一种沙门氏菌CRISPR分型方法

摘要

本发明提供了一种沙门氏菌的CRISPR分型方法，通过对沙门氏菌的CRISPR1位点和CRISPR2位点之间最新间隔序列的DNA测序，以确定待检测菌株的CRISPR型别，进而可以进行血清型别的预测。所述方法简单，快速，费用低，分辨率高，与沙门氏菌血清分型结果一致性高，对实验室设备及软件要求低，且新的CRISPR型别包含有细菌进化及地域等诸多信息，并可联合荧光探针等方法实现实时快速检测，具有推广应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种沙门氏菌分子分型方法，属于分子流行病学领域。

背景技术

沙门氏菌是一类危害人和动物健康的重要致病菌，其菌属型别繁多， 抗原复杂，因此对沙门氏菌的防治造成了极大的困难。沙门氏菌的分子 分型能对其进行准确的诊断和溯源，在分子流行病学方面，这种便捷高 效且高分辨率的分型方法对大规模的流行病检测和沙门氏菌的进化具有 极其重要的意义；在临床治疗方面，由于沙门氏菌会在耐药和毒力方面 具有型别特异性，因此对其准确的分型能在很大程度上对病情的发生发 展和转归有一个提前的预见作用，且在临床治疗和用药上也能提供一个 可靠的依据。

此外，对于沙门氏菌的爆发监测是疾病预防控制机构的重要任务之 一，但目前的疾病控制机构存在数量不足及高端分型设备不足等诸多问 题。这种新型的分型方法由于原理简单、操作容易、成本低廉且对实验 室的设备及技术人员的要求不高，因此能在更广泛的范围内进行疾病的 监测和预警，对我国的疾控事业将会起到一个有利的促进作用。

沙门氏菌菌属型别繁多，抗原复杂，目前已明确的血清型达2500 多种，是引起食源性腹泻的重要病原菌之一；多为点序列分型(Multilocus  Sequencing Typing，MLST)技术分辨率高、重复性好，但有时不稳定；脉 冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)是细菌分型的金 标准，其技术分辨率高，但比较费时，且对仪器设备要求高，在图像处 理时主观造成的偏差较难克服。

成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularlay interspaced  short palindromic repeats，CRISPR)是近年来发现的细菌针对噬菌体等外 源DNA的获得性免疫系统。CRISPR系统主要由CRISPR簇，前导序列 (leader)和CRISPR相关蛋白基因(CRISPR-associated，cas)基因共同 组成。CRISPR簇又由一段不连续的同向重复序列(direct repeat，DR) 和插入其中的间隔序列(spacer)组成。DR序列在一个CRISPR簇中的 大小和序列几乎相同，其在沙门氏菌中的长度基本为29bp。不同CRISPR 系统中间隔序列(spacer)的长度为17-84bp，而沙门氏菌中基本为32bp。 研究表明，CRISPR的作用原理为：在噬菌体入侵宿主细胞后，CRISPR 系统会从外来的噬菌体序列中选取一段序列加工成新的重复序列与间隔 序列(repeat-spacer，R-S序列)后重组到CRISPR簇内，使得宿主获得 抵抗相应噬菌体再次入侵的能力。这使得CRISPR系统具有了极其丰富 的序列多态性。重要的是，这种CRISPR系统能作为一种记录细菌与噬 菌体相互斗争的编年史被稳定的遗传下来，这不仅能在细菌的分子分型 上开辟一个新的领域，还能为我们更好的研究细菌的进化和迁徙史提供 一条重要的线索。

目前国内外已有利用CRISPR进行细菌分型的相关研究，但由于现 存的CRISPR分型方法依据的是对全部CRISPR位点中所有的间隔序列 (spacer)进行测序分析后实现的，虽说分辨率极高，但这种分型方法费 时费力且建立相关数据库需要的信息量巨大。

