产纤维素酶菌株的诱变选育及其产酶条件的研究

摘要

纤维素作为自然界中一种取之不尽用之不竭的可再生资源，其合理利用受到广泛重视。中国是一个农业大国，每年的农作物秸秆产量可达到7×108t。秸秆中的主要物质是纤维素，这些秸秆大多以焚烧或掩埋的方式处理，没有得到合理充分的开发利用，还造成了环境的污染。纤维素可被纤维素酶降解转化为葡萄糖，葡萄糖一方面可以通过发酵转化为蛋白、脂肪，可作饲料;另一方面又可以作为生产酒精、丁醇、柠檬酸、甘油等化学制品。纤维素酶是一类可将纤维素降解转化称葡萄糖的酶的总称。它在食品、纺织、造纸、饲料、能源等多个领域被广泛应用，能够为人类带来巨大的经济效益。
　　本论文以实验室前期筛选的产纤维素酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) M7为实验材料，采用紫外诱变及溴化乙锭诱变方法，诱变选育出一株产酶活力较高的菌株，并对突变株的液体发酵及固态发酵条件进行优化，结果如下:
　　1.分别使用紫外诱变和溴化乙锭诱变方法，研究其适宜的诱变条件，经刚果红培养基初筛，液体发酵复筛后，得到一株产酶活力较高的诱变菌株EB-5。该诱变株的酶活力较原始菌株M7的CMCase和FPA酶活力分别提高了6.11和632倍，达到30.86 U/mL和43.11 U/mL。
　　2.诱变株EB-5的液体发酵产酶单因素条件的优化结果:麸皮为最适碳源，无机氮源1％的硫酸铵为最佳氮源，最适转速为160r/min，培养基的最适初始pH值为4.83，最适发酵温度为30℃，最适发酵时间为72h，最适菌龄为24h，吐温-80的最适添加量为0.6％。采用响应面Box-Behnken设计以发酵温度、转速、发酵时间为单因子的3因素3水平实验，分别以CMCase和FPA活力为响应值，对诱变株EB-5产酶条件进行优化。经模型预测及验证实验得到诱变株EB-5产CMC酶的适宜条件:发酵温度31℃，转速160r/min，发酵时间81h，产FPA酶的适宜条件:温度30℃，转速160r/min，发酵时间80h。
　　3.诱变株EB-5固态发酵单因素条件优化的结果为:最适碳源为小麦秸秆与麸皮混合物(3∶2)，最适氮源为硫酸铵，最佳料水比为1∶1，pH5.83为最适培养基初始pH;最适发酵温度为30℃;最适发酵时间72h。

目录

声明

摘要

主要缩略词表

第1章 绪论

1．1 纤维素的组成及结构

1．2 纤维素酶的研究进展

1．2．1 产纤维素酶的微生物

1．2．2 纤维素酶体系

1．2．3 纤维素酶的降解机理研究概况

1．2．4 纤维素酶的分子结构及其作用机理

1．3 纤维素酶的生产

1．3．1 液体深层发酵

1．3．2 固态发酵

1．4 纤维素酶诱变选育

1．4．1 物理诱变

1．4．2 化学诱变

1．4．3 生物诱变

1．4．4 诱变剂量的选择及影响诱变效果的因素

1．4．5 纤维素酶高产突变株的筛选

1．5 纤维素酶的应用

1．5．1 制浆造纸工业的应用

1．5．2 纺织工业的应用

1．5．3 饲料工业的应用

1．5．4 食品和酿造工业的应用

1．5．5 新能源的应用

1．5．6 理论及应用研究中的应用

1．6 国内外纤维素酶研究现状

1．7 纤维素降解研究中存在的问题

1．8 课题研究意义及内容

第2章 产纤维素酶菌株的诱变

2．1 实验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器

2．1．4 培养基配制

2．1．5 溶液配制

2．2 实验方法

2．2．1 筛选路线

2．2．2 诱变方法

2．2．3 最佳突变株的筛选

2．2．4 诱变致死率

2．2．5 粗酶液的制备

2．2．6 葡萄糖标准曲线的制作

2．2．7 酶活力的测定

2．3 结果与分析

2．3．1 紫外诱变

2．3．2 溴化乙锭诱变

2．4 讨论

2．5 结论

第3章 液体发酵产纤维素酶条件的优化

3．1 实验材料

3．1．1 菌株

3．1．2 培养基

3．1．3 溶液配制

3．2 实验方法

3．2．1 粗酶液制备

3．2．2 葡萄糖标准曲线制作

3．2．3 酶活力测定

3．3 结果与分析

3．3．1 诱变菌株EB-5液体发酵产酶条件的优化

3．3．2 响应面Box-Behnken设计优化诱变菌株EB-5产酶条件

3．4 讨论

3．5 结论

第4章 固态发酵产纤维素酶条件的优化

4．1 实验材料

4．1．1 菌株

4．1．2 培养基

4．1．3 溶液配制

4．2 实验方法

4．2．1 粗酶液制备

4．2．2 葡萄糖标准曲线制作

4．2．3 酶活力测定

4．3 结果与分析

4．3．1 碳源对诱变菌株EB-5固态发酵产酶的影响

4．3．2 氮源对诱变菌株EB-5固态发酵产酶的影响

4．3．3 料水比对诱变菌株EB-5固态发酵产酶的影响

4．3．4 培养基初始pH对诱变菌株EB-5固态发酵产酶的影响

4．3．5 发酵温度对诱变菌株EB-5固态发酵产酶的影响

4．3．6 发酵时间对诱变菌株EB-5固态发酵产酶的影响

4．4 讨论

4．5 结论

结论与展望

参考文献

致谢

附录A 攻读硕士学位期间发表的学术论文