一种检测猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒的二重PCR方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体为一种检测猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒的二重PCR方法。本发明设计分别扩增TGEV、PEDV的特异性序列的两对引物，从感染TGEV、PEDV的阳性肠管组织提取RNA，反转录成cDNA,进一步以cDNA为模版，建立了直接从样品中一次检测二种腹泻病毒的多重PCR检测方法。本发明的有益效果在于：其较现有报道的PCR检测方法提高了检测效率，而且特异性强。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多重PCR检测方法，特别涉及一种检测猪组织中猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒的二重PCR方法。

背景技术

猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis，TGE)是由冠状病毒科的传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起的猪的一种接触性传染病，呈世界性分布，从20世纪60年代末期，我国就有关于该病的报道，近年来疫区更为扩大，给养猪业造成巨大经济损失。其临床以呕吐、严重腹泻和脱水性肠炎为主要特征。不同年龄和品种的猪均易感，尤其对2周龄以内的仔猪，其致死率高达100%。TGE病毒属于冠状病毒科冠状病毒属。

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由冠状病毒科冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的猪的急性、高度接触性肠道传染病，我国从1976年开始就陆续有PED的报道，近几年来PED的流行日趋严重，自2010年下半年以来，中国华南、华东和华北部分省份出现了严重的仔猪腹泻流行，造成大量哺乳仔猪的死亡，也给养猪业造成了巨大的经济损失。其临床以水样腹泻、呕吐、脱水为主要特征，病理变化主要表现在猪的空肠和回肠部分的肠绒毛萎缩和脱落。

以上二种病均是是猪场常见的病毒性腹泻，病毒性腹泻造成了猪场饲料报酬降低、药物和人力增加等重大损失，是危害猪场最严重的疾病之一。由于TGE、PED有相似的临床表现及传染途径，其鉴别诊断通常需借助实验室诊断技术，如病毒分离、免疫荧光试验、PCR技术等。传统的诊断技术如病毒分离、免疫荧光试验等费时费力，不适于临床快速诊断，也不适于大规模的流行病学调查。而PCR技术具有特异性强，敏感度高，可进行活体诊断等特点，在实验室诊断中具有较突出的优势。

多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR的基础上加以改进，采用多对特异性引物对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。其通过在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物进行PCR扩增，可同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。

由于多重PCR同时扩增多个目的基因，具有节省时间、降低成本、提高效率的优点，特别是节省珍贵的实验样品，所以一经提出，即得到众多研究者的青睐，并且发展迅速，在生命科学的各个领域，多重PCR已经成为一项成熟而重要的研究手段。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种直接从样品中一次检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的多重PCR检测方法，其较现有报道的PCR检测方法提高了检测效率。

针对实际生产中二种病毒往往是混合感染，很难区分的情况，本发明利用生物信息学手段，从影响PCR检测灵敏度的各种因素入手分析基因片段结构，筛选出最容易通过PCR扩增出的基因片断作为PCR检测靶点，从引物质量参数方面进行分析，设计扩增这些靶点基因的引物；进一步利用设计的两对对引物分别扩增TGEV、PEDV的特异性序列，以TGEV和（或）PEDV疑似感染样品提取RNA,进一步发转录成cDNA,以cDNA为扩增模板，建立了对猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻感染鉴别诊断的二重PCR体系。其具体技术方案描述如下。

本发明提供一种传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒的二重PCR方法，具体步骤包括：

（1）从感染TGEV、PEDV的阳性肠管组织提取RNA，反转录成cDNA，进一步以cDNA为模版，将分别针对TGEV和PEDV的2对引物同时加入PCR反应体系，进行PCR扩增；

（2）PCR结束后，对PCR产物作琼脂糖凝胶电泳分析，得到385bp特异性基因片段表示感染猪传染性胃肠炎病毒，得到628bp特异性基因片段表示感染猪流行性病毒；其中：