研究发现，间隔序列在细菌进化过程中存在插入和选择剔除的现 象，使得CRISPR结构具有多态性，并且在同一物种的不同菌株间存在 一定的差异。因此，CRISPR结构可以作为细菌分型溯源与进化研究的理 想位点。目前关于沙门氏菌的CRISPR分型方法国外有4篇有文献报道 (1.Liu，et al.Appl Environ Microbiol77：4520-4526；2.Liu，F et al.Appl  Environ Microbiol77：1946-1956.3.Fabre，et al.PLoS One7：e36995. 4.Shariat，N.，et al..BMC Microbiol 13：254.)，但由于其分析对象为沙门氏 菌两个CRISPR位点的全部间隔序列(spacer)，甚至有些为了提高其分 辨率，联合两个沙门氏菌毒力基因sseL和fimH，建立了CRISPR-MLVA 的多位点分型系统。但以上关于沙门氏菌的CRISPR分型方法仍具有诸 多不足，比如分析的spacer数量繁多，且每个CRISPR结构的spacer数 量不等，这都不便于实验室快速的分子分型，具有耗时，不经济等缺点。

沙门氏菌病是感染性腹泻的主要病原菌之一。世界卫生组织证实沙 门氏菌病是当前重新出现的最重要的传染性疾病之一。近年来，病原微 生物的分子分型技术发展较快，如限制性片段长度多态性(RFLP)、扩 增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD-PCR)、重复 性核酸扩增(Rep-PCR)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分析 (MLST)、多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)等，其中一些 成熟的高通量且便于推广应用的分子分型技术，如PFGE、MLST、MLVA 已经应用于传染病爆发流行监测，并在传染源的追溯、传播链的确认、 新的流行菌株的发现、遗传变异、系统发生分析甚至于疫情的预警预报 等方面发挥了重要作用。以上各种分型方法都有利有弊，RFLP方法重复 性好、操作简便，但分辨率有限；AFLP方法分辨率高、重复性好，但技 术难度也很高；RAPD-PCR和Rep-PCR分辨率高，但重复性差；PFGE 技术分辨率高、重复性好，被誉为病原微生物分子分型的“金标准”，但 其对专业设备和软件要求高，不适合基层疾控单位和设施较简单的实验 室开展，而且通过分析电泳图像带有一定的主观性，加之不可避免的手 动调图也使得该方法不能很好地进行高通量分析诠释及数据交换。

发明内容

本发明旨在建立一种十分简便的沙门氏菌的CRISPR分型方法。所 述方法包括以下步骤：

(1)提取待检测菌株培养物的DNA；

(2)分别取适量的步骤(1)DNA提取物，进行CRISPR1位点和 CRISPR2位点的PCR扩增，其中CRISPR1位点扩增的上游引物为SEQ  ID NO：1，下游引物选自SEQ ID NO：2-7中的一种；CRISPR2位点扩增 的上游引物为SEQ ID NO：8，下游引物选自SEQ ID NO：9或SEQ ID  NO：10；

(3)分别对步骤(2)所述CRISPR1位点的扩增产物和所述CRISPR2 位点的扩增产物的扩增产物进行DNA测序；

(4)确定CRISPR1位点序列和CRISPR2位点序列中的最新间隔序 列，根据二者的间隔序列组合确定所述沙门氏菌的CRISPR型别。

在本发明的一个优选技术方案中，步骤(2)所述的CRISPR1位点扩 增用的下游引物为SEQ ID NO：2。

在本发明的另一个优选技术方案中，步骤(2)所述的CRISPR2位点 扩增用的下游引物为SEQ ID NO：9。

在本发明的一个优选技术方案中，步骤(3)所述的DNA测序为反 向引物测序，所用引物为步骤(2)所述PCR扩增的下游引物。

在本发明的一个优选技术方案中，步骤(4)所述的最新间隔序列分 别为CRISPR1位点和CRISPR2位点的最后两个重复序列之间的序列。

如图1所示，所述最新间隔序列(new spacer)为CRISPR位点最靠 近前导序列(leader)的间隔序列，可运用CRISPRdb网站中的 CRISPRfinder功能进行CRISPR结构的整理 (http://crispr.u-psud.fr/crispr/)，也可直接通过序列分析软件DNAstar将最 靠近下游引物的一个间隔序列直接找出。

