酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌的定量分析方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及酒醅中梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法。本发明要解决的技术问题是为分析酒醅中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌提供一种新选择。本发明的技术方案是窖泥中梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法，包括如下步骤：a、标准曲线的制备；b、提取基因组DNA；c、扩增；d、定量分析。本发明方法可用于分析窖泥中的梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的变化趋势。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌 的定量分析方法。

背景技术

我国白酒的生产历史悠久，但众多白酒生产厂家的发酵过程都以传统的经验为主，工 艺可控性较差，并且产品品质存在批次差异，尤其是风味差异较大。这主要是由于酿造过 程中微生物复杂多样，对白酒发酵过程中的微生物作用机制不清楚。中国白酒的酿造工艺 是多菌种混合发酵工艺，通过多种微生物的代谢作用产生不同风味的白酒。白酒的生产中 有三个主要的发酵阶段：主发酵期、生酸期以及产香味期。在主发酵期，淀粉质原料如糯 米、高粱等经过微生物的一系列代谢作用，最终生成酒精的阶段；在生酸期，窖内的酒醅 经过复杂的生物化学等变化，产生大量的有机酸，其中细菌代谢活动酸类物质生成的主要 途径；产香味期，在该阶段发酵前期产生的乙醇和酸类物质，经微生物产生的酶的催化作 用形成大量酯类物质和其他的香味物质。因此，发酵过程酒醅微生物群落结构和数量是影 响白酒风味物质形成的重要因素。

研究者采用传统培养、现代分子生物学技术等方法，对酒醅中微生物群落结构进行分析和 研究，发现乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌是酒醅微生物菌群中的主要功能菌，但这3类微生物 在发酵过程中的动态变化情况不清楚，因此阐明发酵过程中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌生物 量的动态变化，对阐明白酒动态发酵过程以及白酒风味物质的形成都具有重要的意义。

通过传统培养与现代分子生物学技术，对酒醅中微生物群落结构进行分析和研究，了 解了酒醅中主要微生物群落结构的组成，但是，酒醅主要的微生物定量检测缺乏一种合理、 快捷的方法，传统对酒醅中微生物定量检测的方法，仍然采用选择培养基的筛选和纯培养 分离计数的方法，但是，该方法受到外界环境因素，菌种特性等影响，检测结果缺乏稳定 性和可靠性，且耗时费力。

荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测 整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术不仅实现了DNA模 板的定量，而且具有特异性强、灵敏度高、高通量、反应全封闭、定量准确、速度快及自 动化程度高等特点，已成为在分子生物学及微生物领域中重要的定量方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种分子生物技术用于定量检测酒醅发酵过程中乳酸菌、梭菌、 芽孢杆菌生物量的动态变化，以指导实践。

本发明的技术方案是酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌的定量分析方法，包 括如下步骤：

a、标准曲线的制备：设计针对梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的标准细菌的特异性引物，然 后进行荧光定量PCR，根据拷贝数与CT值构建的标准曲线；

b、提取基因组DNA：利用洗脱、酶消化结合的方法提取提取酒醅微生物群落的宏基 因组；

c、扩增：采用梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的特异性引物，对酒醅微生物宏基因组中梭菌、 乳酸菌和芽孢杆菌的特异性片段进行扩增；

