一种降低禽源多杀性巴氏杆菌荚膜生产成本的培养基及制备方法

摘要

本发明涉及一种降低禽源多杀性巴氏杆菌荚膜生产成本的培养基，其每升中包含胰蛋白胨9g-11g，酵母粉4g-6g，氯化钠4g-6g，硝酸钠0.7g-1g，磷酸氢二钾7g-11g，小牛血清8mL-12mL，50％葡萄糖18mL-22mL；所述培养基的pH为7.6-8.2。本发明的目的在于提供一种降低禽源多杀性巴氏杆菌荚膜生产成本的培养基及制备方法。本发明的优点在于：本发明所提供的培养基，同样以液体培养法进行培养，与原马丁肉汤为基础的培养基相比，荚膜的生产成本有了大幅度的下降，且可以规模化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种降低禽源多杀性巴氏杆菌荚膜生产成本的培养基及制备方 法。

背景技术

禽霍乱，又名禽出血性败血症、禽巴氏杆菌病或禽摇头瘟等，是由多杀性 巴氏杆菌(Pasteurella multocida)引起的侵害各种禽类的接触性传染病。 该病常表现为败血型，发病率和死亡率都很高，也表现慢性型，给世界范围内 的养禽业造成重大的经济损失。多杀性巴氏杆菌为革兰氏阴性、无鞭毛、无芽 胞的小杆菌，新分离的菌株具有荚膜，荚膜可增强菌株的侵袭力和繁殖能力。

以含3％-5％的小牛血清和0.25％葡萄糖的马丁肉汤或琼脂培养禽源多杀性巴 氏杆菌，提取其荚膜制成禽霍乱荚膜亚单位疫苗，近期免疫保护率为80％以上。 该疫苗起免疫原性作用的是一种含蛋白质为主的脂多糖蛋白复合物，其免疫剂 量的确定是测定其中的蛋白质含量，临床应用时，8周龄左右鸡、鸭的单位免疫 量为1.2mg-1.4mg、鹅的使用量加倍。制备禽霍乱荚膜亚单位疫苗时，选用的 培养基是以马丁肉汤为基础，添加小牛血清和葡萄糖制成。培养的方法有液体 培养法和固体培养法。二者相比，固体培养法收获的荚膜较多，成本较低，但 工艺繁琐，不适合大规模生产；液体培养法适合大规模生产，但收获的荚膜较 少，成本较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种降低禽源多杀性巴氏杆菌荚膜生产成本的培养 基及制备方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种降低禽源多杀性巴氏杆菌荚膜 生产成本的培养基，其每升中包含胰蛋白胨9g-11g，酵母粉4g-6g，氯化 钠4g-6g，硝酸钠0.7g-1g，磷酸氢二钾7g-11g，小牛血清8mL-12mL， 50％葡萄糖18mL-22mL；所述培养基的pH为7.6-8.2。

制备一种降低禽源多杀性巴氏杆菌荚膜生产成本的培养基的方法，每升培 养基按以下步骤制备：

①将胰蛋白胨9g-11g、酵母粉4g-6g、氯化钠4g-6g、硝酸钠0.7g-1 g、磷酸氢二钾7g-11g依次加入蒸馏水中，摇匀溶解；

②用1M NaOH调pH值至7.6-8.2之间,其后定容；

③121℃、15磅高压灭菌20min-30min；

④待其自然冷却至室温，在无菌条件下，加入小牛血清8mL-12mL和50％ 葡萄糖18mL-22mL，混匀，4℃-8℃保存。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

本发明所提供的培养基，同样以液体培养法进行培养，与原马丁肉汤为基 础的培养基相比，荚膜的生产成本有了大幅度的下降，且可以规模化生产。

具体实施方式

下面结合实施例和对比试验对本发明内容进行详细说明：

一种降低禽源多杀性巴氏杆菌荚膜生产成本的培养基，其每升中包含胰蛋 白胨9g-11g；酵母粉4g-6g；氯化钠4g-6g；硝酸钠0.7g-1g；磷酸 氢二钾7g-11g；小牛血清8mL-12mL；50％葡萄糖18mL-22mL；所述降低 禽源多杀性巴氏杆菌荚膜生产成本的培养基的pH为7.6-8.2。

