要测 试的每个参数，每一组目标菌株进行10个重复而非目标菌株进行5个重复。

结果：根据基于结果进行的POD（检测概率）分析，无任何显著差异（表6）。极 端条件下dPOD（检测概率差异）间的置信区间包含零，因此每个参数间无统计学 差异。所以测试时温度和时间的微小改变并不显著影响Actero沙门氏菌/STEC恢复 鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028和大肠杆菌0157:H7ATCC43895的能力。在任何情况 下都没有在Actero沙门氏菌/STEC样品中检测到非目标菌株粪肠球菌ATCC19433的 存在（数据未示出）。

表6.Actero沙门氏菌/STEC法活力研究结果

^aN=测试份数

^bx=阳性测试份数

^cPOD_A=条件A下的阳性结果除以总测试数

^dPOD_B=条件B下的阳性结果除以总测试数

^edPOD_AB=条件A和条件B POD值之间的差异

^f95%CI=如果dPOD的置信区间不包括零那么差异水平为5%为差异显著

2.包容性研究：

分析了几乎代表了所有种类的沙门氏菌（包括乳糖阳性菌株）的一百零九（109） 株沙门氏菌菌株（表7）和代表了STEC种类（菌株属于“big six”和大肠杆菌O157家 族）的50株产志贺毒素大肠杆菌（STEC）（表8）以测试肉汤扩繁沙门氏菌和STEC 菌株的能力。

方法：所有的沙门氏菌和STEC菌株在血琼脂上进行划线并于35℃下孵育过夜。将 一些菌落转移至10mL的TSB中在35℃下放置6-7小时。每一份培养物以1:10的比例稀 释于新鲜TSB中并在相同温度下孵育过夜。然后将这些培养物稀释以在Actero沙门 氏菌/STEC肉汤中以低浓度菌株进行接种（1.0-20CFU/mL）。每一种菌株培做3个 重复。培养物在水浴中于39±0.5℃下放置7h。沙门氏菌菌株的生长通过每份样品取 10μL在沙门氏菌选择性琼脂平板（XLT4,BGS,XLD和HE）上进行划线来分析。对 于STEC菌株，通过在修饰的彩虹琼脂平板上进行划线类分析其生长。

结果：沙门氏菌和STEC菌株的包容性研究结果分别在表7和表8中进行了总结。在 Actero沙门氏菌/STEC肉汤中的110株测试的沙门氏菌之中，6号生长缓慢，且3号不 生长。总的来说，109株沙门氏菌菌株中有106株（97.2%）能在Actero沙门氏菌/ STEC肉汤中生长且能被特异性选择琼脂平板识别。关于STEC菌株，50株（100%） 测试的菌株均能在Actero沙门氏菌/STEC肉汤中生长且能被选择性琼脂平板识别， 但是有2株相比其他来说生长较缓慢。因此，总的说来，98.1%的目标菌株能在扩繁 条件下被识别。

表7：沙门氏菌列表-包容性研究结果

^aLFZ(PHAC):食源性人畜共患病的实验室(加拿大公共卫生局),加拿大圭尔夫,SGSC:沙门氏菌遗传库存中心, 加拿大卡尔加里大学生命科学院,MAPAQ:加拿大魁北克省农业、渔业和食品部。CIPARS(PHAC):加拿大抗 菌素耐药性监视综合项目,(加拿大公共卫生局),加拿大圣雅仙.Maxivet公司:加拿大魁北克省圣雅仙.

