抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA及其表达载体和应用

摘要

本发明公开了一种抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因表达的siRNA及其表达载体和应用，属于生物工程技术。本发明是将STAT3-siRNA导入恶性脑胶质瘤细胞后，靶向作用于STAT3基因的mRNA，阻断其翻译过程，有效地沉默STAT3基因，有效抑制人恶性脑胶质瘤靶向STAT3的基因表达，能有效抑制恶性脑胶质瘤细胞的增殖活性，诱导细胞凋亡，从而抑制恶性脑胶质瘤细胞的生长，用于制备高效、快速、特异性强的抗恶性脑胶质瘤治疗药物。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术，特别是一种抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA及其表达载体和应用。 

背景技术

STAT3是IL-6/JAK-STATs转导通路的重要成员，分子量89KD左右，最初发现并认识STAT3是从研究细胞因子IL-6介导的急性期反应时开始，它是一种转录因子，促进众多基因的转录。后来随着研究的深入，发现STAT3不仅参与细胞因子介导的急性期反应，而且在人类的多种恶性肿瘤中STAT3是异常活化的，调控肿瘤细胞的生物学行为，其中包括恶性脑胶质细胞瘤。 

近年的研究发现，一些小的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）可以高效、特异地促使体内特定基因mRNA降解，诱使细胞出现特定基因缺失的表型，这种技术即RNAi。在RNAi作用的起始阶段中外源性或内源性的双链RNA被Dicer酶切割为19～21bp的小分子干扰RNA片段（small interfering RNAs ，siRNAs）；随后siRNA 与核酶复合物结合后形成RNA诱导沉默复合物（RNA induced silencing complex，RISC）； RISC激活后通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上并切割mRNA，从而部分或完全抑制目的基因的表达。另一方面，细胞在RNA依赖性RNA聚合酶作用下，可以siRNA为引物、以mRNA为模板，合成出mRNA的互补链，从而使mRNA也变成了dsRNA，然后在Dicer酶的作用下再次被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。 

从RNAi的作用机制中可见，这种基因表达调控方法属于转录后的调节并具有明显优势：RNAi基因抑制效果确切，应用微量的siRNA即可使其编码致病基因产物的含量下降90%以上、甚至可以达到基因敲除的效果；其次, RNAi抑制具有严格的序列特异性，治疗的针对性强，因而应用此项技术能够同时抑制同一基因的多个靶点或多个不同基因而不致相互干扰；同时，RNAi的作用具有级联式放大效应和高穿透性更适合恶性肿瘤的实验研究；此外，RNAi序列识别的特异性即或对由野生型点突变形成的癌基因也能够产生准确有效的封闭效果而对野生型基因没有影响。在对多种肿瘤细胞系实验中也证实：肿瘤细胞中均存在着RNAi的机制，化学合成、质粒/病毒或其他方式介导的RNAi可以有效地抑制内源性RNA的表达。 

发明内容

本发明就是为了解决胶质瘤等肿瘤基因治疗问题，以RNA干扰机制为基础，通过人工合成或表达质粒序列转录形成的STAT3小双链RNA(siRNA)可以靶向作用于STAT3基因的mRNA，从而阻断其翻译过程，达到使STAT3基因表达降低的结果，而提供一种抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA及其表达载体和应用。 

本发明是按照以下技术方案实现的。 

一种抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA，该siRNA具有特异性抑制恶性脑胶质瘤细胞增殖的作用，其碱基序列为：5'-TGAAATCATCATGGGCTAT-3'  。                      

所述抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA，其特征在于：该siRNA靶向人的基因序列号为NM_003150的STAT3转录本，作用于该基因序列mRNA的第2169至2188位。

一种抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA慢病毒表达载体，其包含如权利要求1所述的siRNA，具有特异性抑制人STAT3基因表达，特异性抑制人恶性脑胶质瘤细胞增殖的作用。 

所述抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA慢病毒表达载体，该表达载体包含有pGC-LV载体，其DNA序列中病毒表达载体是慢病毒。 

