一种以水产品及其加工下脚料为原料生物转化生产γ-氨基丁酸的方法

摘要

本发明属于水产品生物加工技术领域，具体涉及一种利用水产品及其加工下脚料生物转化生产γ-氨基丁酸的方法。将具有谷氨酸脱羧酶活性的乳酸菌按照0.5-5％（V/V）的接种量接种至培养基中，并在30-35℃发酵温度下，100-500r/min的转速发酵培养20-50小时，使发酵液中活菌数高达106-107cfu/ml，待用；将转化液通过离心或者过滤除去菌体，取上清液减压浓缩制得GABA粗提液；粗提液用无水乙醇沉淀法去除杂质，然后用大孔树脂、葡聚糖凝胶、阳离子交换树脂依稀进行分离纯化，经分离纯化后的GABA产物经旋转蒸发、冷冻干燥，获得结晶。通过本发明技术，开辟了水产品及其加工下脚料的新的应用方向，为水产品全面的、高值的利用提供了理论基础。

说明书

技术领域

本发明属于水产品生物加工技术领域，具体涉及一种利用水产品及其加工下脚料生物转化生产γ-氨基丁酸的方法。>

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutiric acid,GABA)是哺乳动物、甲壳类动物、昆虫和某些寄生蠕虫神经系统中重要的抑制性神经递质。少数植物中含有这种非蛋白质氨基酸。γ-氨基丁酸也称氨酪酸，是一种非蛋白质组成成份的天然氨基酸，广泛存在于自然界中，是目前研究较为深入的一种重要的抑制性神经递质，它参与多种代谢活动，具有降血压、调节心律失常、改善睡眠、抗焦虑、改善脂质代谢、防止动脉硬化等功效，因此受到越来越多的科学工作者的关注。>

目前生产GABA的方法主要有化学合成法和生物合成法。生物合成法又分为植物富集法和微生物发酵法。相比而言，化学合成法历史悠久反应迅速，但所使用的原料价格昂贵、毒性大，反应条件剧烈、安全性差，所用的溶剂腐蚀性强、存在安全隐患，不宜用于食品工业。植物富集法成本高、产率低、具有较大局限性，由于微生物具有生长速度快周期短、生长条件温和、代谢过程简单和分布广泛等优点，所以微生物发酵法生产GABA不受空间、环境、资源的限制，具有成本低、无化学残留、产量高等显著优点，是生产医药及食品级GABA的一条理想途径。>

2009年我国卫生部批准γ-氨基丁酸为新资源食品，但是，目前，我国应用的GABA主要依赖进口，国内对GABA提取工艺尚不成熟，分离纯化的研究尚浅，得到的GABA纯度比较低，而且也没有制定出食品中GABA含量的标准检测方法。因此，从制备提取GABA原料的选择，发酵液中GABA分离纯化工艺和高纯度的确定以及GABA快速准确检测方法的确定都是急需的。>

我国是水产品养殖的大国，资源极为丰富。目前，我国的水产品以鲜食和制成干肉制品为主，少量加工成咸菜、蚝油或其它调味品。随着水产品养殖业的快速发展，水产品已出现供过于求和价格下跌的趋势，开发水产品的加工利用的新途径已成为水产品养殖业进一步发展的先决条件。水产品中含有丰富的氨基酸，尤其是一些呈味氨基酸，如谷氨酸，将其作为产生GABA的原料目前仅韩国一个研究单位对其进行了研究，但是以价格昂贵的MRS培养基发酵培养产生的，而以自身发酵产物配合氯化钠、葡萄糖等C源、N源作为培养基，通过分步补充谷氨酸或谷氨酸盐培养产生GABA，国内外还未见报道。利用水产品发酵生产GABA的研究不仅实现了水产品的高值化利用，促进了水产品养殖业健康持续发展，而且为水产品的开发利用提供了理论依据和实践指导。>

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用水产品及其加工下脚料生物转化生产γ-氨基丁酸的方法。>