步骤（1）中2对引物的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示：

上游引物TGEV：5’CAACCCCGATGGAGCACT3’；

下游引物TGEV：5’CCGAA CATTA CATAT CTGGA CACT3’；

上游引物PEDV：5’TGAGG GTGACAAGTTCGTAGG3’；

下游引物PEDV：5’CGCCA AGATATTAAAAGATTCACC3’；

上述步骤（1）中PCR反应体系如下：cDNA模板1μl，2对上、下游引物各0.5μl，PCR Mix12.5μl，超纯水补充至50μl；PCR扩增反应条件如下：95℃预变性5min，进入95℃60s，52℃1min和72℃1min的循环，循环35次，最后72℃延伸5min。

与现有技术相比，本发明利用自己筛选到的基因片段作为理想检测靶点，在退火温度、引物及其他反应体系参数等方面进行探索，筛选出灵敏度高、特异性强的多重PCR检测体系，建立直接从样品中一次检测二种腹泻病毒的多重PCR检测方法，实验证明，较现有报道的PCR检测方法，本发明的多重PCR检测方法重复性好、特异性强、检测效率高。

附图说明

图1是对比例1测试样品的单一PCR扩增结果图。M为标准分子量样品，1，2为两个疑似感染PEDV病毒样品，与预测的目的片段（628bp）一致；3，4为阴性对照。

图2是对比例1测试样品的单一PCR扩增结果图。M为标准分子量样品，P4为TGEV病毒感染样品，与预测的目的片段(385bp)一致；P3为阴性对照。

图3是实施例1不同测试样品进行多重PCR引物特异性扩增结果图。M为标准分子量样品，1，2为两个病毒同时感染样品，3，4为TGEV单独感染样品。

图4是实施例2中多重PCR引物特异性扩增结果图。M为标准分子量样品，1,2为疑似两个TGEV和PEDV同时感染样品，3为PRRSV，4为CSFV，5PRAV。

具体实施方式

本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件。

本发明利用一种生物信息学手段，首先筛选出最容易通过PCR扩增出的病毒（TGEV和PEDV）基因片断作为PCR检测靶点，进而设计扩增这些靶点基因的引物，其方法具体如下：

1）病毒（TGEV和PEDV）检测目的片段的完整序列筛选

借助网站www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank，首先在首页的Nucleotide一栏中分别输入要找的两个目的基因，之后从数据库中将其有的完整基因序列下载下来。

Porcine epidemic diarrhea virus，complete genome

27，953bp Iinear RNA

Accession：KC189944.1 GI：509265008

GenBank FASTA Granhics

TGEV virulent Purdue，complete genome

28，544bp Iinear RNA

Accession：DQ811789.2GI:331265425

GenBank FASTA Granhics Related Sequences

2）病毒（TGEV和PEDV）被检基因靶点的引物设计

将上述查到的这两个病毒基因经过测序后的完整序列的文档通过DNAstar软件打开，按照DNAstar使用说明书，将序列读取后，软件根据设定要求（二聚体发夹结构不超过1个，退火温度在48至55度之间）进行筛选，再将基因序列通过软件给出的引物方案进行优化和匹配，从而设计出病毒（TGEV和PEDV）被检基因靶点的引物；2对引物的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示：

