一种非接触式液滴法冷冻装置及冷冻方法

摘要

一种非接触式液滴法冷冻装置及冷冻方法，装置包括密封盖，密封盖与液滴容器螺纹配合连接，液滴容器底部开有一圆形通孔，将冷冻薄膜粘接于液滴容器底部，制冷剂容器上部开有一圆形通孔，将制冷剂容器与液滴容器相粘接，使冷冻薄膜夹于两者之间，液滴容器和制冷剂容器通过螺栓和螺母进一步连接固定，冷冻方法为先使得混有冷冻液的细胞悬液以液滴形式，加在冷冻薄膜上，使其在冷冻薄膜的表面呈点阵式布置；之后，将冷冻装置翻转，将低温制冷剂匀速倾倒在冷冻装置的制冷剂容器内，使其在冷冻薄膜表面沸腾气化，本发明能够快速地实现玻璃化冷冻，保证较高的生物组织存活率，防止生物污染，操作流程简明，易于操作实现。

说明书

技术领域

本发明属于生物低温冷冻保存领域，具体涉及一种非接触式液滴 法冷冻装置及冷冻方法。

背景技术

低温冷冻作为一种保存生物细胞、细胞团以及生物组织的有效手 段，在生物研究、医学应用等方面都有广泛的使用与需求。

传统的慢速冷冻保存技术，往往因为冷冻速率不够高，在冷冻保 存时，细胞内液体结晶度较高，形成的冰晶会破坏细胞组织结构，极 易造成解冻后生物活性降低。同时，其冷冻流程复杂，耗时较长。

此外，一些冷冻速率较高的玻璃化冷冻手段，例如液滴法冷冻、 OPS法冷冻，Cryotop法冷冻等，通过让冷冻物质与液氮等制冷剂直 接接触，从而加快冷冻速率，在相对低浓度的冷冻保护剂下实现超高 速冷冻，阻碍冰晶形成，从而实现玻璃化冷冻，削弱冰晶的负面影响。 但是直接将细胞组织与液氮等制冷剂接触，也带来了一些问题，例如 (1)液氮中可能存在细菌，造成冷冻生物组织的污染；(2)液氮中 可能存在其他种类的细胞，对冷冻后的组织造成生物污染；(3)冷冻 结束后生物组织散落不便于收集。因此，这些冷冻方法仍然需要一定 的改进。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种非接 触式液滴法冷冻装置及冷冻方法，能够快速地实现玻璃化冷冻，保证 较高的生物组织存活率，同时避免冷冻生物组织与液氮的接触，防止 生物污染，也能方便地收集冷冻后的生物组织；并且所设计采用的冷 冻装置结构简单，操作流程简明，易于操作实现。

为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种非接触式液滴法冷冻装置，包括密封盖1，密封盖1与液滴 容器2螺纹配合连接，液滴容器2底部开有一圆形通孔，使用耐低温 胶水将冷冻薄膜5粘接于液滴容器2底部，制冷剂容器3上部开有一 圆形通孔，使用耐低温胶水将制冷剂容器3上部与液滴容器2底部相 粘接，使冷冻薄膜5夹于两者之间，并用耐低温胶水将三者之间的缝 隙密封，液滴容器2和制冷剂容器3通过螺栓6和螺母4进一步连接 固定。

所述密封盖1、液滴容器2、制冷剂容器3均用耐低温材料制成， 耐低温材料包括聚四氟乙烯材料。

所述冷冻薄膜5用高导热材料制成，导热系数大于200W/(m·℃)， 高导热材料包括银、金、铜或铝。

所述冷冻薄膜5的厚度为20-200μm。

所述螺栓6和螺母4均采用耐低温材料，耐低温材料包括聚酰胺 纤维。

所述的冷冻装置能够冷冻细胞、细胞团或其他生物组织，冷冻方 法为：

冷冻过程中，先旋开密封盖1，使液滴容器2侧朝上放置，然后 使用移液枪或细胞打印技术使得混有冷冻液的细胞悬液以液滴形式， 加在装置中心的冷冻薄膜5上，使其在冷冻薄膜5的表面呈点阵式布 置；

之后，将冷冻装置翻转，使得制冷剂容器3朝上，液滴容器2朝 下放置，之后，将低温制冷剂匀速倾倒在冷冻装置的制冷剂容器3内， 使其在冷冻薄膜5表面沸腾气化，将冷量传递至冷冻薄膜5另一侧， 完成对液滴的玻璃化冷冻；