d、定量分析：通过标准曲线和待测样品的CT值对窖泥微生物群落中梭菌、乳酸菌和 芽孢杆菌进行定量分析。

具体的，步骤a和c中扩增乳酸菌的特异性引物如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

具体的，步骤a和c中扩增梭菌的特异性引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

具体的，步骤a和c中扩增芽孢杆菌的特异性引物如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

乳酸菌特异性引物序列（5′→3′）：

Lacto-F：AGAACACCAGTGGCGAAGG（SEQ ID No.1）；

Lacto-R：CAGGCGGAGTGCTTAATGC（SEQ ID No.2）。

梭菌特异性引物序列（5′→3′）：

Clost-F：AAAGGRAGATTAATACCGCATAA（SEQ ID No.3）；

Clost-R：TTCTTCCTAATCTCTACGCA（SEQ ID No.4）。

芽孢杆菌特异性引物序列（5′→3′）：

Bacil-F：ATGGCTGTCGTCAGCT（SEQ ID No.5）；

Bacil-R：ACGGGCGGTGTGTAC（SEQ ID No.6）。

上述引物中的R为A或G。

具体的，步骤a中的操作如下：从酒醅微生物群落中提取分离纯化得到的1株梭菌 （Clostridium butyricum）、1株乳酸菌（Lactobacillus crustorum）、1株芽孢杆菌（Bacillus  amyloliquefaciens）的基因组，然后分别利用特异性引物进行PCR得到特异性目的片段，再 将目的片段与TA克隆载体连接，获得重组质粒，再将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞， 挑选阳性克隆转化子，提取得到高浓度质粒，然将此高浓度质粒做10倍比稀释，作为荧光 定量PCR的标准样品，从而进行荧光定量PCR获得标准曲线。

具体的，步骤a和c中扩增梭菌特异性片段的PCR反应程序为：95℃预变性4min后， 进入30个循环，95℃1min；57℃1min；72℃1min，最后72℃延伸10min；扩增乳酸 菌、芽孢杆菌特异性片段的PCR反应程序为：95℃预变性4min后，进入30个循环， 95℃1min；55℃1min；72℃1min，最后72℃延伸10min。

具体的，步骤b中利用洗脱、酶消化结合的方法提取酒醅微生物群落的总DNA的具体 步骤如下：称取1g酒醅样品于50mL离心管，向离心管加入5mL PBS缓冲液pH7.64和8～9 颗灭菌玻璃珠，漩涡震荡5min，200×g离心5min，在冰上吸取上清液；在沉淀中加入5mL PBS缓冲液重复洗涤两次，合并三次上清液，12000rpm离心5min，取沉淀；加入1mL CTAB 抽提液（2%CTAB、5mol/L NaCl、1mol/L pH8.0的Tris-HCl、0.5mol/L EDTA）和20μL巯 基乙醇至离心管中，65℃恒温混匀仪振荡30min，加入5μL20mg/mL蛋白酶k，37℃220r/min 30min，室温6000×g离心10min，收集1mL上清；加入等体积Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇， 抽提一次，12000rpm离心10min，取上清加入等体积氯仿-异戊醇12000rpm离心10min， 取上清，重复两次；上清液加入0.6倍体积预冷的异丙醇，-20℃沉淀1h，12000rpm离心 10min，倒掉液体；沉淀用70%乙醇洗涤，12000r/min离心10min；洗涤后的DNA吹干后 TE溶解，-20℃冰箱保存备用；其中所述的CTAB抽提液配方为2%CTAB、5mol/L NaCl、 1mol/L pH8.0的Tris-HCl、0.5mol/L EDTA；Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇的体积比25︰24︰1； 氯仿-异戊醇的体积比24︰1。

附图说明

图1酒醅样品中乳酸菌的拷贝数在白酒发酵过程中的动态变化曲线

图2酒醅样品中梭菌的拷贝数在白酒发酵过程中的动态变化曲线

图3酒醅样品中芽孢杆菌的拷贝数在白酒发酵过程中的动态变化曲线

图1～3中横轴天数表示酒醅发酵天数

具体实施方式

在本发明中，荧光定量PCR采用Bio-Rad专用定量PCR试剂SsoFast EvaGreen预混 液，该预混液使用专利的Sso7d融合蛋白技术，在广泛的定量PCR应用中有卓越的表现。 通过新型的热启动工程融合聚合酶结合优化的缓冲液和ROX惰性参照染料，在短时间内可 以获得重复性更好，灵敏度更高的定量PCR结果。饱和的荧光染料EvaGreen能有效增强 其与双链DNA结合的强度和反应灵敏度，确保了最好的扩增效率，灵敏性和重复性，同时 荧光强度相较于SYBR Green更高。

实施例1标准曲线的制备

1、合成针对于乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌的特异性引物，并对筛选的乳酸菌、梭菌、芽 孢杆菌进行特异性扩增