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：>

一种以水产品及其加工下脚料为原料生物转化生产γ-氨基丁酸的方法：（1)乳酸菌生物转化：将具有谷氨酸脱羧酶活性的乳酸菌按照0.5-5％（V/V）的接种量接种至培养基中，并在30-35℃发酵温度下，100-500r/min的转速发酵培养20-50小时，使发酵液中活菌数高达10⁶-10⁷cfu/ml，待用；（2）γ-氨基丁酸的分离纯化：将发酵液通过离心或者过滤除去菌体，取上清液减压浓缩制得GABA粗提液；粗提液用无水乙醇沉淀法去除杂质，然后用大孔树脂、葡聚糖凝胶、阳离子交换树脂依稀进行分离纯化，经分离纯化后的GABA产物经旋转蒸发、冷冻干燥，获得结晶。>

所述培养基包括水产品及其水产品加工下脚料的发酵物、碳源、氮源和盐。>

所述水产品为鱼、扇贝、牡蛎、鱿鱼中的一种或几种的组合；水产品加工下脚料为头、尾、内脏、裙边中的一种或几种的组合。>

所述培养基按重量百分比计，为水产品及其水产品加工下脚料的发酵液10-30％、葡萄糖0-10％（W/W），氯化钠0-5.0％（W/W），磷酸盐0.1-50％（W/W），谷氨酸或谷氨酸盐每隔3-6小时间隔加入1-5％（W/W），余量为水。>

所述谷氨酸或谷氨酸盐每隔3-6小时间隔加入1-5％（W/W）为具有谷氨酸脱羧酶活性的乳酸菌在发酵培养过程中间隔式的向培养基中加入谷氨酸或谷氨酸盐；每3-6小时的间隔加入1-5％（W/W）。>

所述具有谷氨酸脱羧酶活性的乳酸杆菌的菌株为短乳杆菌，植物明串珠菌，短双歧杆菌，长双歧杆菌的一种或几种的组合。>

将步骤（1）所得发酵液采用能够特异性使GABA转化的转氨酶，将GABA生成琥珀酸半醛，利用所生成的琥珀酸半醛氧化时，所采用的辅酶氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸可定量地转变成还原型，其中所生成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸偶联介由给电子体的水溶性腙的生成，由上述的显色过程进而通过比色法对发酵液中GABA进行定量的检测。>

进一步的，将去除杂质的粗提液经极性大孔树脂洗脱，经湿法装柱，上样液PH控制在4.7-5.1，流速控制在2-4mL/min，收集洗脱液，洗脱液浓缩待用。>

进一步的，将经大孔树脂洗脱收集的洗脱液由葡聚糖凝胶洗脱，洗脱液为蒸馏水，流速2-4mL/min，收集洗脱液浓缩，待用。>

进一步的，将葡聚糖凝胶洗脱液PH调节至2.8-3.2，再由阳离子交换树脂洗脱，流速控制在2-4mL/min，吸附洗脱后采用蒸馏水洗至PH值为6，而后用0.2mol/L氨水洗脱，待茚三酮反应呈蓝色，PH值为6时，收集流出液，直至茚三酮蓝色反应消失为止，合并流出液，浓缩，冷冻干燥，获得 结晶。>

本发明所具有的优点>

1.本发明利用水产品及其加工下脚料的发酵成分作为培养基，相较于目前普遍应用的MRS培养基大大节约了成本，更适合于工业化生产。>

2.我国是水产养殖大国，海水养殖鱼类、贝类年产量居世界首位，但其加工下脚料鱼头、鱼尾、内脏等基本未被加工利用。本发明将加工下脚料变废为宝，充分利用了海洋鱼类、贝类等资源，提高了企业经济效益，减少了环境污染。>

具体实施例

下面对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。>

利用水产品及其加工下脚料生物转化γ-氨基丁酸的生产方法包括以下步骤：>

（1)乳酸菌生物转化：将具有谷氨酸脱羧酶活性的乳酸菌按照0.5-5％（V/V）的接种量接种至培养基中，并控制发酵温度30-35℃，发酵摇瓶转速100-500r/min，培养20-50小时；>

