高表达达托霉素的菌株及其筛选方法

摘要

本发明涉及高表达达托霉素的菌株及其筛选方法，属于抗生素生产菌株及其筛选领域。菌株的分类命名为玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC NO.6899、NO.7014和NO.7015。本发明还提供了一种高表达达托霉素的菌株的筛选方法，采用紫外诱变结合抗生素抗性筛选增加菌株的突变机率，得到的高表达达托霉素的菌株生产达托霉素的产量均在59.86mg/L以上，可高达79.44mg/L。本发明可以快速、有效地提高达托霉素生产水平，具有十分重要的现实意义。

说明书

技术领域

本发明涉及高表达达托霉素的菌株及其筛选方法，属于抗生素生产菌株及其筛 选领域。

背景技术

达托霉素是A21978的N-癸酞基衍生物，由玫瑰孢链霉菌代谢产生。达托霉素分 子由13个氨基酸组成的环脂肽与十碳的脂肪酸链所组成。当A-21978C发生脱酰作用 脱去N末端连接基团时，可得到A-21978C核心，而A21978C核心的N末端再与癸酸 发生酰化作用后即可得到达托霉素（结构式如下）。

达托霉素结构式

在过去四十多年中，在抗感染药物领域，代表全新结构类别进入临床应用的微 生物药物，唯有以利萘唑胺为代表的唑脘酮类抗生素，和以达托霉素为代表的环脂 肽类抗生素。但是，利萘唑胺上市不到一年就出现了交叉耐药菌的报道，达托霉素 的上市，丰富了现有的抗生素结构类别。达托霉素结构新颖，作用机制特殊，它对 多数革兰氏阳性菌都有快速杀灭活性，包括MRSA、VRSA、VISA和耐万古霉素肠 球菌(VRE)等，它能在革兰氏阳性菌细胞膜上形成离子通道，破坏膜电位，扰乱细 胞膜对氨基酸的转运、阻碍细菌细胞壁肽聚糖和胞壁酸酯的生物合成，从而杀死细 菌。其独特的环脂肽结构及作用机制，使其将不会受到来自其它抗生素所致交叉耐 药性的影响，具有广阔的市场前景。2003年9月，由于病人对新型抗生素的迫切需 求，美国FDA经过快速审理程序批准注射用达托霉素（商品名Cubicin）用于治疗由 一些革兰氏阳性敏感菌株引起的并发性皮肤及皮肤结构感染，如脓肿、手术切口感 染和皮肤溃疡。之后又相继批准了达托霉素用于治疗金葡菌引起的菌血症和右侧心 内膜炎。达托霉素的用药方式便捷，毒副作用小，临床上已经成为了“病原菌最后 一道防线——万古霉素”的最佳替代品。

目前，达托霉素的制备方法主要有天然发酵法、前体诱导法、化学合成、酶法 半合成等，由于达托霉素特有的环脂肽结构，并且含有特殊氨基酸成分，因而微生 物发酵生产达托霉素还是目前较为常用的方法。玫瑰孢链霉菌（ATCC31568）作为 生产达托霉素的原始菌株，其生产能力较低，无法满足市场需求，目前已有报道利 用组合生物学的方法对达托霉素结构进行定向改造或者实现其整个合成基因簇的 异源表达，虽然这些方法目标明确，但是操作复杂，目前仅停留在实验室水平，无 法投入到工业生产，所以利用传统方法对达托霉素生产菌进行菌种选育，提升达托 霉素生产水平，具有十分重要的现实意义。

在抗生素菌种选育过程中，抗生素抗性筛选是主要方法之一。由于抗生素生产 基因和抗性基因成簇排列，并易发生共突变，这些突变可直接提高抗生素生产菌的 生产能力。因此利用抗生素产生菌产抗能力与其抗性突变之间的相关性进行筛选， 可以在很大程度上减少抗生素高产菌筛选的盲目性，提高对目的菌的筛选效率。