乳酸菌特异性引物序列（5′→3′）：

Lacto-F：AGAACACCAGTGGCGAAGG

Lacto-R：CAGGCGGAGTGCTTAATGC

梭菌特异性引物序列（5′→3′）：

Clost-F：AAAGGRAGATTAATACCGCATAA

Clost-R：TTCTTCCTAATCTCTACGCA

芽孢杆菌特异性引物序列（5′→3′）：

Bacil-F：ATGGCTGTCGTCAGCT

Bacil-R：ACGGGCGGTGTGTAC

上述引物中的R为A或G。

扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，乳酸菌目的片段大小为170bp、梭菌的目的片 段大约为540bp、芽孢杆菌的目的片段大约为300bp，并将PCR产物割胶回收。

2、酒醅中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌的筛选及标准菌株的确定

乳酸菌的筛选：

乳酸菌筛选培养基：葡萄糖2%w/w，蛋白胨1%w/w，牛肉膏1%w/w，酵母提取物 0.5%w/w，K₂HPO₄0.2%w/w柠檬酸三铵0.2%w/w，乙酸钠0.5%w/w，吐温800.1%v/v， MgSO₄·7H₂O0.05%w/w，MnSO₄·4H₂O0.025%w/w，pH6.2～6.4，琼脂1.5%w/w，121 ℃，20min灭菌后，加入灭菌的CaCO₃溶液2%v/v。

取1g酒醅样品梯度稀释至10^-6，稀释涂布，37℃培养48h，挑选产生溶钙圈的菌落， 多次分离纯化，镜检得到纯种，16S rDNA鉴定，-20℃甘油管保存。

梭菌的筛选：

梭菌筛选培养基：硫酸铵0.05%w/w，乙酸钠0.5%w/w，磷酸氢二钾0.04%w/w，硫酸 镁0.02%w/w，酵母膏0.1%w/w，琼脂1.5%w/w，121℃，30min灭菌，乙醇2%（v/v）， 加入灭菌的CaCO₃溶液2%v/v，乙醇，碳酸钙均在灭菌后，冷却至70℃左右加入。

取1g酒醅样品制成菌悬液，80℃水浴10min，梯度稀释至10^-3，稀释涂布，37℃厌氧 培养72h，挑选产生溶钙圈的菌落，多次分离纯化，镜检得到纯种，16S rDNA鉴定，-20 ℃甘油管保存。

芽孢杆菌的筛选：

芽孢杆菌筛选培养基：胰蛋白胨1%w/w，酵母提取物0.5%w/w，氯化钠1%w/w，琼脂 1.5%w/w，pH7.2～7.4，121℃，20min灭菌。

取1g酒醅样品制成菌悬液，80℃水浴10min，梯度稀释至10^-5，稀释涂布，37℃培养 48h，挑选生长菌落，多次分离纯化，镜检得到纯种，16S rDNA鉴定，-20℃甘油管保存。

选取筛选的1株乳酸菌（Lactobacillus crustorum）、1株梭菌（Clostridium butyricum）、 1株芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）作为标准菌株。

3、得到特异性扩增目的片段

分别以3株纯菌的DNA为模板，以Lacto-F/Lacto-R、Clost-F/Clost-R、Bacil-F/Bacil-R 为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系：总体积25μL，体系包括2.5μL10×Buffer（含有 Mg²⁺），2μL25mmol/L dNTP混合物，0.2μL1U Taq DNA聚合酶，1μL10μmol/L引物（正 向、反向），DNA模板用量为1μL，用ddH₂O补足至25μL。

PCR反应程序为（梭菌）：95℃预变性4min后，进入30个循环，95℃1min；57 ℃1min；72℃1min，最后72℃延伸10min。

PCR反应程序为（乳酸菌、芽孢杆菌）：95℃预变性4min后，进入30个循环，95 ℃1min；55℃1min；72℃1min，最后72℃延伸10min。

扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，乳酸菌目的片段大约为170bp、梭菌的目的片 段大约为540bp，芽孢杆菌的目的片段大约为300bp，并将PCR产物割胶回收。

4、大肠杆菌JM109感受态细胞的制备

挑取JM109平板上单菌落至5mL LB培养基中，37℃、220rpm培养过夜；将过夜培 养的种子液以2%的接种量转接入15mL LB培养基中，37℃、220rpm培养1.5h左右至 OD600为0.3～0.5之间；分装1mL菌液至1.5mL离心管中，冰浴20min后迅速离心，4℃、 5000rpm离心10min；彻底弃去上清，加入400μL0.1mol/L预冷的CaCl₂溶液重悬菌体， 再冰浴30min；4℃、5000rpm离心10min，弃去上清液，倒置1min；用80μL0.1mol/L 预冷的CaCl₂溶液重悬菌体，冰上放置30min。

