一种甘蔗花青素调节基因ScRS及其应用

摘要

本发明提供的是一种甘蔗花青素调节基因ScRS及其应用，属于生物技术领域，调节基因ScRS序列如SEQ ID NO.1所示，根据玉米花青素转录因子RS基因序列设计引物，利用同源克隆技术，从甘蔗上得到花青素转录因子基因ScRS的全长序列。甘蔗ScRS基因开放读码框长度为1722bp，编码573个氨基酸。与众多玉米花青素相关基因的BLAST同源搜索中，E值等于零，说明了所克隆的基因确实为花青素有关的基因。在ScRS序列两端分别添加KpnⅠ、SalⅠ酶切位点，构建植物表达载体pCAMBIA1301-35SN-ScRS，再通过基因枪轰击转化甘蔗愈伤组织，转化的愈伤组织颜色转变为亮紫红色，进一步证实所克隆的基因具有使甘蔗愈伤组织显色的功能。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甘蔗花青素调节基因ScRS及其应用。

背景技术

花青素，也被称为花色素、花色苷，是一类自然界普遍存在的植物源水溶性色素。花青素也是植物呈色的主要因素，植物液泡中的不同PH值是影响植物花色呈现出不同的颜色关键。自然界的花青素不仅能使植物呈现丰富多彩的颜色，利于植物授粉，而且还可以保护植物果实免受紫外线的伤害。前人的研究表明，花青素具备很强的抗氧化能力，其抗氧化能力比维生素C高出20倍，比维生素E高出50倍。它是自由基的有效清除剂，在心血管疾病的预防、免疫活性的调节等方面，具有很高的营养和保健功能。

目前，已从矮牵牛、金鱼草、紫苏、龙胆等诸多观赏植物中克隆了为数不少的花青素相关基因。这为更好地开发和利用花青素创造了条件，可以使其更直接、更准确、更有效地应用到人类生命健康、医学保健和有关研究上。

已经有大量研究证明外源花青素调节基因对花青素合成的调控是有效的。同时也有研究表明，合理适当地运用花青素调控基因，可以建立一套新型的植物转基因研究可视化示踪系统。当前应用比较广泛的标记基因如GUS和GFP等都存在着一定程度的不足和缺陷，如除了有报告功能外，没有其它实际应用价值；表达的蛋白需要消耗植物同化物，但对植物生长无益等，而花青素转录因子基因除了可以发挥标记基因的功能外，对植物的生长也具有重要作用，因此，对花青素表达有关基因的研究显得尤为重要。

而在甘蔗方面，早在1975年，Harborne J.B就指出甘蔗茎色主要受到叶绿素和花青素含量的共同控制。1988年，广西农学院的李杨瑞等对不同基因型的甘蔗叶片的花青素含量进行了探究；2009年四川大学的涂斌等利用不同的分离方法，在甘蔗叶片上分离得到原花青素；2011年福建农林大阙友雄等利用电子克隆获得一个新的甘蔗MYB基因，初步确认为转录因子基因。植物花青素合成调节基因是一个家族，研究表明对花青素代谢起调控作用的转录因子主要有三类：bHLH、MYB类以及WD40蛋白，其中MYB类是最主要转录因子。在花青素表达代谢调控过程中，通常是转录因子联合共同调控，但也有部分转录因子可以单独调控花青素的合成。近年来在甘蔗花青素基因方面的研究才刚刚起步，发现的基因还只是冰山一角。因此，在甘蔗中克隆出与花青素合成有关的转录因子基因，添加组成型启动子，形成转录因子基因持续表达的基因表达框，然后转化甘蔗愈伤组织，研究其显色效果，有望培育富含花青素的甘蔗新品种，并建立一套新型甘蔗转基因可视化报告体系，为进一步开发利用提供核心技术。