（2）将发酵培养20-50小时的发酵反应停止发酵，使活菌数高达10⁶-10⁷cfu/ml，该发酵液即为水产品及其加工下脚料产品生物转化的γ-氨基丁酸产品；>

（3）γ-氨基丁酸的定量检测：水产品及其加工下脚料发酵后氨基酸成分复杂，结构与γ-氨基丁酸类似的如谷氨酸等氨基酸较多，为了特异性检测GABA，本发明采用GABAse特异性转氨酶(存在于微生物、西红柿等多种生物中的酶复合体，兼具GABA转氨酶及琥珀酸脱氢酶活性)，利用该酶将GABA生成琥珀酸半醛，所生成的琥珀酸半醛氧化时，所采用的辅酶氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸可定量地转变成还原型，其中所生成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸偶联介由给电子体的水溶性腙的生成，由上述的显色过程进而通过比色法进行GABA的定量检测，该方法日本的独立行政法人国际农林水产业研究中心曾利用其定量测定食品如巧克力、清凉饮料、发芽糙米等。>

（4）γ-氨基丁酸的分离纯化：将转化液通过离心或者过滤除去菌体，取上清液减压浓缩制得GABA粗提液；粗提液用无水乙醇沉淀法去除杂质，如部分杂蛋白和多糖类物质，然后用大孔树脂、葡聚糖凝胶、阳离子交换树脂进行分离纯化。经分离纯化后的GABA产物经旋转蒸发、冷冻干燥，获得结晶。>

培养基主要成分为水产品及其加工下脚料的发酵产物，并配合一些碳源、氮源、盐等成分，主要为葡萄糖、氯化钠、谷氨酸或谷氨酸盐等。>

水产品及其水产品加工下脚料具体为鱼、扇贝、牡蛎、鱿鱼等及其加工下脚料鱼头、鱼尾、内脏、裙边等。>

所述葡萄糖的优选浓度为0-10％（W/W）重量比，氯化钠的优选浓度为0-5.0％（W/W）重量比，谷氨酸或谷氨酸盐在发酵培养过程中每3-6小时间隔加入1-5％（W/W）。>

实施例1>

1）100g牡蛎发酵4个月后，过滤，取100ml发酵液，在加入2％葡萄糖，1.5％氯化钠，0.3％磷酸盐，用蒸馏水定容至500ml，放入三口瓶中，在115℃灭菌20min，灭菌完成后取出冷却备用。>

2）乳酸菌生物转化：将具有谷氨酸脱羧酶活性的长双歧杆菌，按照1（V/V）的比例接种上述盛有培养基的三角瓶中，控制发酵温度34℃，发酵摇瓶转速130r/min，培养24小时，发酵培养过程中每隔6小时，补加1％谷氨酸钠，进行水产品及其加工下脚料生物转化GABA发酵培养；>

3）产品定量检测：将发酵培养24小时的乳酸菌发酵液停止发酵，使活菌数达到10⁶cfu/ml，采用GABAse特异性转氨酶(存在于微生物、西红柿等多种生物中的酶复合体，兼具GABA转氨酶及琥珀酸脱氢酶活性)，利用该酶将GABA生成琥珀酸半醛，而后通过所生成的琥珀酸半醛氧化时，所采用的辅酶氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸可定量地转变成还原型，其中所生成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸偶联介由给电子体的水溶性腙的生成，由上述的显色过程进而通过比色法进行GABA的定量检测，发酵液中含有高含量的GABA(720mg％)。>

4）产品分离纯化：将转化液离心（8000r/min）除去菌体，取上清液减压浓缩到原体积的1/4，制得GABA粗提液；粗提液按体积比1:2的比例加入无水乙醇，经沉淀法去除杂质，然后用S-8大孔树脂洗脱，即经湿法装柱，上样液PH控制在4.7，流速控制在3mL/min，收集洗脱液，洗脱液经G10葡聚糖凝胶再进行纯化，即洗脱液为蒸馏水，流速3mL/min，用茚三酮试纸检测待茚三酮反应呈蓝色，PH值为6时，收集此段含GABA的流出液，流出液再经732磺酸型阳离子交换树脂进行分离纯化，即流速控制在2mL/min，吸附洗脱后采用蒸馏水洗至PH值为6，而后用0.2mol/L氨水洗脱，并用茚三酮试纸检测待茚三酮反应呈蓝色，PH值为6时，收集流出液，直至茚三酮蓝色反应消失为止，经分离纯化后的流出液经旋转蒸发、冷冻干燥，获得结晶。>

实施例2>

1）100g牡蛎发酵4个月后，过滤，取100ml发酵液，在其中配入2％葡萄糖，1.5％氯化钠，0.3％磷酸盐，用蒸馏水定容至500ml，放入三口瓶中，在115℃灭菌20min，灭菌完成后取出冷却备用。>