5、重组质粒的构建

将pMD19-T Vector和目的片段以1︰3比例连接，16℃连接过夜，然后将连接产物转 化JM109感受态大肠杆菌细胞，然后将已转化的感受态大肠杆菌细胞涂布于含有氨卞青霉 素（100μg/mL）的LB平板上，37℃培养12～16h，挑取阳性菌落，于含有氨苄青霉素（100 μg/mL）的液体LB培养基中震荡培养，37℃，8-10h。用培养的菌液提取质粒，在此利用 设计的引物进行质粒扩增验证，如果琼脂糖凝胶在170bp、540bp、300bp左右有可见的目 的条带，可以确定目的片段已成功插入pMD19-T Vector，将其提取的质粒做10倍比稀释， 测定OD值。在本发明中，“标准样品”是指已知拷贝数的重组质粒DNA，用Nanodrop2000 核酸测定仪测定其OD值，当OD值在0.3左右时，测得的结果较为可信，每管测定3次， 取平均值，计算重组质粒的拷贝数，具体计算公式如下：

其中：C_标–DNA模板浓度(拷贝/μL)

A–0.05，换算系数，即1OD260nm=0.05μg/(μL双链DNA)N–稀释倍数

6.02×10²³–阿佛加德罗常数

6、荧光定量PCR

在本发明中采用外参照物作定量PCR，以已知浓度的目的基因为模板，按照一定的倍 比稀释，然后做出标准曲线图，未知的样本按照标准曲线找出对应的拷贝数。

在本发明中，荧光阈值通常以10～15个循环的荧光值作为阈值，CT值是指扩增产物 的荧光信号达到设定的阈值时经过的循环次数。

荧光定量PCR反应体系与反应条件如表1、表2和表3所示：

表1反应体系

SsoFast EvaGreen预混液 10μL 正向引物 1μL 反向引物 1μL 模板DNA 10ng ddH2O 至20μL

表2梭菌荧光定量PCR的反应条件

95℃ 预变性30s 95℃ 变性5s 57℃ 退火15s

57℃读取荧光信号数据，共循环扩增40次。

表3乳酸菌、芽孢杆菌荧光定量PCR的反应条件

95℃ 预变性30s 95℃ 变性5s 55℃ 退火15s

55℃读取荧光信号数据，共循环扩增40次。

熔解曲线绘制，从65℃升温至95℃，每隔0.5℃读一次板，维持0.05s。

乳酸菌Real-time PCR熔解曲线，在84℃左右出现单一的熔解峰，无引物二聚体及非特 异性产物，曲线平稳，峰尖且窄，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好， 以此为基础进行定量是可靠的。对于乳酸菌的荧光定量PCR方法，检测拷贝数在2.44×10⁵～ 2.44×10¹²copies/μL范围时，乳酸菌Real-time PCR的扩增曲线为一组典型的倒S曲线，扩 增曲线基线平整，指数区较明显且陡度大，平台区能够汇于一起，线性范围比较宽。质粒 标准品的浓度越高，循环阈值CT越低。该标准曲线的线性方程是y=-0.3411x+14.07,线性 相关系数为0.9978，具有较好的线性关系，根据公式E=10^-k-1(k-标准曲线的斜率)，算得 Real-time PCR的扩增效率为1.19，在0.8～1.2之间，扩增效率理想。

梭菌Real-time PCR熔解曲线，在87.5℃左右出现单一的熔解峰，无引物二聚体及非特 异性产物，曲线平稳，峰尖且窄，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好， 以此为基础进行定量是可靠的。对于梭菌的荧光定量PCR方法，检测拷贝数在3.01×10⁴～ 3.01×10¹¹copies/μL范围时，梭菌Real-time PCR的扩增曲线为一组典型的倒S曲线，该组扩 增曲线基线平整，指数区较明显且陡度大，平台区基本能够汇于一起，线性范围也很宽。 质粒标准品的浓度越高，循环阈值CT越低。该标准曲线的线性方程是y=-0.3303x+13.137, 线性相关系数为0.9978，具有较好的线性关系，根据公式E=10^-k-1(k-标准曲线的斜率)，算 得Real-time PCR的扩增效率为1.14，在0.8～1.2之间，扩增效率理想。