+在沙门氏菌选择性琼脂平板上出现典型的沙门氏菌菌落

+*在沙门氏菌选择性琼脂平板上出现典型的沙门氏菌菌落但观察到生长较为缓慢。

-在选择性琼脂平板上没有观察到特定沙门氏菌的生长。

表8：STEC列表-包容性研究结果

*这些细菌相比其它菌株生长较慢

^aPHAC:加拿大公共卫生局,加拿大圭尔夫.EcL:加拿大魁北克圣雅仙，兽医系大肠杆菌实验室.E.coli ref. center:大肠杆菌参考中心,美国宾夕法尼亚州，宾夕法尼亚州立大学.LSPQ:加拿大魁北克省，魁北克省公共卫 生实验室.CRDA:加拿大魁北克圣雅仙，食品研究与发展中心

+在彩虹琼脂上出现典型的STEC菌落。

+*在彩虹琼脂上出现典型的STEC菌落但观察到生长较为缓慢。

-特定的沙门氏菌菌株在选择性琼脂平板上不生长。

3.排他性研究

被选作与沙门氏菌和大肠杆菌以及在相同环境下发现的菌种的近缘菌株的三十 一（31）株非目标菌株在Actero沙门氏菌/STEC扩繁培养基上进行了测试。它们代 表25中不同的细菌和酵母种类。

方法：每一种非目标菌株在血琼脂上进行划线并于35℃下孵育过夜。然后，每一 种非目标菌株在它们的最佳条件下进行培养。将每一份细菌悬浮液稀释以便在 Actero沙门氏菌/STEC肉汤中以平均浓度高于目标菌株中使用的10倍的浓度接种。 这一步骤做3个重复。它们在Actero沙门氏菌/STEC肉汤中的生长在水浴中于39± 0.5℃下放置7h以及在培养箱中放置18小时进行测试。然后在沙门氏菌特异的选择 性琼脂平板上对它们进行分析以证实它们是否在生长以及Actero沙门氏菌/STEC肉 汤是否出于某种原因能导致表型改变从而导致结果的误读。

结果：表9中总结了排他性结果。大部分非目标菌株在选择性琼脂平板上不生长。 从那些可以观察到生长的地方来看，它们中没有一株表现出了类似沙门氏菌或 STEC菌株或者可能导致选择性琼脂平板上的结果误读。

表9：排他性测试中包括的非沙门氏菌/非STEC细菌

^aFMV:加拿大蒙特利尔大学兽医系细菌学诊断服务实验室.SGSC:加拿大卡尔加里大学生物科学学院沙门氏菌 遗传库存中心.ARS:美国华盛顿特区农业科学研究院,20250。

4.样品制备：所有不同的食物购自进行实验地点附近的零售店。

5.食品测试：进行矩阵研究（使用5种食物）来评估沙门氏菌和STEC菌株相比标准 的扩繁方法在Actero沙门氏菌/STEC肉汤中恢复的能力。根据测试的食品类型使用 不同的扩繁条件。根据下述两个理由来选择食物：1)基于食物中毒或食品污染相关 形式频繁爆发的含义，以及2)基于目标菌株支持的胁迫型（冷胁迫和热胁迫）菌株 的功能

方法：

全液蛋：

样品制备：将肠炎沙门氏菌（分离自鸡翅膀）在TSBA上划线并在35℃下孵育过 夜。将一些菌落转移至9mL的TSB中在35℃下放置6-7小时。培养物以1:10的比例稀 释于新鲜TSB中并在相同温度下孵育过夜。在接种之前，1.5mL培养基在水浴中于 55℃下加热处理2分钟以实现对接种体50-80%的伤害。伤害程度通过将选择性琼脂 平板和非选择性琼脂平板上的生长进行对比来确定。接种体获得的伤害程度为 63%。将五千五百毫升的全液蛋在一定水平上与产出的部分阳性结果 （1CFU/100g）接种并手摇使其均匀。剩下一千五百毫升的全液蛋未接种。将这两 部分在4℃下贮存48h使细菌在食品中稳定。利用MPN（最大可能数）分析评估稳定 阶段后的污染水平。在带过滤装置的均质袋中将接种部分分为两组20份100g样品而 未接种部分被分为10份100g样品。