上游引物TGEV：5’CAACCCCGATGGAGCACT3’；

下游引物TGEV：5’CCGAA CATTA CATAT CTGGA CACT3’；

上游引物PEDV：5’TGAGG GTGACAAGTTCGTAGG3’；

下游引物PEDV：5’CGCCA AGATATTAAAAGATTCACC3’；

其中猪传染性胃肠炎病毒的特异性基因片段为385bp，猪流行性腹泻病毒为628bp。

对比例1

1RNA提取本发明所用RNA用Trizol法提取。方法参照试剂盒说明书。第一步称取某猪场疑似感染TGEV或(和)PEDV猪肠道组织20g，研碎，加入Trizol Reagent200μL，室温作用孵育5min，使其充分裂解。12000r/min离心5min，弃去沉淀。第二步加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置15min，4℃，12000r/min离心15min，吸取上层水相，至另一离心管中。第三步加500μl异丙醇，1mlTrizol沉淀RNA，室温静置10min；4℃，12000r/min离心10min，弃上清，RNA沉于管底。第四步，加1mL75％乙醇，1mlTrizol，温和振荡离心管，悬浮沉淀，洗涤RNA沉淀。第五步，4℃，8000r/min离心5min。尽量弃上清，室温晾干或真空干燥5-10min，使充分干燥，对着光一般能看到一些透明的物质在管底。加16μL DEPC水溶解。DEPC水可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂，可用于RNA沉淀的溶解。

2cDNA合成

以RNA为模板，合成cDNA链。第一步，在1.5mL离心管中加入8μlRNA模板和2μl PrimeScript^TM（反转录酶）RT Master Mix(Perfect Real Time)。反应条件37℃15min，85℃5s，4℃5min，反应结束后冰浴保存。即得cDNA。

3单一病原体基因PCR扩增

以步骤2合成的cDNA为模板，分别以序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的2对引物做单对引物的扩增。扩增体系为上、下游引物各0.5μl，超纯水10.5μl，PCR Mix（上海生工生物工程有限公司购置）12.5μl，cDNA模板1μl，单个体系内共有25μl的混合物。95℃预变性5min，然后继续95℃60s，二者的退火温度分别为TGEV52.9℃、PEDV54.2℃，故退火温度设置为52摄氏度，后进入72℃60s的循环，共循环30次，最后72℃延伸5min。4℃保存PCR产物。PCR结束后，取8μl产物作琼脂糖凝胶电泳分析，结果分别如图1、图2所示。

实施例1

1RNA提取

方法同对比例1。

2cDNA合成

方法同对比例1。

3多重PCR的建立

以疑似感染TGEV或（和）PEDV的样品提取RNA，转录获得cDNA，以此cDNA为模板，将序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的2对引物同时加入扩增体系，建立二重PCR扩增反应体系。二重PCR反应体系如下：cDNA模板1μl，2对上、下游引物各0.5μl，PCR Mix12.5μl，超纯水补充至50μl。PCR反应条件：95℃预变性5min，进入95℃60s，52℃1min和72℃1min的循环，循环35次，最后72℃延伸5min，PCR结束后，取8μl产物作琼脂糖凝胶电泳分析。结果如图3所示。

图3是对不同测试样品进行多重PCR引物特异性扩增结果图。M为标准分子量样品，1，2为两个病毒同时感染样品，3，4为TGEV单独感染样品。

图3说明本发明二重PCR方法如果检测的是单一病毒感染的样品，则只能扩增一条，如果针对感染了双病毒的待检测样品则必须扩增出两条片段。其较现有报道的PCR检测方法提高了检测效率，而且特异性强。

实施例2验证多重PCR的特异性实验。

1RNA提取

方法同对比例1。

2cDNA合成

方法同对比例1，以提取猪呼吸与繁殖综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪轮状病毒（PRAV）的RNA并反转录得到cDNA，与PEDV及TGEV的cDNA模板进行多重RT-PCR反应。

3多重PCR的检测

以步骤2合成的cDNA为模板，将序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的2对引物同时加入扩增体系，建立二重PCR扩增反应体系。二重PCR反应体系如下：cDNA模板1μl，2对上、下游引物各0.5μl，PCRMix12.5μl，超纯水补充至50μl。PCR反应条件：95℃预变性5min，进入95℃60s，52℃1min和72℃1min的循环，循环35次，最后72℃延伸5min，PCR结束后，取8μl产物作琼脂糖凝胶电泳分析。

图4是多重PCR引物特异性扩增结果图。M为标准分子量样品，1,2为疑似两个TGEV和PEDV同时感染样品，3为PRRSV，4为CSFV，5PRAV。结果说明多重PCR特异性很强。