产中性纤维素酶菌株及选育方法和其生产纤维素酶的方法

摘要

本发明公开了一株产中性纤维素酶的链霉菌属菌株，其特征是：它于2014年3月3日保藏于中国武汉大学“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCCNO:M2014056，分类命名为StreptomycesparvusS10A10。该菌株来源于昆虫肠道。本发明提供了鉴定的菌株培养物的rDNA序列。本发明还提供了该菌株的产酶培养基和培养条件，以及该菌株所产纤维素酶的酶学性质和生产方法。本发明生产的中性纤维素酶活力高，生产成本低廉、发酵周期短。所得到的中性纤维素酶适合作为食品和饲料添加剂，改善食品品质，促进动物生长，降低饲料系数，并可用于纺织行业。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、食品工程及畜牧养殖等领域，具体涉及一种 产中性纤维素酶菌株及选育方法和其生产纤维素酶的方法。本发明生产的纤维素酶主要应用 于食品加工、饲料添加剂及纺织等行业。

背景技术

纤维素酶是将纤维素及其衍生物水解成葡萄糖的一组酶的总称。一组完整的纤维素酶系 通常有相互协同催化水解纤维素的三类酶组成：内切纤维素酶(CMCase)、外切纤维素酶和葡 萄糖苷酶。按催化反应的最适pH，可将内切纤维素酶分为：酸性内切纤维素酶(最适pH3～5)、 中性内切纤维素酶(最适pH6～8)、碱性内切纤维素酶(最适pH8～10)。目前国产商品化纤 维素酶多为酸性高温酶，国内使用的中性纤维素酶几乎都是国外厂家生产的。技术垄断导致 其商品化中性纤维素酶价格昂贵，制约了其市场推广。因此，本领域迫切需要开发新的生产 高活力中性纤维素酶的菌株。

能产生内切纤维素酶的微生物主要是真菌和部分细菌。真菌所产纤维素酶多为酸性胞外 酶且产酶效率高，且酶系结构完整，但真菌所产纤维素酶都是复合酶，且酶系结构复杂，分 子量大，不易分离提取，通常其产酶过程需要加入纤维素类物质进行诱导，且发酵周期长， 因此在工业用酶开发方面显示出了诸多不足。细菌所产纤维素酶虽然成分单一(即通常只含 有一类纤维素酶)，可以简化提取步骤，但是细菌纤维素酶多为中性或者碱性胞内酶，多吸附 于菌壁，且其酶活普遍较低，另外，大部分菌株产诱导型内切纤维素酶，需要添加诱导物， 不适应用于工业大规模生产。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于，提供一种产中性纤维素酶菌株及选育方法和 其生产纤维素酶的方法，该菌株产生的纤维素酶pH稳定性好、催化能力强，适合较高的酶反 应温度。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一株产中性纤维素酶的链霉菌属菌株， 其特征是：它于2014年3月3日保藏于中国武汉大学“中国典型培养物保藏中心”，保藏 编号为CCTCCNO:M2014056，分类命名为StreptomycesparvusS10A10。

前述的一株产中性纤维素酶菌株，其特征是：该菌株为放线菌，能有效地获得高产的中性 纤维素酶。

一种如权利要求1所述的产中性纤维素酶菌株的选育方法，其特征是，所述方法包括以下 步骤：

(a)取昆虫肠道无菌研磨加入液体种子培养基中富集培养1d后，将经过富集培养后的菌 液稀释到10^-4，取稀释液，在初筛培养基上涂平板培养；

(b)培养7d后，用接种针挑出同一平板上不同形态的放线菌菌落，再转接到平板上进行 单菌落分离，最终得到多株菌；

(c)将每株菌分别接种于液体种子培养基和发酵产酶培养基中，在28℃恒温培养箱中培 养36h，取发酵液进行刚果红平板的快速筛选，经1mg/mL的刚果红溶液染色30min，1mol/L 的NaCl溶液脱色30min后，测量平板上菌落水解圈与菌落直径，计算水解圈和菌株直径的 比值，筛选出比值大于5的菌株，经反复实验筛选得到一株在两种培养中均能产生明显透明 圈的菌株，将其命名为StreptomycesparvusS10A10。

前述的产中性纤维素酶菌株的选育方法，其特征是，上述步骤(a)和步骤(c)中，所 述液体种子培养基的组成为：CMC-Na，10g；KH₂PO₄，4.0g；MgSO₄，0.03g；蒸馏水，1000 mL，pH6.0～6.5。