紫外诱变技术是微生物菌种选育过程中常用的方法之一，但是，使用紫外诱变 结合利福平/庆大霉素的方法以提高达托霉素生产水平尚无报道。

发明内容

为了提高生产达托霉素的生产水平，本发明提供了三种高表达达托霉素的菌 株，可获得产量最高达79.44mg/L的达托霉素。

一种高表达达托霉素的菌株Ge-27，用于生产达托霉素，该菌株Ge-27的分类 命名为玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus)，该菌株于2012年11月30日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝 阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.6899。该菌种可获 得产量达79.44mg/L的达托霉素。

另一种高表达达托霉素的菌株RG-4，用于生产达托霉素，该菌株RG-4的分类 命名为玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus)，该菌株于2012年12月18日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝 阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.7014。该菌种可获 得产量达77.87mg/L的达托霉素。

又一种高表达达托霉素的菌株Ri-5，用于生产达托霉素，该菌株Ri-5的分类命 名为玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus)，该菌株于2012年12月18日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳 区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.7015。该菌种可获得 产量达75.07mg/L的达托霉素。

本发明还提供了一种用于筛选高表达达托霉素菌株的筛选方法，利用该方法， 可以更有效率地筛选出高表达达托霉素的菌株，从而提升达托霉素生产水平。该方 法可以快速有效地提高达托霉素的生产水平。

一种高表达达托霉素的菌株的筛选方法，包括如下步骤：

（1）筛选具有利福平和/或庆大霉素抗性的玫瑰孢链霉菌菌株；

（2）从所述具有利福平和/或庆大霉素抗性的玫瑰孢链霉菌菌株中筛选高表达 达托霉素的菌株。

步骤（1）中，筛选具有利福平和/或庆大霉素抗性的玫瑰孢链霉菌菌株的出发 菌株可为玫瑰孢链霉菌ATCC 31586，购买于美国菌种保藏中心（ATCC），编号为 Streptomyces roseosporus ATCC 31586，该菌株为生产达托霉素的原始菌株。

优选的，筛选具有利福平和/或庆大霉素抗性的玫瑰孢链霉菌菌株为从经过诱变 处理的玫瑰孢链霉菌菌株中筛选。通过诱变，增加得到高表达菌株的机会。

利用上述方法，得到的高表达达托霉素的菌株生产达托霉素的产量在约 59.86mg/L以上。

本发明上述高表达达托霉素的菌株Ge-27、RG-4、Ri-5还可作为出发菌株，进一 步利用本发明的方法筛选获得产量更高，即高于约79.44mg/L的突变株。

对生产达托霉素的出发菌株（原始菌株）玫瑰孢链霉菌（ATCC31568）进行 诱变和抗生素抗性筛选，包括如下步骤：

1）将玫瑰孢链霉菌孢子悬液或者经过诱变处理后的玫瑰孢链霉菌孢子悬液涂 布于含有利福平和/或庆大霉素的固体平板，培养，筛选出抗利福平和/或庆大霉素 的玫瑰孢链霉菌突变株；

2）分别挑选抗利福平和/或庆大霉素的玫瑰孢链霉菌突变株单菌落，进行摇瓶 发酵并检测达托霉素含量，筛选比出发菌株生产能力有所提高的菌株，得到高表达 达托霉素的菌株。

在步骤1）中，所述的玫瑰孢链霉菌孢子悬液制备方式包括：（a）用生理盐水 收集孢子，所得孢子液稀释100倍倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中；（b）30℃，200rpm 振荡20min，使孢子分散活化；（c）经灭菌脱脂棉过滤，制得单孢子悬液10⁵-10⁶个 /mL。

具体而言，向玫瑰孢链霉菌成熟孢子培养皿（90mm）内加入5~6mL生理盐水， 刮下孢子，所得孢子液（浓度一般为10⁹-10¹⁰个/mL）用生理盐水稀释100倍后，倒 入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，于30℃、200rpm振荡20~40min，使孢子分散活化， 经灭菌脱脂棉过滤，制得单孢子悬液，用血球计数板计数，使孢子浓度为10⁵-10⁶个 /mL。

在一个实施方式中，用于筛选具有利福平抗性的玫瑰孢链霉菌菌株的利福平浓 度为约0.4至约1.8μg/mL。即初步筛选时所应用的利福平在固体平板上的浓度为 0.4~1.8μg/mL，筛选确定其最小抑菌浓度（MIC）为1.4μg/mL。