发明内容

本发明的目的是克隆甘蔗花青素转录因子基因并验证其功能。根据玉米花青素转录因子RS基因序列设计引物，利用同源克隆技术，从甘蔗上得到花青素转录因子基因ScRS的全长序列。克隆的甘蔗ScRS基因开放读码框长度为1722>ScRS基因的编码区序列在NCBI中进行BLAST分析，证明所克隆的基因为花青素转录调控有关基因，通过查新证明ScRS是新基因，再通过转化甘蔗愈伤组织，转化的愈伤组织颜色转变为亮紫红色，进一步证实了所克隆的基因具有使甘蔗愈伤组织显色的功能。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种甘蔗花青素调节基因ScRS，所述调节基因ScRS序列如SEQ>

所述甘蔗基因ScRS开放读码框长度为1722>

一种甘蔗花青素调节基因ScRS在调控甘蔗花青素合成上的应用。

将甘蔗ScRS基因的编码区序列在NCBI中进行BLAST分析，结果发现，其与玉米的RS（登录号：NM_001112603.1）基因相似度达90%，与玉米Lc（登录号：NM_001111869.1）基因相似度达82%，与高粱b1-1（登录号：AY542311.1）基因序列相似度达89%，与玉米b1（登录号：NM_001112236.1）基因相似度达84%，与狗尾草R-S类似蛋白基因（登录号：NM_004970820.1）相似度达83%。

在NCBI上查询到玉米RS（GenBank:>ScRS目的基因片段，回收ScRS基因目的片段并加尾，与pMD18-T>ScRS重组子验证，目的基因PCR产物的序列测定。设计带酶切位点引物，PCR获得带酶切位点ScRS基因，酶切载体和ScRS基因，回收并连接，获得重组质粒。基因枪轰击转化，将愈伤组织置于显微镜下观察、拍照。

本发明的优点在于：

（1）显色效果好：本发明获得的甘蔗花青素调节基因ScRS转化甘蔗愈伤组织，可以使愈伤组织呈亮紫红色，与非转化愈伤组织的浅黄色形成鲜明对比，有利于区分转化和非转化愈伤组织；>

（2）生态安全性高：由于该基因显色效果好，在甘蔗转基因中可以替代现在常用的抗生素筛选标记基因，而抗生素筛选标记对于生态安全有潜在风险。由于ScRS基因来源于甘蔗而非致病微生物，用花青素调节基因ScRS替代抗生素筛选标记基因可以降低、甚至消除转基因生物的生态风险。

（3）食品安全性高：长期食用转基因食品，其中含有的抗生素筛选标记有可能使微生物产生抗生素抗性，而用花青素调节基因ScRS替代抗生素筛选标记基因则不存在这方面问题。

（4）效益高：花青素调节基因ScRS可以使花青素大量表达，富含花青素的农产品或食品经济价值大大高于同类其它产品。

附图说明

图1 RNA电泳结果，泳道1：ROC22总RNA；泳道2：FN39总RNA；M1：15000+2000 bp marker；M2：100bp marker。

图2 甘蔗ScRS基因PCR产物，泳道1、2：FN39扩增条带；泳道3、4：ROC22扩增条带；泳道5、6：空白对照；M1：100bp>

图3 重组质粒酶切验证，泳道1：质粒pCAMBIA1301-35SN-ScRS；泳道2：Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切pCAMBIA1301-35SN-ScRS；泳道3：Sal Ⅰ单酶切pCAMBIA1301-35SN-ScRS；泳道4：Kpn Ⅰ单酶切pCAMBIA1301-35SN-ScRS；泳道5：空白对照；M：15000+2000 bp marker。

图4A为 转ScRS基因的愈伤组织（轰击后20天）；B为转ScRS基因的愈伤组织显微观察结果。

具体实施方式

为了充分公开本发明一种甘蔗花青素调节基因ScRS及其应用，以下结合实施例加以说明。

实施例1：

一种甘蔗花青素调节基因ScRS及其应用，具体包括甘蔗花青素调节基因ScRS的克隆和遗传转化，具体如下：

(1) PCR引物设计：在NCBI上查询到玉米RS（GenBank:>

RSF1：5’-ATGGCCGTTTCAGCTTCC-3’；RSR1：5’-TCACCGCTTCCCTATAGC-3’。

（2）甘蔗叶片总RNA的提取

①取新鲜的甘蔗叶片，用75 %的酒精将叶片表面擦拭干净，在液氮作用下迅速研磨成粉。将研磨好的材料转移至预先加入1 mL TRIZOL试剂的1.5 mL Eppendorf离心管中，用力振荡、混匀，室温放置5 min，于4 ℃，12 000 rpm离心5 min。