所述抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA在制备抑制人恶性脑胶质瘤治疗药物中的应用。 

所述抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA慢病毒表达载体在制备抑制人恶性脑胶质瘤治疗药物中的应用。 

结果表明：STAT3siRNA可通过慢病毒体介导作用成功转染入胶质瘤细胞内, 转染STAT3siRNA后的细胞代谢受抑制，细胞生长减慢，CCK8吸收值较对照组和空载组明显下降；Western blot结果显示：转染了STAT3siRNA的细胞STAT3的总蛋白和磷酸化蛋白表达均受抑制；流式细胞分析实验表明：STAT3-siRNA在转染96小时后凋亡比例较对照组和空载组明显增多。 

这样，本发明是将STAT3-siRNA导入恶性脑胶质瘤细胞后，靶向作用于STAT3基因的mRNA，阻断其翻译过程，有效地沉默STAT3基因，有效抑制人恶性脑胶质瘤靶向STAT3的基因表达，能有效抑制恶性脑胶质瘤细胞的增殖活性，诱导细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤发生和生长的目的。该siRNA及其慢病毒表达载体可用于制备高效、快速、特异性强的抗肿瘤药物。  

附图说明

图1是U87细胞qRT-PCR法筛选靶点柱状图分析图； 

图2是U251细胞qRT-PCR法筛选靶点柱状图分析图；

图3是Western blot方法验证LV-STAT3siRNA在U87细胞中的敲除效果图；

图4是Western blot方法验证LV-STAT3siRNA在U251细胞中的敲除效果图；

图5是慢病毒重组载体的酶切鉴定图；

图6是PGC-LV载体图谱；

图7是U87细胞转染后96小时绿色荧光蛋白表达情况；

图8是U251细胞转染后96小时绿色荧光蛋白表达情况；

图9是Western blot方法检测转染U87细胞后凋亡蛋白的表达情况；

图10是Western blot方法检测转染U251细胞后凋亡蛋白的表达情况；

图11 是U87细胞转染后各时间点CCK8吸收值；

图12 是U251细胞转染后各时间点CCK8吸收值；

图13是U87对照组转染后流式测定细胞凋亡情况；

图14是U87空载组转染后流式测定细胞凋亡情况；

图15是U87实验组转染后流式测定细胞凋亡情况；

图16是U251对照组转染后流式测定细胞凋亡情况；

图17是U251空载组转染后流式测定细胞凋亡情况；

图18是U251实验组转染后流式测定细胞凋亡情况；

图19是本发明siRNA的碱基序列。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。 

实施例一：干扰人STAT3基因表达的siRNA序列设计和筛选 

1. siRNA序列设计

本发明以RNA干扰技术为基础，利用NCBI Genbank检索基因序列号为NM_003150的STAT3mRNA的全长序列，参照siRNA设计原则，并运用RNA structure软件模拟靶mRNA的二级结构，尽量避免自身结合的茎区，选择配对区域较少的序列，如线区和环区。分别筛选出5条siRNA均为19个核苷酸的序列，并将它们带入BLAST基因组数据库进行比对，排除了和其他编码序列/EST同源。并将其分别命名为STAT3-siRNA-1、STAT3-siRNA-2、STAT3-siRNA-3、STAT3-siRNA-4、 STAT3-siRNA-5（见表1）如图19所示（由上海吉凯公司合成）。

 表1 干扰人STAT3基因表达的siRNA序列 

编号靶向序列信息GC 含量(%)起始位点STAT3-siRNA-1TGAAATCATCATGGGCTAT36.84%2169STAT3-siRNA-2GATCATAAGGTCAGGAGAT42.11%3170STAT3-siRNA-3ACAATCTACGAAGAATCAA31.58%458STAT3-siRNA-4TGACCAACAATCCCAAGAA42.11%1664STAT3-siRNA-5AAAGAATCACATGCCACTT36.84%361