在另一个实施方式中，用于筛选具有庆大霉素抗性的玫瑰孢链霉菌菌株的庆大 霉素浓度为约0.4至约1.1μg/mL。即初步筛选时所用的庆大霉素在固体平板上的浓 度为0.4~1.1μg/mL，确定其最小抑菌浓度（MIC）为1.0μg/mL。

在又一个优选的实施方式中，用于筛选具有庆大霉素和利福平抗性的玫瑰孢链 霉菌菌株的庆大霉素浓度为约0.1至约1.0μg/mL，同时利福平浓度为约0.14至 1.4μg/mL。即初步筛选时所用的利福平和庆大霉素这两种抗生素组合在固体平板上 的浓度为0.1×MIC~1.0×MIC，即庆大霉素浓度为约0.1至约1.0μg/mL，同时利福平 浓度为约0.14至1.4μg/mL。确定其最小抑菌浓度为0.6×MIC，即利福平0.84μg/mL 同时庆大霉素为0.6μg/mL。

所述的固体平板为高氏一号培养基。

在步骤1）中，所述的诱变处理为紫外诱变：取5~6mL上述制备的玫瑰孢链霉 菌孢子悬液于无菌培养皿中紫外照射（功率30W，距离30cm），照射时间为20s~70s， 处理后的孢子悬液稀释10倍后涂布平板，30℃暗室培养5d（天）~7d（天）。

在步骤2）中，分别挑选抗利福平和/或庆大霉素的玫瑰孢链霉菌突变株单菌落， 所述的单菌落为孢子丰满，菌落较大的单菌落；所述的摇瓶发酵是将挑选的单菌落 移至种子培养基，放大培养后转接至发酵培养基；所述的检测达托霉素含量的检测 方法为先用HPLC（高效液相色谱）外标法检测，再用牛津杯法进一步验证；筛选 比出发菌株生产能力更高的菌株。利用该方法，可以更加快速有效地得到产量更高 的目的菌株。

本发明中为了有效提升达托霉素生产水平，摇瓶发酵是先挑选单菌落至种子培 养基，放大培养后转接至发酵培养基。其中种子培养基为：黄豆粉0.5%，酵母粉0.5%， 葡萄糖酸钙1%，KCl0.02%，MgSO₄0.02%，消泡剂0.03%，pH7.0；发酵培养基为： 黄豆粉2.2%，Fe(NH₄)₂SO₄0.66%，糊精4.125%，糖蜜0.275%，pH7.0。

本发明为了准确检测发酵液中达托霉素含量，步骤2）中的检测方法是先使用 HPLC外标法进行检测，然后使用牛津杯法对发酵液进行抑菌圈实验进一步验证， 其中抑菌圈实验使用的指示菌为枯草芽孢杆菌（BS168）。

本发明利用抗生素产生菌产抗能力与其抗性突变之间的相关性进行筛选，筛选 出抗利福平和/或庆大霉素的玫瑰孢链霉菌突变株；在很大程度上减少了抗生素高产 菌筛选的盲目性，提高了对目的菌的筛选效率；同时使用紫外诱变结合利福平/庆大 霉素的方法来提高达托霉素生产水平。

利用本发明方法可以更有效率地筛选出高表达达托霉素的菌株，筛选得到的菌 株包括但不限于Ge-27。筛选到的抗性菌株摇瓶发酵最高产量为79.44mg/L，比出 发菌株提高了42.2%。本方法可以快速、有效地提高达托霉素生产水平，具有十分 重要的现实意义。

附图说明

图1为玫瑰孢链霉菌的紫外诱变剂量与致死率、正突变率的关系图。

图2为采用抑菌圈实验测得的出发菌株与Ge-27发酵液抑菌活性比较图。

图3-1和图3-2分别为达托霉素标准品（A）和诱变所得菌株Ge-27（B）发酵液 样品HPLC比较图。

具体实施方式

高表达达托霉素的菌株Ge-27，分类命名：玫瑰孢链霉菌（Streptomyces  roseosporus)，保藏日期：2012年11月30日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号：CGMCC NO.6899。