②小心吸取800 μl上清液，移入新的1.5 mL Eppendorf离心管中，并加入200 μl氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡，待充分乳化，溶液呈乳白状后，室温静置5 min, 12 000 rpm，4 ℃，离心15 min。

③小心取出离心管，吸取500 μl上清液转移至另一新的1.5 mL离心管中，忌吸出白色中间层。向上清中加入500 μl的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30 ℃下静置10 min。12 000 rpm，4 ℃，离心10 min。

④小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75 %的乙醇l mL，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12 000 rpm，4 ℃，离心10 min。小心弃去乙醇。

⑤重复步骤④。

⑥室温干燥沉淀2-5分钟，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80 ℃保存。

（3） cDNA第一链的合成

以甘蔗叶片总RNA为模板，使用天根公司TIANscript RT Kit试剂盒合成cDNA第一链。

（4） PCR扩增ScRS目的基因片段

如下，配制50>

反应条件如下：

采用OMEGA胶回收试剂盒回收目的片段。

（5） ScRS基因目的片段加尾和克隆

在微量离心管内配制下列反应液：

于PCR仪上70 ℃，温育20 min。此ScRS基因加尾反应液直接用于TA克隆。吸反应液5>

完成加样后，稍离心使之集于离心管底部，16 ℃反应30 min，可延长至数小时或过夜，连接产物。

大肠杆菌Escherichia>.DH5α感受态细胞购自天根公司，参照说明书进行转化实验，具体步骤如下：

①将10 μl ScRS基因的连接产物分别加入100 μl感受态细胞中，并用枪头混匀，冰浴30 min，42 ℃热击90 s；

② 迅速放置冰上5 min；

③ 加入1 mL LB液体培养基(不含Amp⁺)，混匀，37>

④ 吸取200 μl菌液加上40 μl X-gal(20 mg/ml)和16 μl IPTG(50 mg/ml)混匀，涂在含1000 μg/mL Amp⁺的LB固体培养基上；

⑤ 待菌液吸干后，封上封口膜，倒置培养皿，37 ℃培养16 h。对长出的单菌落提取质粒DNA和重组子验证。

（6）质粒DNA提取与重组子验证

质粒提取按照常规方法或OMEGA质粒提取试剂盒说明书进行。重组子的PCR验证：

如下，配制20>

反应条件如下：

（7）目的基因PCR产物的序列测定

将提取的质粒DNA经过PCR验证后，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

（8）植物表达载体构建

带酶切位点引物设计和目的序列获得：根据目的基因序列和旁侧载体序列，设计克隆目的基因的特异引物，并在引物的两端添加内切酶位点SalⅠ和KpnⅠ，引物序列如下：

RSF2：5‘- ACGC GTCGAC ATGGCCGTTTCAGCTTCC-3’；RSR2：5’-GG GGTACC TCACCGCTTCCCTATAGC-3’

以重组子为模板，通过PCR获得目的序列，PCR反应体系同（6）中重组子验证。采用OMEGA胶回收试剂盒回收目的片段。

构建表达载体pCAMBIA1301+35SN+ScRS：PCR产物和载体pCAMBIA1301+35SN进行SalⅠ和KpnⅠ双酶切及切胶回收。pCAMBIA1301+35SN回收大片段，并与PCR酶切回收产物进行连接，用T4>