2. 筛选出抑制效果最好的siRNA序列

2.1 材料与方法

2.1.1 转染：利用慢病毒为载体将siRNA转染于U87和U251细胞中。实验分为六组，分别为siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4、siRNA-5，和对照组，慢病毒转染的MOI=5。

2.1.2 采用qRT-PCR方法检测STAT3mRNA表达水平：采用TRIZOL试剂提取细胞总RNA，-80℃保存，备用。细胞转染后96小时，提取总RNA并定量，各实验组取同等量的RNA反转录为cDNA，然后PCR扩增STAT3基因及GAPDH基因，STAT3引物为：上游序列为5'-CCAAGGAGGAGGCATTCG-3'，下游序列为5'-ACATCGGCAGGTCAATGG-3'。GAPDH引物为：上游序列为 5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游序列为5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。PCR反应体系为：（见表2） 

表2 PCR扩增STAT3反应体系

STAT3的扩增条件为预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值；PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s，同时读取吸光值。

2.1.3采用Western blot检测STAT3的蛋白表达：将对数生长期U87和U251细胞，即视野细胞长至80%融合时按2×10⁶个/皿接种于直径10cm的细胞培养皿内，观察细胞融会度为30～40%时进行慢病毒的转染, 将到时间点的细胞提取总蛋白，按照Western blot的步骤检测STAT3, p-STAT3的表达水平。 

3.结果 

3.1 qRT－PCR检测siRNA对STAT3mRNA表达的抑制：由柱状图（见图1、图2）可看出在U87和U251细胞中，相对于NC，KD1对STAT3表达的敲减均达到65%以上为有效靶点，KD1-KD5的靶点序列分别为：TGAAATCATCATGGGCTAT；TGAAATCATCATGGGCTAT；ACAATCTACGAAGAATCAA；TGACCAACAATCCCAAGAA；AAAGAATCACATGCCACTT，统计数据见表3。

 表3 qRT-PCR法内源性筛靶统计数据分析 

3.2 Western blot 检测siRNA对STAT3蛋白表达的抑制情况：检测转染后96小时STAT3在U87和U251细胞中的蛋白表达情况，在U87和U251细胞中，STAT3，p-STAT3（Tyr705，Ser727）蛋白的表达明显下降（见图3、图4）。

实施例二： STAT3siRNA慢病毒表达载体的构建 

1. 干扰克隆制备

（1）制备感受态细胞

①从于37℃培养箱培养16h的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3h（旋转摇床，300转/分）；

②在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃；

③于4℃, 以4000转/分离心10min，回收细胞；

④倒出培养液，将管倒置1min，使最后残留的痕量培养液流尽；

⑤10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份沉淀，放置于冰浴上；

⑥于4℃，以4000转/分离心10min，回收细胞；

⑦倒出培养液，将管倒置1min，使最后残留的痕量培养液流尽；

⑧每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份细胞沉淀；

⑨将细胞分装成小份，放于-70℃冻存。

（2）退火产物连接入线性化干扰载体（见表4） 

表4连接反应体系

试剂阳性对照( μl )自连对照 ( μl )连接组 ( μl )dd H₂O13141310XT4 Buffer22250% PEG4000222酶切载体DNA 100ng/μl111退火的双链DNA 100 ng/μl1-1T4 DNA Ligase111Total202020

说明：阳性对照和自连对照，加入的载体和连接组一致，但阳性对照加入的退火产物为GAPDH基因（带相同粘性末端）。

（3）转化  

①用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加2μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min；

②将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的EP管架上，恰恰放置90s，不要摇动EP管架；

③快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l-2min；

④每管加800μl SOC培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏；

⑤将150μl已转化的感受态细胞转移到Amp抗性（100μg/mL）的LB琼脂培养基上；

⑥将平板置于室温直至液体被吸收；

⑦倒置平皿，于37℃培养16h。

2. 阳性克隆的PCR鉴定 

将上步所构建好的病毒200μl，用病毒DNA提取试剂盒提取病毒DNA将提取的病毒DNA进行多聚酶链反应（PCR）：引物序列分别为：

STAT3上游：5’- GCCCCGGTTAATTTGCATAT -3’