前述的产中性纤维素酶菌株的选育方法，其特征是，上述步骤(a)中，所述初筛培养基 的组成为：羧甲基纤维素钠，5.0g；K₂HPO₄，1.0g；NaNO₃，3.0g；KCl，0.5g；MgSO₄，0.5 g；FeSO₄，0.01g；琼脂，17.0g；蒸馏水，1000mL，pH6.0～6.5。

前述的产中性纤维素酶菌株的选育方法，其特征是，上述步骤(c)中，所述发酵产酶培 养基的组成为：水稻秸秆粉，10g；(NH₄)₂SO₄，4g；KH₂PO₄，2g；MgSO₄，0.5g；蒸馏水， 1000mL，pH6.0～6.5。

一种利用权利要求1所述的产中性纤维素酶菌株生产纤维素酶的方法，其特征是，所述 方法包括以下步骤：

(1)产酶培养

将StreptomycesparvusS10A10接种于斜面高氏1号培养基，27℃培养2d后转接液体 种子培养基，27℃条件下培养24h；以2％接种量再转接发酵产酶培养基，发酵培养基最适初 始pH为6～6.5,27℃条件下培养5d；

(2)胞外产物粗酶液的处理

将发酵液以4000r/min的转速冷冻离心10min，取上清，即得粗酶液；取20mL粗酶液于 0.05mol/L、pH为6.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中透析过夜；用聚乙二醇浓缩透析液，再 经O.45μm微孔滤膜过滤除杂，保存滤液；

(3)分子筛层析

预先用pH为6.2的磷酸盐缓冲液充分平衡葡聚糖凝胶层析柱SephadexG-100柱，上样 后用pH为6.2的柠檬酸-柠檬酸钠洗脱，收集有酶活的洗脱峰，即为纯化后的纤维素酶。

前述的一种利用权利要求1所述的产中性纤维素酶菌株生产纤维素酶的方法，其特征是， 上述步骤(1)中，所述高氏1号培养基的组成为：可溶性淀粉，20g；KNO₃，1g；K₂HPO₄， 0.5g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；NaCl，0.5g；FeSO₄·7H₂O，0.01g；琼脂，20g；蒸馏水，1000 mL，pH6.0～6.5。

前述的一种利用权利要求1所述的产中性纤维素酶菌株生产纤维素酶的方法，其特征是， 上述步骤(1)中，所述液体种子培养基的组成为：CMC-Na，10g；KH₂PO₄，4.0g；MgSO₄，0.03 g；蒸馏水，1000mL，pH6.0～6.5。

前述的一种利用权利要求1所述的产中性纤维素酶菌株生产纤维素酶的方法，其特征是， 上述步骤(1)中，所述发酵产酶培养基的组成为：水稻秸秆粉，10g；(NH₄)₂SO₄，4g；KH₂PO₄， 2g；MgSO₄，0.5g；蒸馏水，1000mL，pH6.0～6.5。

本发明的有益效果是：

(1)本发明所筛选到的StreptomycesparvusS10A10属于组成型纤维素酶高产菌株，与 当前工业用酶的细菌菌株相比，发酵产酶周期短，酶活力高，且产酶过程无需诱导，因此其 产生的纤维素酶即为组成型纤维素酶，因此该菌适用于大规模的发酵生产的特点；

(2)从本发明StreptomycesparvusS10A10提取的纤维素酶总酶的活力比活达33.02 U/mL,与报道菌株相比，具有更高的催化能力；该酶最适反应pH为5.0，为罕见的酸性组成 型纤维素酶；该酶在pH4.0～8.0的缓冲液中保存2h酶活力可保持最高酶活的90％以上，体 现了较好的pH稳定性；最适反应温度为50～65℃；有耐Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、 Ba²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺等金属离子的良好特性，EDTA对酶活性影响甚微，该酶为非金属离子纤维素 酶，显示了良好的特性，在纺织、食品加工和饲料等工业领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明StreptomycesparvusS10A10菌株在初筛培养基上的透明圈；

图2为本发明StreptomycesparvusS10A10菌株的扫描电镜形态图片；

图3为本发明纯化的纤维素酶聚丙烯酰胺凝胶电泳图(M为标准蛋白分子量，3为酶蛋白 分子量为82Kd内切纤维素酶。)；

图4为SephadexG-100柱层析得到含纤维素酶活性峰的色谱图；

图5为pH对纤维素内切酶活的影响；

图6为温度对纤维素内切酶活的影响；

序列表为StreptomycesparvusS10A10菌株的16SrDNA序列鉴定。

生物材料样品保藏：

StreptomycesparvusS10A10已保藏于中国武汉大学“中国典型培养物保藏中心”，保藏 地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏编号为保藏编号为CCTCCNO:M2014056，保藏日期 为2014年3月3日。