连接产物转化大肠杆菌感受态细胞重组质粒PCR验证同（6）PCR引物用RSF2、RSR2引物对。提取质粒再进行SalⅠ和KpnⅠ双酶切验证。

（9）基因枪法转化甘蔗

甘蔗愈伤组织利用诱导培养基MS+3 mg/L 2,4-D+7.0 g/L琼脂+30 g/L蔗糖（pH 5.8），28 ℃条件下暗培养，诱导产生愈伤，备用。基因枪轰击方法按照美国Bio-Rad生物公司生产的PDS-1000/He说明书进行。愈伤组织利用显微镜观察拍照，见图4，甘蔗愈伤组织转化ScRS基因后呈现亮紫红色。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110>福建农林大学

<120>一种甘蔗花青素调节基因ScRS及其应用

<130>5

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1722

<212>DNA

<213>调节基因ScRS

<400>1

atggccgttt cagcttccca ggttcaggaa gaattgcggc agcctgctga gaggcagttg 60

aggaagcagc tcgctgcagc cgcgaggagc atcaactggg cctatgccct cttctggtcc120

atttcaagca ctcaaccagg tgtgctgacg tggacggacg ggttctacaa cggcgaggtg180

aagacgcgga agatctccaa ctcggtagag ctgacagccg accagctcgt gatgcagagg240

agcgagcagc tccgggagct gtacaaggcc ctcctcaccg gcgagtgcga ccgccgcgcg300

gcgcggccgg tcggctttct gtcgccggag gaccttggcg acaccgagtg gtactacgtg360

atctgcatga cctacgcctt ccggcccggc caagggttgc ccggcaggag tttctcgagc420

aacgagcatg tctggctgtg caacgcgcac ctcgccgaca gcaaagcctt cccccgcgcg480

ctcctggcca agagcgcgtc cattaagtca atcgtctgca tcccgcttat gggtggggtg540

cttgagctgg gtacaactga taaggtgccg gaggacccgg acttgatcgg ccgagcaacc600

gcagctttct gggagccgca atgtctgaca tactcggaag agccgagctc caacccgtca660

gcaaacgaag ccggcgaggc cacagacaat gttgtgttcg aggacctcgg tcataatgcc720

atggagacga tgactgccgc cggaaatgaa cccgtcagcc tgttcaatgc aagcctggag780

cacatcacga aggagatcga tgagttctac agcctctgcg aggaaatgga cgtgcggcca840

ctaccactag aggatagctg ggtcatggtg gacgggtcta atttcgaagt cccgtcgtcc900

ccgcagccac cgcccccggg ggctactact aacaacgctg ccgacacctc aagcgcacca960

gttgacggct ctcgggcgac cagtttcatg gcttattcat cgtgctccga tgaagcggtg 1020

gcggtgccgg tcgtcgaaaa cccacagaaa ttgctgaaga aagtggtggc cggcggcgga 1080

gcttggacca actgtggtgg cgggggcacg acggggacag cacaggaaat aagtggcatc 1140

aagaatcacg tcatgtcaga gcgaaagcgc cgagagaaga tcaacgagat gttcctcatt 1200

ctcaagtcgt tggttccgtc cattcacaag gtggacaaag tgtcgatcct cgccgaaacg 1260

atagcctacc tcaaggaact tcagcgaaga gtacaagagc tggaatccag tagggaactt 1320

ctgtcacacc catctgaaac aacaacaagg ccaacaaggc cccgtggcaa tgagagtgcc 1380

aggaagaaac tctgtgcggg atccaagagg aagagcgcag agttcggcgg tgacgtggag 1440

aaggagcacc cctgggtcct ccccaaggac ggcaccagca acgtcaccgt cgccgtctcg 1500

gacagggacg tgctcctgga ggtgcaatgc cggtgggggg agctcctgat gacacgagtg 1560

ttcgacgcca tcaagggcct ccatttggac gttctctcgg ttcaggcttc ggcaccagat 1620

ggctttatgg gcctcaagat acgagctcag tttgctggct ccggtgccgt cgtgccctgg 1680

atggtcagcg aggctcttct caaagctata gggaagcggt ga1722

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atggccgttt cagcttcc 18

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tcaccgcttc cctatagc 18

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

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<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ggggtacctc accgcttccc tatagc26

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