下游：5’- GTAATACGGTTATCCACGCG -3’

反应体系如表5所示，总量为20μl。PCR反应条件：94℃预变性2min、94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、循环30次、终延伸72℃ 6min。1.0%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪摄像，进行图像分析，（如图5、图6所示）。

  

表5慢病毒DNA PCR反应体系

 

试剂体积（μl）ddH₂O12.45×Taq buffer4DNTPs （2.5mM）1.6Primer（+）（10μM）0.4Primer（-）（10μM）0.4Template1Taq polymerase0.2

实施例三：STAT3-siRNA慢病毒表达载体抑制胶质瘤的体外实验研究

将实施例二构建的STAT3-siRNA慢病毒表达载体转染胶质瘤的U87和U251细胞后进行如下实验：

3.1 Western blot检测凋亡蛋白的表达：将对数生长期U87和U251细胞，即视野细胞长至80%融合时按2×10⁶个/皿接种于直径10cm的细胞培养皿内，观察细胞融会度为30～40%时进行慢病毒的转染, 将到时间点的细胞提取总蛋白，按照Western blot的步骤检测凋亡蛋白的表达水平（见图7、8，图9、10）。

3.2 CCK8 法测定细胞增殖活性：选用对数生长期的U87和U251细胞，以5×10⁴/ml的细胞密度接种于96孔板中，实验组、空载组和对照组在接种24h后，转染并继续培养。在培养7d后，进行CCK8检测，酶标仪测定450nm波长下的OD值（见图11、图12）。 

3.3 STAT3-siRNA转染后对细胞凋亡的影响：将对数生长期U87和U251细胞按4×10⁵/ml的量接种于6孔平底细胞培养板，24h后，进行转染，siRNA每种处理重复3次。转染96h后，收集细胞，并按常规处理细胞。加入5ul Annexin V-Alexa Fluor 647和/或5ul PI，混匀，4℃避光孵育15分钟，1小时内用流式细胞仪(BD公司)测定。U87和U251细胞加入LV-STAT3siRNA后，对照组、空载组、LV-STAT3siRNA的凋亡（图中LR+UR象限）比例分别为U87（17.97±0.24%、18.26±0.88%、46.57±1.63%）, U251（15.94±1.18%、16.88±0.17%、39.34±0.87%）。对照组与空载组相比未见显著性差异，与LV-STAT3siRNA组相比，差异均有统计学意义（P＜0.01）。图13是U87对照组转染后流式测定细胞凋亡情况，图14是U87空载组转染后流式测定细胞凋亡情况，图15是U87实验组转染后流式测定细胞凋亡情况；图16是U251对照转染后流式测定细胞凋亡情况，图17是U251空载组转染后流式测定细胞凋亡情况，图18是U251实验组转染后流式测定细胞凋亡情况。 

上述实验结果表明STAT3-siRNA -1是理想的STAT3小分子干扰RNA序列，将其导入人恶性脑胶质瘤细胞，能够抑制该基因的mRNA和蛋白的表达并能抑制恶性脑胶质瘤细胞的增殖活性。因此，抑制人恶性脑胶质瘤细胞STAT3基因表达和增殖的siRNA及其慢病毒表达载体，用于在制备抑制人恶性脑胶质瘤治疗药物中的应用。 

 SEQUENCE LISTING 

<110>天津市第一中心医院 

<120>抑制人恶性脑胶质瘤靶向STAT3基因表达和增殖的siRNA及其表达载体和应用 

<130>DNA 

<160>1 

<170>PatentIn version3.5 

<210>1 

<211>19 

<212>DNA 

<213>2Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 

<220> 

<221>1 

<222>(1)..(19) 

<400>1 

tgaaatcatc atgggctat                             19 

序列表

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<110>  天津市第一中心医院

 

<120>  抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA及其表达载体和应用

      

 

<130>  DNA

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  19

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<213>  2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

 

 

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