优选地，所述的最后两个重复序列由SEQ ID NO：11所示。，通常 CRISPR的第一个重复序列为SEQ ID NO：12所示，其余重复序列为SEQ  ID NO：11所示，而最后两个重复序列之间的间隔序列即为最新的间隔序 列(有关重复序列的类型可见巴斯德数据库 http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/crispr/CRISPRDB.html)。

可将找出的CRISPR1位点和CRISPR2位点中的最新间隔序列在间隔 序列代码表(来自巴斯德数据库 http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/crispr/CRISPRDB.html)中转 化为spacer代码。随后将两个间隔序列代码按照CRISPR1在前，CRISPR2 在后的顺序组成一个间隔序列组合，并以此代表改型沙门菌的CRISPR 型别。

本发明方法还可以包括步骤(5)，即，通过待检测菌株的CRISPR 型别确定所述菌株的血清型(CRISPR型别-血清型预测表可见表1)，实 现对其血清型的预测。

本发明方法省时，经济，分辨率高，易于操作，且与沙门氏菌血清 分型一致度高，对实验室设备及软件要求低，可联合荧光探针等实现实 时快速的检测，且能通过最新间隔序列的报告探针实现现场快速检测等 优点。在分辨率方面较依靠七个管家基因的多位点序列分型(multilocus  sequence typing，MLST)略高，但花费却仅有传统MLST的四分之一(仅 需两个短序列的测序)。

对于沙门氏菌的爆发监测是疾病预防控制机构的重要任务之一，但 目前的疾病控制机构存在数量不足及高端分型设备不足等诸多问题。这 种新型的分型方法由于原理简单、操作容易、成本低廉且对实验室的设 备及技术人员的要求不高，因此能在更广泛的范围内进行疾病的监测和 预警，对我国的疾控事业将会起到一个有利的促进作用。

附图说明

图1.沙门氏菌的CRISPR分型示意图；

图2.沙门氏菌CRISPR的PCR扩增电泳图谱；

图3.沙门氏菌血清型分型和CRISPR分型的一致性分析图；

图4A.沙门氏菌PFGE图谱；

图4B.沙门氏菌PFGE图谱；

图5A.MLST分型分辨率示意图；

图5B.CRISPR分型分辨率示意图；

图5C.PFGE分型分辨率示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将 会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明权 利要求所定义的保护范围构成任何限制。

实施例1：82株沙门氏菌的分子分型及血清型预测

1.菌株：

此次试验选取的菌株为我中心保存的来自我国多个地区82株沙门 氏菌，已完成传统血清学鉴定，确定为沙门氏菌，并分属21种血清型(82 株菌传统血清学分型结果见表2)。

2.引物合成：选用引物表中扩增范围最广的两对引物A1，A2和B1，B2

A1(5′-GTRGTRCGGATAATGCTGCC-3′)

A2(5′-CGTATTCCGGTAGATBTDGATGG-3′)

B1(5′-GAGCAATACYYTRATCGTTAACGCC-3′)

B2(5′-GTTGCDATAKGTYGRTRGRATGTRG-3′)

由上海生工公司合成(Sangon Biotech)

3.细菌基因组DNA提取：

细菌基因组DNA的抽提使用天根公司(Tiangen Biotech)的细菌DNA 提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)，按说明书操作。提取的DNA 于-20℃保存。

4.PCR扩增CRISPR位点：

PCR反应体系：

PCR反应条件：

反应结束后，取5ulPCR反应产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳， 在凝胶成像系统上观察结果。图2为扩增出的沙门氏菌CRISPR位点电 泳图，Marker为DL2000，由图可见，不同菌株中的CRISPR位点序列长 短不一，短的不到200bp，长的则长达3000bp以上。

5.PCR扩增产物测序(由上海生工完成)，测序仪为ABI3730XL apparatus

6.CRISPR分型：将每个菌两个CRISPR位点测序结果的最后一个间隔序 列挑出组成序列对，一组序列对对应一种血清型。

可用DNAstar等分子生物学领域DNA常规分析软件选出最后出现的 两个重复序列GTGTTTATCCCCGCTGACGCGGGGAACAC之间的序 列，也可用CRISPR finder功能直接找出相应的new spacer (http://crispr.u-psud.fr/Server/)。并将找出的new spacer通过代码对照表 转化为代码并得出CRISPR型别，同时可预测出血清型型别。表1是发 明人总结出的CRISPR型别与血清型型别的对应关系，以及两者的一致 性概率。