具体实施方式

为进一步揭示本发明的技术方案，下面结合附图详细说明本发明的实施方式：

本发明中所用培养基为：

高氏(Gause)1号培养基：可溶性淀粉，20g；KNO₃，1g；K₂HPO₄，0.5g；MgSO₄·7H₂O， 0.5g；NaCl，0.5g；FeSO₄·7H₂O，0.01g；琼脂，20g；蒸馏水，1000mL，pH6.0～6.5。

初筛培养基：羧甲基纤维素钠，5.0g；K₂HPO₄，1.0g；NaNO₃，3.0g；KCl，0.5g；MgSO₄， 0.5g；FeSO₄，0.01g；琼脂，17.0g；蒸馏水1000mL，pH6.0～6.5。

液体种子培养基：CMC-Na，10g；KH₂PO₄，4.0g；MgSO₄，0.03g；蒸馏水1000mL，pH6.0～ 6.5。

发酵产酶培养基：水稻秸秆粉，10g；(NH₄)₂SO₄，4g；KH₂PO₄，2g；MgSO₄，0.5g；蒸 馏水1000mL，pH6.0～6.5。

实施例1

StreptomycesparvusS10A10的筛选过程：

取黑盾鞭蝎(Typopeltisniger)肠道无菌研磨加入液体种子培养基中富集培养1d后， 将经过富集培养后的菌液稀释到10-4，取稀释液，在初筛培养基上涂平板培养。培养约7d后， 用接种针挑出同一平板上不同形态的放线菌菌落，再转接到平板上进行单菌落分离，最终得 到42株菌株。将每株菌分别接种于液体种子培养基和发酵产酶培养基中，在28℃恒温培养 箱中培养36h，取发酵液进行刚果红平板的快速筛选，经1mg/mL的刚果红溶液染色30min， 1mol/L的NaCl溶液脱色30min后，测量平板上菌落水解圈与菌落直径，计算水解圈和菌 株直径的比值，筛选出比值大于5的菌株，经反复实验筛选得到一株在两种培养中均能产生 明显透明圈的菌株(D/d>5)，将其命名为StreptomycesparvusS10A10。图1为Streptomyces parvusS10A10菌株在初筛培养基上的透明圈，图2为StreptomycesparvusS10A10菌株的 显微观察图片。

实施例2

从StreptomycesparvusS10A10中提取中性组成型内切纤维素酶的方法：

1.产酶培养

将StreptomycesparvusS10A10接种于斜面高氏1号培养基，27°C培养2d后转接种 子培养基，27°C条件下培养24h；以2％接种量再转接液体发酵培养基，发酵培养基最适初 始pH为6～6.5；27°C条件下培养5d。

2.胞外产物粗酶液的前处理

将发酵液以4000r/min的转速冷冻离心10min，取上清，即得粗酶液；取20mL粗酶液于 0.05mol/L、pH值6.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中透析过夜；用聚乙二醇浓缩透析液，再 经O.45μm微孔滤膜过滤除杂，保存滤液。

3.分子筛层析

预先用pH6.2的磷酸盐缓冲液充分平衡葡聚糖凝胶层析柱SephadexG-100柱，上样后用 PH6.2的柠檬酸-柠檬酸钠洗脱，收集有酶活的洗脱峰(见图4)。

SephadexG-100柱层析条件如下：

平衡缓冲液：0.05mol/L、pH值6.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；

洗脱缓冲液：0.05mol/L、pH值6.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；

上样流速：1.0mL/min；

洗脱流速：1.5mL/min。

分管收集蛋白峰，检测酶活力和蛋白浓度，得到含纤维素酶活性峰的收集液。

酶活测定方法：

①总酶(滤纸酶活力、FPA)活力的测定：

取稀释10倍后的粗酶液0.5mL，加入1.0ml0.05mol/L的柠檬酸缓冲液(pH值4.8) 和50mg新华滤纸，以不加底物为对照，50℃反应60min，加入3mLDNS溶液，沸水浴5min， 再将试管置于冷水浴中，待试管冷却后，加入18mL蒸馏水。以空白管做对照，采用分光光 度计测得在540nm处的OD值。

②纤维素内切酶(羧甲基纤维素酶、CMCA)活力的测定：

取稀释10倍后的粗酶液0.5mL，加入1.0mL、1％羧甲基纤维素钠溶液(pH值4.8)， 以不加底物为对照，50℃反应30min，加入3mLDNS溶液，沸水浴5min，再将试管置于冷 水浴中，待试管冷却后，加入18mL蒸馏水。以空白管做对照，采用分光光度计测得在540nm 处的OD值。