高表达达托霉素的菌株RG-4，分类命名：玫瑰孢链霉菌（Streptomyces  roseosporus)，保藏日期：2012年12月18日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号：CGMCC NO.7014。

高表达达托霉素的菌株Ri-5，分类命名：玫瑰孢链霉菌（Streptomyces  roseosporus)，保藏日期：2012年12月18日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号：CGMCC NO.7015。

下面用实施例结合附图对本发明进一步说明。

本发明高表达达托霉素的菌株的筛选方法，首先，筛选具有利福平和/或庆大霉 素抗性的玫瑰孢链霉菌菌株；然后，从具有利福平和/或庆大霉素抗性的玫瑰孢链霉 菌菌株中筛选高表达达托霉素的菌株。

本实施例中，筛选具有利福平和/或庆大霉素抗性的玫瑰孢链霉菌菌株的出发菌 株选用玫瑰孢链霉菌ATCC 31586，购买于美国菌种保藏中心（ATCC），编号为 Streptomyces roseosporus ATCC31586，该菌株为生产达托霉素的原始菌株。

制备玫瑰孢链霉菌孢子悬液：向玫瑰孢链霉菌成熟孢子培养皿（90mm）内加 入5mL生理盐水，刮下孢子，所得孢子液（浓度一般为10⁹-10¹⁰个/mL）用生理盐水 稀释100倍后，倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，于30℃、200rpm振荡30min，使孢 子分散活化，经灭菌脱脂棉过滤，制得单孢子悬液，用血球计数板计数，使孢子浓 度为10⁵-10⁶个/mL。

一、利福平和庆大霉素最小抑菌浓度的测定

制备高氏一号固体培养基，其中成分配比见表1。分别取利福平和庆大霉素标 准品加入高氏一号培养基，倒平板，制成0.4μg/mL、0.6μg/mL、0.8μg/mL、1.0μg/mL、 1.2μg/mL、1.4μg/mL、1.6μg/mL和1.8μg/mL的利福平浓度梯度平板，以及0.4μg/mL、 0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1.0μg/mL和1.1μg/mL的庆 大霉素浓度梯度平板，同时设置不加抗生素的平板作为对照。将玫瑰孢链霉菌孢子 悬液稀释10~100倍后涂布在所制备的平板上，培养5d后，观察，并计算致死率。玫 瑰孢链霉菌对利福平和庆大霉素的耐受性测定参照表2。

表1高氏一号固体培养基的配方

可溶性淀粉 20g/L KNO₃1g/L Nacl 0.5g/L K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L MgSO₄·7H₂O 0.5g/L FeSO₄.7H₂O 0.1g/L 琼脂粉 15g/L

表2玫瑰孢链霉菌对利福平和庆大霉素的耐受性测定

利福平（μg/mL） 致死率（%） 庆大霉素（μg/mL） 致死率（%） 0.4 43 0.4 51 0.6 57 0.5 64 0.8 70 0.6 73 1.0 84 0.7 85 1.2 93 0.8 92

1.4 100 0.9 98 1.6 100 1.0 100 1.8 100 1.1 100

根据表2可知：利福平和庆大霉素对出发菌株的MIC值分别为1.4μg/mL、1.0 μg/mL。

二、利福平和庆大霉素对玫瑰孢链霉菌的复合最小抑菌浓度

制备高氏一号固体培养基，向培养基同时加入利福平和庆大霉素，倒平板，制 成两种抗生单独最小抑菌浓度的梯度平板：0.1×MIC、0.2×MIC、0.3×MIC、0.4×MIC、 0.5×MIC、0.6×MIC、0.8×MIC和1.0×MI。将玫瑰孢链霉菌孢子悬液稀释10~100倍后 涂布在所制备的平板上，培养5d后，观察，并计算致死率。玫瑰孢链霉菌同时对利 福平和庆大霉素的耐受性测定参照表3。

表3玫瑰孢链霉菌同时对利福平和庆大霉素的耐受性测定

利福平&庆大霉素（μg/mL） 致死率（%） 0.1×MIC 49 0.2×MIC 61 0.3×MIC 70 0.4×MIC 83 0.5×MIC 95 0.6×MIC 100 0.8×MIC 100 1.0×MIC 100

