基于CRISPR序列的沙门氏菌分子分型方法的建立

摘要

沙门氏菌（Salmonella）是引发食物中毒的主要食源性致病菌之一，其中肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）是全球范围内最重要的沙门氏菌血清型之一。开展沙门氏菌分子分型工作，能够揭示菌株的来源、变异和进化规律，为沙门氏菌危害溯源、风险评估和危害控制提供数据支撑，对追踪和监测致病菌的传播和疫情暴发具有重要意义。
　　本研究以规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)为基础，研究了CRISPR的结构和功能及不同血清型CRISPR间隔序列差异，并基于快速、有效、成本低、简单化的原则，提出了两种新型的CRISPR分型方法即 CSST（CRISPR initial three Spacers Sequence Typing）和TCSST（Target and CRISPR initial three Spacers Sequence Typing），将这两种分型方法应用于沙门氏菌分子分型实践中，对其进行应用评估。
　　本研究首先根据 CRISPR1及 CRISPR2上下游保守序列分别设计了扩增不同沙门氏菌血清型的CRISPR1引物及 CRISPR2引物，至少可以应用于30种沙门氏菌血清型的分子分型，并绘制了这30种CRISPR1与CRISPR2间隔序列图谱。另外，从S9、S45、S69、S87、S95、S121、S165和S200等8个沙门氏菌属特异性靶点中筛选出了聚类分型效果最佳的S69，在有需要进一步提高分辨力时纳入CSST分型体系中，构建TCSST分子分型方法，作为对CSST分型缺陷的有力补充。
　　随后，利用传统CRISPR分型、S69分型、CSST及TCSST等四种分型方法分别对30种沙门氏菌血清型共86株菌进行分型探究，区分度（辛普森指数，D值）分别为0.9692、0.8902、0.9199和0.9423，说明四种方法对不同血清型沙门氏菌都具有良好的分辨力，其中以传统 CRISPR分型最佳，TCSST次之。CSST分型至少可以将21种血清型分开，优于S69分型，在将更多的血清型分开的同时对同种血清型的菌株也有一定的分辨力，如把伤寒沙门氏菌分成两支，把鼠伤寒沙门氏菌分成3个分支，而且 CSST只需要分析 CRISPR1/CRISPR2的三个间隔序列，比传统的CRISPR分型更加简便，测序成本低，只需要上游序列即可，因此CSST可用于对不同沙门氏菌血清型的快速、有效的甄别。
　　此外，本研究将毒力基因分型、ERIC-PCR分型、传统CRISPR分型、CLSPT分型、CSST分型和TCSST分型等六种方法同时应用于2008-2012年90株不同来源的肠炎沙门氏菌分离株的分型，分别可以得到7、1、6、1、4和12个基因型，D值分别为0.4092、0、0.1293、0、0.0871和0.7506，以TCSST法的分型效果最佳，将菌株数量增加到198株时，可分31个TCSST型，区分值为0.6555，对肠炎沙门氏菌仍有一定应用分型价值。而且，TCSST型与菌株的来源及年份有一定的相关性，同时探讨了TCSST型与毒力基因的关系。另外，肠炎沙门氏菌分离株数目增加到198株时，可分为31个TCSST，区分度为0.6555，TCSST对肠炎沙门氏菌仍有一定的分辨力。
　　综上，本研究 CSST分型方法在不同沙门氏菌血清型菌株分型应用中具有较高的应用价值，只需要分析部分间隔序列，因此具有操作简便、成本低等优点，同时纳入特异性靶点S69后建立的TCSST分型方法，对同一血清型如肠炎沙门氏菌分离株的分型也有很好的应用前景。

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第一章 绪 论

1.1 沙门氏菌

1.2 沙门氏菌分型

1.3 CRISPR分型方法研究新进展

1.4 研究目的及意义

第二章 沙门氏菌新型CRISPR分型方法的建立

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 小结

第三章 新型CRISPR分型方法应用不同血清型沙门氏菌分型

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 小结

第四章 新型CRISPR分型方法应用于肠炎沙门氏菌分型

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 小结

第五章 总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

参考文献

附录1

致谢

攻读学位期间已发表和准备中的学术论文