③纤维素外切酶(微晶纤维素酶)活力的测定：

取0.5mL稀释3倍后的酶液，加入1.0mL、1％的微晶纤维素溶液(pH值4.8)，以不加 底物为对照，50℃反应60min，加入3mLDNS溶液，沸水浴5min，再将试管置于冷水浴中， 待试管冷却后，加入18mL蒸馏水。以空白管做对照，采用分光光度计测得在540nm处的 OD值。

④β-葡萄糖苷酶(BGA)活力测定：

取0.5mL稀释3倍后的酶液，加入1.0mL、1％的水杨苷溶液(pH值4.8)，以不加底物 为对照，50℃反应30min，加入3mLDNS溶液，沸水浴5min，再将试管置于冷水浴中，待 试管冷却后，加入18mL蒸馏水。以空白管做对照，采用分光光度计测得在540nm处的OD 值。

酶活力的计算方法：

酶活力的定义：在pH4.8，50℃条件下，每1mL酶液在1min内水解底物生成1μg 葡萄糖的酶量称作一个酶活力单位(U)。

纤维素酶活力单位＝G×n×1000/(0.5×t)

G——所测得的OD值在葡萄糖标准曲线上查出的还原糖浓度，mg/mL；

n——酶液的稀释倍数；

1000——毫克换算成微克；

0.5——反应酶液的体积；

t——酶和底物反应时间，min。

取粗酶液测定酶的活力，经测定，总酶、内切酶和外切酶酶活分别为33.02U/mL、18.51 U/mL和23.92U/mL。

分别对粗酶液、样品前处理液和经SephadexG-100柱层析后的样品进行总酶活力的测定， 如表1所示，结果表明StreptomycesparvusS10A10纤维素酶纯化后得率78％，得率较高， 且酶活在纯化过程中较为稳定。

表1纤维素酶的内切酶活力测定

实施例3

从StreptomycesparvusS10A10菌株中提取的中性组成型内切纤维素酶的相关性质：

1.酶蛋白分子量的测定

用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳按常规方法进行。分离胶、浓缩胶浓度分别为12％和5％， 电极缓冲液为pH8.3Tris-Gly缓冲，考马斯亮蓝染色，结果如图3所示。电泳后用GEL-DOC2000 (Bio-Rad)进行凝胶扫描。运用扫描系统自带软件QuantityOne进行分子量测定，测得内切 纤维素酶酶蛋白分子量为82Kd。

2.酶的最适pH

用各种缓冲配制不同pH值的CMC-Na底物。将提取后的内切纤维素酶LC与不同pH值 CMC-Na底物反应，65℃条件下反应30min，并检测CMCase活力，如图5所示。纤维素酶在中 性偏酸性的具有较高的活力，在pH5.O～7.O范围内具有很高的活力，达到最高酶活的80％以 上，其最适反应pH为6.2，为中性纤维素酶。

3.酶的pH稳定性

提取后的内切纤维素酶溶解于不同pH缓冲液中，65℃条件下放置2h后，测定内切纤维 素酶相对活力，如附图5所示。结果表明该内切纤维素酶在较宽的pH范围内显示了高度的稳 定性，在pH5.0～8.0的缓冲液中能保持其最高酶活85％以上，显示了良好的pH稳定性，在 纺织、造纸以及食品加工行业有良好的应用潜力。

4.酶的最适反应温度

将内切纤维素酶LC纯酶分别放置于不同温度下反应30min，测定其酶活如图6所示。结 果表明内切纤维素酶在50～65℃反应时具有较高的活力，其最适温度为50℃。

5.金属离子对内切纤维素酶活力的影响

在三个浓度水平lmmol/L、5mmol/L、10mmol/L探讨Na⁺、K⁺、Li⁺—价金属离子；Ca²⁺、Ni²⁺、 Zn²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺二价金属离子；Fe³⁺三价金属离子以及EDTA对 CMCase活力的影响。4℃下放置30min，65℃条件下反应30min，并检测CMCase活力。以不 加金属离子的酶活为对照测定酶的相对活力。结果低浓度(lmmol/L)的金属离子存在条件下， 大部分金属离子可明显促进内切纤维素酶活力，中等浓度(5mmol/L)的金属离子存在条件下, 大部分金属离子可提高纤维素酶活力。此外实验发现不同浓度的EDTA对酶活力影响不大，推 测内切纤维素酶很可能为非金属离子纤维素酶，金属离子对该酶有一定的促进作用。表明该 酶符合纺织、造纸以及食品加工行业应用的基本要求。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其 他的任何背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化、均应为等 效的置换方式，都包含在本发明的保护范围内。