根据表3可知：两种抗生素组合的最小抑菌浓度为0.6×MIC。

三、确定最佳紫外诱变时间

取置有5mL玫瑰孢链霉菌孢子悬液的平皿，分别经紫外照射（功率为30W，距 离为30cm）20s、30s、35s、40s、45s、50s、55s、60s、70s后，以未经紫外照射的 孢子悬液作为对照组，涂无抗性平板（制备高氏一号固体培养基，倒平板），并置 30℃暗箱中培养5d后统计致死率和正突变率，以确定最佳诱变时间。图1为紫外诱 变时间的确定结果。

由图1可知，当诱变时间为45s时致死率为78%，正突变率最高，故本实验采用 45s为紫外诱变时间。

四、紫外诱变结合抗生素抗性筛选

所述的诱变处理为紫外诱变，紫外照射功率为30W，距离为30cm，照射时间为 20s~70s

取置有5mL玫瑰孢链霉菌孢子悬液的平皿，经紫外照射45s后，以未经紫外照 射的孢子悬液作为对照组，分别涂布含有利福平、庆大霉素以及二者组合的最小抑 菌浓度的抗性平板，并置30℃暗箱中培养5d后，挑取菌落较大，孢子较丰满的单菌 落；摇瓶发酵，得到发酵液，具体为：挑选单菌落至种子培养基，放大培养（30℃， 48h）后转接至发酵培养基，培养（30℃，7d）。其中种子培养基为：黄豆粉0.5%， 酵母粉0.5%，葡萄糖酸钙1%，KCl0.02%，MgSO₄0.02%，消泡剂0.03%，pH7.0； 发酵培养基为：黄豆粉2.2%，Fe(NH₄)₂SO₄0.66%，糊精4.125%，糖蜜0.275%，pH7.0。 然后，用HPLC外标法测定达托霉素含量，其中，分析柱为反相C18柱；流动相为各 含有0.1（v）%三氟乙酸的乙腈和水（体积比为45:54），流速1mL/min；柱温采30 ℃；检测器采用220nm紫外光进行检测。表4为紫外诱变条件下抗生素抗性筛选的正 突变株。

表4紫外诱变条件下抗生素抗性筛选的正突变株

如表4所示，采用紫外诱变结合抗生素抗性筛选增加了菌株的突变机率，得到 的高表达达托霉素的菌株生产达托霉素的产量均在59.86mg/L以上，其中Ge-27发酵 水平增幅最大，增幅42.2%，产量达到79.44mg/L。

五、发酵液的抑菌圈实验

使用枯草芽孢杆菌（BS168）作为指示菌，吸取0.6mL菌浓度为10⁸个/mL的枯 草芽孢杆菌菌悬液至平板上，用涂布器涂布均匀后静置，使其自然吹干；用镊子将 无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中；吸取一定体积的无菌过滤后的发酵液至牛津杯 中；小心将培养皿移至培养箱内，37℃培养16h；观察抑菌效果。图2为采用抑菌圈 实验测得的原始菌株（出发菌株）与Ge-27发酵液抑菌活性比较图。如图2所示，Ge-27 发酵液的抑菌效果显著，与原始菌株相比，有了明显提升。

六、HPLC比较

用前面所述的HPLC外标法测定达托霉素标准品（A）和诱变所得菌株Ge-27（B） 发酵液样品的达托霉素含量。图3-1和图3-2分别为达托霉素标准品（A）和诱变所得 菌株Ge-27（B）发酵液样品HPLC比较图。横坐标为出峰时间/min，纵坐标为相对 峰面积。可见Ge-27出峰更早，而且产量更高。

本发明得到的高表达达托霉素的菌株Ge-27、RG-4、Ri-5还可作为出发菌株，进 一步利用本发明的方法筛选获得产量更高，即高于约79.44mg/L的突变株。

尽管已参考上述实施例说明了本发明的前述实施方式，本发明并不限于这些实 施方式并可以各种不同的形式实施。本领域技术人员应理解除说明书中具体说明的 以外，在不改变本发明的技术精神或基本特征的条件下，本发明可以其它方式实施 来实现本发明的技术效果。因此，这些实施方式在各方面应理解为说明性的，并不 应以限制的方式考虑。