芽孢杆菌Real-time PCR熔解曲线，在88℃左右出现单一的熔解峰，无引物二聚体及非 特异性产物，曲线平稳，峰尖且窄，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好， 以此为基础进行定量是可靠的。对于芽孢杆菌的荧光定量PCR方法，检测拷贝数在 2.18×10⁴～2.18×10¹¹copies/μL范围时，芽孢杆菌Real-time PCR的扩增曲线为一组典型的倒 S曲线，该组扩增曲线基线平整，指数区较明显且陡度大，平台区基本能够汇于一起，线性 范围也很宽。质粒标准品的浓度越高，循环阈值CT越低。该标准曲线的线性方程是 y=-0.3387x+13.152,线性相关系数为0.9974，具有较好的线性关系，根据公式E=10^-k-1(k-标 准曲线的斜率)，算得Real-time PCR的扩增效率为1.18，在0.8～1.2之间，扩增效率理想。

实施例2标准样品的制备

1、酒醅样品的采集

采集酒醅样品，样品采集后如不能及时提取DNA应立即放入-80℃冰箱保存。

2、酒醅中微生物总DNA提取方法

称取1g酒醅样品于50mL离心管，向离心管加入5mL PBS缓冲液pH7.64和8～9颗灭 菌玻璃珠,漩涡震荡5min，200×g离心5min，吸取上清液。在沉淀中加入5mL PBS缓冲液 重复洗涤两次，合并三次上清液（在冰上操作），12000rpm离心5min，取沉淀。加入1mL CTAB 抽提液（2%CTAB、5mol/L NaCl、1mol/LTris-HCl(pH8.0)、0.5mol/L EDTA）和20μL巯基 乙醇至离心管中，65℃恒温混匀仪振荡30min，加入5μL蛋白酶k（20mg/mL），37℃220r/min 30min，室温6000×g离心10min，收集上清（1mL）。

加入等体积Tris-饱和酚（500μL）与氯仿-异戊醇（体积比24︰1）（500μL），抽提一次， 12000rpm离心10min，取上清加入等体积氯仿-异戊醇（24︰1）12000rpm离心10min，取 上清，重复两次。上清液加入0.6体积预冷的异丙醇-20℃沉淀1h，12000rpm离心10min， 小心倒掉液体。沉淀用70%乙醇洗涤数次，12000r/min10min。洗涤后的DNA用吹风吹干 后TE溶解，用1.5%琼脂糖凝胶电泳验证DNA提取的效果，如果在10kb左右出现条带， 则DNA提取成功，将成功提取的DNA溶液置于-20℃冰箱保存备用。

实施例3酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌的定量分析

酒醅样品中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌的定量：使用实施例2中获得的酒醅总DNA，使 用实施例1中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌的特异性引物。按照实施例1中的荧光定量PCR反 应体系和PCR程序进行大曲荧光定量PCR分析。

酒醅样品中乳酸菌的定量：根据由乳酸菌标准样品荧光定量PCR得到的线性方程y= -0.3411x+14.07(R²=0.9978)计算不同时间点酒醅样品中乳酸菌的拷贝数，从而能够得到白 酒发酵过程中乳酸菌生物量的变化趋势(如图1所示)。

酒醅样品中梭菌的定量：根据由梭菌标准样品荧光定量PCR得到的线性方程 y=-0.3303x+13.137(R²=0.9978)计算不同时间点酒醅样品中梭菌的拷贝数，从而能够得到白 酒发酵过程中梭菌生物量的变化趋势(如图2所示)。

酒醅样品中芽孢杆菌的定量：根据由芽孢杆菌标准样品荧光定量PCR得到的线性方程 y=-0.3387x+13.152(R²=0.9974)计算不同时间点酒醅样品中芽孢杆菌的拷贝数，从而能够得 到白酒发酵过程中芽孢杆菌生物量的变化趋势(如图3所示)。