Actero沙门氏菌/STEC扩繁：将一组样品（20份接种的和5份未接种的）与 300mL预热的Actero沙门氏菌/STEC肉汤一起匀浆30秒并在水浴中于39± 0.5℃下孵育7h。然后将样品直接在亮绿磺胺琼脂（BGS）和木糖赖氨酸的 Tergitol-4琼脂（XLT4）上进行划线并且根据USDA/FSIS沙门氏菌参考工艺 通过生化和血清学方法来确认所有假定的菌落。

Actero沙门氏菌/STEC扩繁确认：将0.5ml扩繁的Actero沙门氏菌/STEC样品 转移至10mL四硫酸（Hajna）肉汤，并将0.1ml扩繁的Actero沙门氏菌/STEC 样品转移至10mL修饰的Rappaport-Vassiliadis大豆肉汤（RVS）并于42± 0.5℃下孵育22-24h。然后将它们在BGS和XLT4上进行划线并于35℃下孵育 18-24h。如果菌落很小或者不明显，则将它们再孵育18-24h。每个平板挑取 3个典型菌落并将菌落转移至TSI和LIA斜面培养基上。按MLG4.05进行生物 和血清学方法来确认阳性样品。

参考方法扩繁：将第二组样品（20份接种的和5份未接种的样品）在900mL 缓冲蛋白胨水中于35±2.0℃下放置18-24h进行扩繁，然后根据USDA/FSIS 沙门氏菌参考工序对其进行加工。将MPN样品用相同的方式进行处理。所有 假定的阳性样品通过USDA/FSIS推荐的生化和血清学鉴定方法来确认。

生冻扇贝：

样品制备：将圣保罗沙门氏菌（S.saintpaul）在血琼脂平板上进行划线并于 35℃下孵育过夜。将一些菌落转移至9mL的TSB中在35℃下放置6-7小时。培 养物以1:10的比例稀释于新鲜TSB中并在相同温度下孵育过夜。将一千七百 克（1700g）的生冻扇贝在一定水平上与产出的部分阳性结果 （1.25CFU/25g）接种并手摇使其均匀。剩下三百克（300g）生冻扇贝未接 种。将这两部分在-20℃下贮存两周使细菌在食品中稳定。利用MPN（最大 可能数）分析评估稳定阶段后的污染水平。将接种部分分为两组20份25g样 品而未接种部分被分为两组10份25g样品。

Actero沙门氏菌/STEC扩繁：将一组样品（20份接种的和5份未接种的样品） 与50mL预热的Actero沙门氏菌/STEC肉汤一起匀浆30秒并在水浴中于39± 0.5℃下孵育7h。然后将样品直接在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD）和 Hektoen Enteric琼脂（HE）上进行划线并且根据BAM5沙门氏菌参考工艺通 过生化和血清学方法来确认所有假定的菌落。

Actero沙门氏菌/STEC扩繁确认：将1.0ml扩繁的Actero沙门氏菌/STEC样品 转移至10mL四硫酸肉汤中，并将0.1ml扩繁的Actero沙门氏菌/STEC样品转 移至10mL Rappaport-Vassiliadis（RV）肉汤并分别于35±2℃和42±0.5℃下 孵育22-24h。然后根据Bam5将它们在选择性琼脂平板上进行划线并按BAM 5沙门氏菌参考工艺通过生物和血清学方法来确认假定的阳性样品。

参考方法扩繁：将第二组样品（20份接种的和5份未接种的样品）在225mL 乳糖肉汤中于35±2.0℃下放置24±2h进行扩繁，然后根据BAM5沙门氏菌 参考方法对其进行加工。所有假定的阳性样品通过FDA推荐的生化和血清学 鉴定方法来确认。

生碎鸡肉：

样品制备：使用自然污染的生碎鸡肉。为了获得分数（低水平）阳性结果， 将自然污染的碎鸡肉与未污染的产品进行仔细混合以确保均匀性（制备了一 千三百克（1300g）样品）。高水平部分使用剩下的未稀释的二百五十克 （250g）自然污染的碎鸡肉。利用MPN分析确定碎鸡肉中沙门氏菌的水平。 将低水平污染部分分为两组20份25g样品而高水平污染部分被分为10份25g样 品。所有样品都放在带有过滤装置的均质袋中。