制备一种降低禽源多杀性巴氏杆菌荚膜生产成本的培养基的方法，每升培 养基按以下步骤制备：

①将胰蛋白胨9g-11g、酵母粉4g-6g、氯化钠4g-6g、硝酸钠0.7g-1 g、磷酸氢二钾7g-11g依次加入蒸馏水中，摇匀溶解；

②用1M NaOH调pH值至7.6-8.2之间,其后定容；

③121℃、15磅高压灭菌20min-30min；

④待其自然冷却至室温，在无菌条件下，加入小牛血清8mL-12mL和50％ 葡萄糖18mL-22mL，混匀，4℃-8℃保存。

一、实施例如下：

实施例1：

称取胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠(NaCl)5g、硝酸钠(NaNO₃)0.85 g、磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)9.13g，加蒸馏水800mL，摇匀溶解，用1M>

实施例2：

称取胰蛋白胨9g、酵母粉4g、氯化钠(NaCl)4g、硝酸钠(NaNO₃)0.7 g、磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)7g，加蒸馏水800mL，摇匀溶解，用1M>

实施例3：

称取胰蛋白胨11g、酵母粉6g、氯化钠(NaCl)6g、硝酸钠(NaNO₃)1g、 磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)11g，加蒸馏水800mL，摇匀溶解，用1M>

二、对比试验

1、培养基准备

1.1马丁肉汤和马丁琼脂的配制

牛肉汤：除去脂肪、筋膜的牛肉500g，绞碎，加入1000mL蒸馏水，搅拌 均匀。加热到65℃-70℃，保持45min，继续加热至煮沸，保持1h，其间不断 搅拌。纱布过滤除去肉渣，加氯化钠5g，补充蒸馏水至1000mL，116℃高压 灭菌30min，贮存备用。

猪胃消化液：除去脂肪的猪胃300g，绞碎，加入56℃蒸馏水1000mL，再 加入浓盐酸10mL，搅拌均匀，56℃水浴锅内水浴18h-24h，前12h至少搅 拌10次。18h后观察，胃组织溶解，液体澄清即为消化完全，如果消化不完全， 可适当延长消化时间。消化完全后，除去液面上的脂肪和浮沫，煮沸3min-5min， 纱布过滤，加2N氢氧化钠溶液调pH值为6.0，补充蒸馏水至1000mL，116℃ 高压灭菌30min，贮存备用。

将牛肉汤和猪胃消化液等比例混合，以2N氢氧化钠溶液调pH值为7.6-7.8， 121℃高压灭菌20min，即为马丁肉汤。待其自然冷却至室温，在无菌条件下， 965mL马丁肉汤加入小牛血清30mL，加入注射用50％葡萄糖5mL，混匀即为 含3％小牛血清和0.25％葡萄糖的马丁肉汤。

将牛肉汤和猪胃消化液等比例混合，以2N氢氧化钠溶液调pH值为7.6-7.8， 按1.5％(质量体积比)加入琼脂粉，121℃高压灭菌20min，冷却至60℃左右 分装至平板，自然凝固后即为马丁琼脂平板。

1.2NKLB培养基的配制，同实施例1。

2、菌种：禽源多杀性巴氏杆菌CVCC44801株，购自国家兽医微生物菌种保 藏中心。

3、种子液制备：将菌种冻干粉划线接种马丁琼脂平板，37℃温箱中培养20 h。分别挑取马丁琼脂平板上圆形突起、表面光滑湿润、露珠样的单个菌落，接 种于20mL的NKLB培养基和含3％小牛血清和0.25％葡萄糖的马丁肉汤，37℃温 箱中培养20h后取出作为各自的种子液。

4、培养：分别取种子液10mL接种于1000mL的NKLB培养基和1000mL 的含3％小牛血清和0.25％葡萄糖的马丁肉汤，以无菌棉花为塞子，37℃温箱中 200rpm振荡培养14h。

5、荚膜提取和蛋白质含量测定

提取两种培养液中细菌的荚膜，测定其中的蛋白质含量。

6、结果比较

含3％小牛血清和0.25％葡萄糖的马丁肉汤培养后，1000mL获得了360mL 荚膜，其蛋白质含量为1.102mg/mL，共生产荚膜396.7mg。该培养基的成本 为每mL0.058元，该培养基生产的荚膜成本为0.146元/mg。

NKLB培养基培养后，1000mL获得了360mL荚膜，其蛋白质含量为1.032 mg/mL，共生产荚膜371.5mg。该培养基的成本为每mL0.018元，该培养基生 产的荚膜成本为0.048元/mg。

7、结论

NKLB培养基是一种降低禽源多杀性巴氏杆菌荚膜的生产成本的培养基，且 液体培养法适合应用于大规模生产。