2）乳酸菌生物转化：将具有谷氨酸脱羧酶活性的长双歧杆菌，按照1（V/V）的比例接种上述盛有培养基的三角瓶中，控制发酵温度35℃，发酵摇瓶转速150r/min，培养28小时，发酵培养过程中每隔7小时，补加2％谷氨酸钠，进行水产品及其加工下脚料生物转化GABA发酵培养；>

3）获得产品：将发酵培养28小时的乳酸菌发酵液停止发酵，使活菌数达到10⁷cfu/ml，通过γ-氨基丁酸的定量检测，发酵液中含有高含量的GABA(1250mg％)。>

4）产品分离纯化：将转化液离心（8000r/min）除去菌体，取上清液减压浓缩到原体积的1/4，制得GABA粗提液；粗提液按体积比1:2的比例加入无水乙醇，经沉淀法去除杂质，然后用S-8大孔树脂洗脱，即经湿法装柱，上样液PH控制在4.8，流速控制在3mL/min，收集洗脱液，洗脱液经G10葡聚糖凝胶再进行纯化，即洗脱液为蒸馏水，流速3mL/min，用茚三酮试纸检测待茚三酮反应呈蓝色，收集此段含GABA的流出液，流出液再经732磺酸型阳离子交换树脂进行分离纯化，即流速控制在2mL/min，吸附洗脱后采用蒸馏水洗至PH值为6，而后用0.2mol/L氨水洗脱，并用茚三酮试纸检测待茚三酮反应呈蓝色，PH值为6时，收集流出液，直至茚三酮蓝色反应消失为止，>

经分离纯化后的流出液经旋转蒸发、冷冻干燥，获得结晶。>

实施例3>

1）100g扇贝下脚料（裙边和内脏混合物）发酵5个月后，过滤，取100ml发酵液，在其中配入2％葡萄糖，1.5％氯化钠，0.3％磷酸盐，用蒸馏水定容至500ml，放入三口瓶中，在115℃灭菌20min，灭菌完成后取出冷却备用。2）乳酸菌生物转化：将具有谷氨酸脱羧酶活性的长双歧杆菌，按照1（V/V）的比例接种上述盛有培养基的三角瓶中，控制发酵温度36℃，发酵摇瓶转速200r/min，培养30小时，发酵培养过程中每隔6小时，补加3％谷氨酸钠，进行水产品及其加工下脚料生物转化GABA发酵培养；>

3）获得产品：将发酵培养24小时的乳酸菌发酵液停止发酵，使活菌数达到10⁶cfu/ml，通过γ-氨基丁酸的定量检测，发酵液中含有高含量的GABA(1680mg％)。>

4）产品分离纯化：将转化液离心（8000r/min）除去菌体，取上清液减压浓缩到原体积的1/3，制得GABA粗提液；粗提液按体积比1:3的比例加入无水乙醇，经沉淀法去除杂质，然后用S-8大孔树脂洗脱，即经湿法装柱，上样液PH控制在4.8，流速控制在3mL/min，收集洗脱液，洗脱液经G10葡聚糖凝胶再进行纯化，即洗脱液为蒸馏水，流速3mL/min，用茚三酮试纸检测待茚三酮反应呈蓝色，收集此段含GABA的流出液，流出液再经732磺酸型阳离子交换树脂进行分离纯化，即流速控制在2mL/min，吸附洗脱后采用蒸馏水洗至PH值为6，而后用0.2mol/L氨水洗脱，并用茚三酮试纸检测待茚三酮反应呈蓝色，PH值为6时，收集流出液，直至茚三酮蓝色反应消失为止，经分离纯化后的流出液经旋转蒸发、冷冻干燥，获得结晶。>

上述实施例中采用的长双歧杆菌也可用具有谷氨酸脱羧酶活性的乳酸杆菌的其它菌株如短乳杆菌，植物明串珠菌，短双歧杆菌，的一种或几种的组合进行替换。>

并且上述实施例中所采用的水产品以及水产品加工下脚料也可用其它鱼、扇贝、牡蛎、鱿鱼等中的一种或几种的组合进行替换；水产品加工下脚料可为头、尾、内脏、裙边等中的一种或几种的组合。>