Actero沙门氏菌/STEC扩繁：将一组样品（20份低水平的和5份高水平的样 品）与50mL预热的Actero沙门氏菌/STEC肉汤一起匀浆30秒并在培养箱中于 39±0.5℃下孵育20h。然后将样品直接在BGS和XLT4上进行划线并于35℃ 孵育18-24h，并且根据USDA/FSIS沙门氏菌参考工艺通过生化和血清学方法 来确认所有假定的菌落。

Actero沙门氏菌/STEC扩繁确认：将0.5ml扩繁的Actero沙门氏菌/STEC样品 转移至10mL四硫酸（Hajna）肉汤中，并将0.1ml扩繁的Actero沙门氏菌 /STEC样品转移至10mL Rappaport-Vassiliadis大豆肉汤（RVS）中并于42± 0.5℃下孵育22-24h。然后将它们在BGS和XLT4上进行划线并于35℃下孵育 18-24h。如果菌落很小或者不明显，则将它们再孵育18-24h。每个平板挑取 3个典型菌落并将菌落转移至TSI和LIA斜面培养基上。按MLG4.05进行生物 和血清学方法来确认阳性样品。

参考方法扩繁：将第二组样品（20份接种的和5份未接种的样品）在900mL 缓冲蛋白胨水中于35±2.0℃下放置18-24h进行扩繁，然后根据USDA/FSIS 沙门氏菌参考工序对其进行加工。将MPN样品用相同的方式进行处理。所有 假定的阳性样品通过USDA/FSIS推荐的生化和血清学鉴定方法来确认。

球芽甘蓝（Sprouts）：

样品制备：将蒙得维的亚沙门氏菌（S.montevideo）在血琼脂上划线并于 35℃下孵育过夜。将一些菌落转移至9mL的TSB中在35℃下放置6-7小时。培 养物以1:10的比例稀释于新鲜TSB中并在相同温度下孵育过夜。将一千五百 克（1500g）的球芽甘蓝在一定水平上与产出的部分阳性结果 （1.0CFU/25g）接种并手摇使其均匀。剩下四百克（400g）球芽甘蓝未接 种。将这两部分在4℃下贮存48H使细菌在所述食品中稳定。利用MPN（最 大可能数）分析评估稳定阶段后的污染水平。将接种部分分为两组20份25g 样品而未接种部分被分为两组5份25g样品。

Actero沙门氏菌/STEC扩繁：将一组样品（20份接种的和5份未接种的样品） 与150mL预热的Actero沙门氏菌/STEC肉汤一起匀浆30秒并在水浴中于39± 0.5℃下孵育7h。将1.0ml扩繁的Actero沙门氏菌/STEC样品转移至10mL四硫 酸肉汤中，并将0.1ml扩繁的Actero沙门氏菌/STEC样品转移至10mL Rappaport-Vassiliadis（RV）肉汤并分别于43±0.2℃和42±0.2℃下孵育18h （因为球芽甘蓝被认为具有高微生物负荷）。然后将样品在如Bam5中所述 的选择性琼脂平板上进行划线并且根据BAM5沙门氏菌参考工艺通过生化和 血清学方法来确认假定的阳性菌落。

Actero沙门氏菌/STEC扩繁确认：为了确认，将Actero沙门氏菌/STEC的双重 扩繁的孵育时间延长6小时总共孵育24h（按FDA所推荐的）。然后将样品在 如Bam5中所述的选择性琼脂平板上进行划线并且根据BAM5沙门氏菌参考 工艺通过生化和血清学方法来确认假定的阳性菌落。

参考方法扩繁：将第二组样品（20份接种的和5份未接种的）在225mL乳糖 肉汤中于35±2.0℃下放置24±2h进行扩繁，然后根据BAM5沙门氏菌参考 方法对其进行加工。所有假定的阳性样品通过FDA推荐的生化和血清学鉴定 方法来确认。