表1.CRISPR型别-血清型预测表

82株沙门氏菌的分型结果如表2所示：

表2.82株沙门氏菌CRISPR分型结果(血清型为通过传统血清学 分型得出的结果)

注：带有*的为代码表中未收录的序列，其具体序列为：Ab14* cacatgtcagatgttatttccaaggcggagc；Heid14*

7.与血清学分型结果一致性评价：

以上82株沙门氏菌所测得CRISPR型别与其通过传统血清学分型方 法分出的血清型对应关系的一致率为100％。甚至在同一种血清型中还分 出了不同的亚型，其分型效率更高。

图3为以上82株沙门氏菌通过CRISPR预测得到的血清型结果与通 过传统方法得到血清型结果之间的线性关系，图中的点代表不同血清型 的个数，由图3可见，通过两种方法得到的血清型结果在种类和数量上 完全一致，呈现标准的斜率为1的线性关系。

实施例2CRISPR分型方法、MLST和PFGE的分辨率比较：

我们同时又采用了两种分子分型方法对以上82株菌进行分型，其中 多位点序列分型(MLST)为较普遍应用较广的一种分子分型方法，而脉 冲场凝胶电泳(PFGE)属于目前细菌分子分型金标准。

1.沙门氏菌MLST分型：

主要选取了沙门氏菌七个管家基因进行扩增测序，将所测得序列信 息上传至专门的网站(http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Senterica)获取相应的 MLST型别，具体试验操作方法见MLST网站 (http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Senterica/documents/primersEnterica_html)

PCR条件：

表3.MLST分型结果：

2.脉冲场凝胶电泳PFGE

用TaKaRa公司的限制性内切酶XbaI在37℃酶切3h。将DNA酶切 样本加在PFGE用凝胶SeaKem Gold Agarose(Lonza，Rockland，ME，USA) 上，在PFGE电泳仪上电泳19h。参照株为布伦登芦普沙门氏菌H9812。 所得图像用软件BioNumerics version6.0(Applied Maths，Austin，TX，USA) 进行分析。采用非加权配对算术平均法，1.5％的容忍限度。PFGE结果： 由图4A和4B可见，通过PFGE，分属于21种血清型的82株沙门氏菌 被分出了43种不同的PFGE型别，且与血清型之间对应也较为准确。

3.三种分型方法比较如表4所示：

表4.MLST、PFGE和CRISPR分型结果比较表

三种分型方法的分辨率分别为：

多位点序列分型MLST：DI＝0.8088

CRISPR分型方法：DI＝0.8145

脉冲场凝胶电泳PFGE：DI＝0.9455。

图5是展现了三种不同分型方法分型结果，其中标出的是数量较多 的MLST型别(ST型)在不同分型方法中被分辨出的情况，由图5可见， 整体分型效果最好分辨率最高的为PFGE，CRISPR分型方法虽较PFGE 分辨率较差，但其分辨率及整体分型效果略高于MLST。括弧内的数字 代表82株沙门氏菌被分出的型别的个数。

可见分辨率比较结果：多位点序列分型MLST＜CRISPR分型方法 ＜脉冲场凝胶电泳PFGE。

4.平均分型耗费比较：

CRISPR分型耗费：每株约35RMB

传统血清学分型耗费：每株约200～600RMB

多位点序列分型MLST耗费：每株约180RMB

综上，本发明公开的CRISPR分型方法具有以下优势：

1.操作简单方便，对设备要求低；

2.平均分型成本低廉；

3.与血清学分型方法相比有着极高的一致性；

4.与MLST、PFGE和传统CRISPR分型方法相比有十分可观的高分辨 率；

5.由于CRISPR特殊的记录功能，使得该分型方法具有包含有细菌进 化及地域等诸多信息的优势。

基于上述的优势，该分型方法可在未能配备复杂昂贵分型设备的实 验室及基层疾控单位实施，具有推广及应用价值。