结果：表10、11中总结了方法对比研究的所有结果。在全液蛋中，利用 Actero沙门氏菌/STEC肉汤在水浴中与39℃下扩繁7h，20份样品中检测出10 份阳性样品。根据USDA/FSIS参考工艺进行的双重扩繁的Actero沙门氏菌 /STEC扩繁样品确认了结果的特异性为100%（表10）。从20份参考方法测试 的样品来看，有10份样品被确认为阳性。经FoodChek Actero沙门氏菌/STEC 扩繁方法和USDA/FSIS参考方法检测均发现所有未接种的样品为阴性（表 11）。

A)此外在生冻扇贝中，利用Actero沙门氏菌/STEC肉汤的FoodChek扩繁方法 的表现欲参考方法相近。有效的是，利用Actero沙门氏菌/STEC肉汤在水浴 中扩繁7小时，20份以分数水平接种的样品中有5份样品被确认为阳性，特异 性为100%（表10）。FDA（BAM5）参考方法检测到4份阳性样品。两种方 法确认所有的未接种的样品均为阴性。将所得结果进行统计学分析（未成对 检验）表明FoodChek Actero沙门氏菌/STEC扩繁方法和USDA/FSIS参考方法 之间无显著差异（表11）。

B)在生碎鸡肉中，测试了自然污染的样品。FoodChek Actero沙门氏菌/STEC 方法包括利用Actero沙门氏菌/STEC肉汤在培养箱中于39℃下扩繁20h，从20 份被分析的样品中检测出了7份阳性样品。通过Actero沙门氏菌/STEC扩繁样 品的双重扩繁的确认同样检测出了7份阳性样品，特异性为100%（表10）。 参考方法从20份被测样品中检测出了10份阳性样品。两种方法都检测出了5 份自然污染的高水平样品。在未成对检验中，对所获得的结果进行统计学分 析表明FoodChek Actero沙门氏菌/STEC扩繁方法和USDA/FSIS参考方法之间 无显著差异（表11）。

C)在球芽甘蓝中，FoodChek扩繁方法包括在Actero沙门氏菌/STEC肉汤在水 浴中于39℃下扩繁7h并分别在TT肉汤和RV中在水浴中分别于43℃和42℃下 进行二次扩繁，从20份制备的样品中确认了11份阳性样品（表10）。而不巧 的是，对于参考方法，只分离到了极少的典型菌落并且经生化检验验证它们 为阴性。对于未分离的典型菌落进行了3次重新分离，但是经生化检验仍然 没有发现沙门氏菌的阳性菌落。唯一的阳性结果是来自MSN分析的50g样 品。这里获得的结果的统计学分析表明两种方法之间存在显著差异（表 11）。

表10：FoodChek Actero沙门氏菌/STEC方法假定结果与确认结果的比较

^aMPN=最大可能数是利用实验室中AOAC MPN计算器得出的参考方法的测试份数的POD值，置信区间为95%

^bN/A=不适用

^cN=测试份数

^dx=阳性测试份数

^ePOD_CP=候选方法假定阳性结果除以总测试数

^fPOD_CC=候选方法确认阳性结果除以总测试数

^gdPOD_CP=候选方法假定结果和候选方法确认结果POD值之间的差异

^h95%CI=如果dPOD置信区间不包括零，那么差异水平为5%为差异显著。

表11：方法比较结果

^aMPN=最大可能数是利用实验室中AOAC MPN计算器得出的参考方法的测试份数的POD值，置信区间为95%

^bN/A=不适用

^cN=测试份数

^dx=阳性测试份数

^ePOD_C=确认的候选方法的阳性结果除以总测试数

^fPOD_R=确认的参考方法的阳性结果除以总测试数

^gdPOD_C=候选方法和参考方法POD值之间的差异

^h95%CI=如果dPOD置信区间不包括零，那么差异水平为5%为差异显著。

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