冷冻结束后，被冷冻的液滴仍留在液滴容器2中的冷冻薄膜5表 面，同时，冷冻装置用密封盖1将液滴容器2密封后，放入液氮中保 存，也能够整体转移运输。

本发明装置具有以下特点：

1.结构装置简单，容易实现，且冷冻流程操作简明。

2.采用基于液滴的玻璃化冷冻，液滴尺寸小，冷冻速率快，便 于形成玻璃化固体，从而尽可能避免冷冻过程中生物组织的 损伤。

3.采用高导热薄膜作为传热媒介，冷冻速度快，同时将低温制 冷剂和生物组织隔离开。

4.冷冻过程中冷冻生物组织不与低温制冷剂直接接触，不会造 成生物污染。

5.冷冻结束后，冷冻液滴仍在冷冻薄膜表面，易于收集。

6.冷冻结束后，冷冻装置可用密封盖密封，放入液氮中保存， 或整体转移运输。

7.本冷冻装置可冷冻细胞或细胞团等其他生物组织，且不受细 胞种类的限制。

附图说明

图1为本发明冷冻装置的分解示意图。

图2为冷冻装置整体结构示意图。

图3为冷冻后细胞的代表性死活染色图，其中左图的白色亮点为 活细胞，右图的白色亮点为死细胞。

图4为冷冻前、加冷冻保护液后以及冷冻后的细胞存活率统计图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细描述。

参照图1和图2，一种非接触式液滴法冷冻装置，包括密封盖1， 密封盖1与液滴容器2螺纹配合连接，液滴容器2底部开有一圆形通 孔，使用耐低温胶水将冷冻薄膜5粘接于液滴容器2底部，制冷剂容 器3上部开有一圆形通孔，使用耐低温胶水将制冷剂容器3上部与液 滴容器2底部相粘接，使冷冻薄膜5夹于两者之间，并用耐低温胶水 将三者之间的缝隙密封，液滴容器2和制冷剂容器3通过螺栓6和螺 母4进一步连接固定。

所述密封盖1、液滴容器2、制冷剂容器3均用耐低温材料制成， 耐低温材料包括聚四氟乙烯材料。

所述冷冻薄膜5用高导热材料制成，导热系数大于200W/(m·℃)， 高导热材料包括银、金、铜或铝。

所述冷冻薄膜5的厚度为20-200μm。

所述螺栓6和螺母4均采用耐低温材料，耐低温材料包括聚酰胺 纤维。

所述的冷冻装置能够冷冻细胞、细胞团或其他生物组织，冷冻方 法为：在配置细胞、细胞团或微生物组织悬液后，在其中加入二甲基 亚砜溶液或其他冷冻保护剂，用于在冷冻过程中将抑制细胞内冰晶的 长大，从而加速玻璃化固体的形成，

冷冻过程中，先旋开密封盖1，使液滴容器2侧朝上放置，然后 使用移液枪或细胞打印技术使得混有冷冻液的细胞悬液以液滴形式， 加在装置中心的冷冻薄膜5上，使其在冷冻薄膜5的表面呈点阵式布 置；

之后，将冷冻装置翻转，使得制冷剂容器3朝上，液滴容器2朝 下放置，由于表面张力的作用，冷冻薄膜5上的液滴将悬挂于冷冻薄 膜5表面；之后，将低温制冷剂匀速倾倒在冷冻装置的制冷剂容器3 内，使其在冷冻薄膜5表面沸腾气化，通过冷冻薄膜5的高导热能力， 将冷量传到液滴上，完成对液滴的玻璃化冷冻；

冷冻结束后，被冷冻的液滴仍留在液滴容器2中的冷冻薄膜5表 面，同时，冷冻装置用密封盖1将液滴容器2密封后，放入液氮中保 存，也能够整体转移运输。

下面以冷冻细胞为例，冷冻薄膜5采用银质薄膜，对冷冻方法进 行详细说明。一种非接触式液滴法冷冻装置的冷冻方法，包括以下步 骤：

1)细胞冷冻

1.1)配置细胞悬液，使其浓度为1×10⁴-1×10⁶cells/ml；

1.2)将冷冻装置消毒后，风干，等待加入细胞；

1.3)配置冷冻保护溶液，成分为：95％(v/v)细胞培养液+5％(v/v)二 甲基亚砜(DMSO)；

1.4)取2ml上述制备好的细胞悬液，离心后弃上清液，加入冷冻保 护液2ml，震荡使其混合均匀，配置成冷冻细胞悬液；

1.5)旋开密封盖1，使液滴容器2侧朝上放置；

1.6)用移液枪或细胞打印机将冷冻细胞悬液以液滴形式滴加在冷冻 装置的冷冻薄膜5上，液滴大小为5μl，在冷冻薄膜5上以点阵形式 排列；

1.7)将冷冻装置反置，使得制冷剂容器3朝上，液滴容器2朝下， 将低温制冷剂(液氮)匀速倒入制冷剂容器3内，使其在冷冻薄膜5 表面沸腾，完成对冷冻薄膜5另一面的细胞冷冻；

1.8)将冷冻装置的液滴容器2用密封盖1密封后，放入液氮中进行 储存，冷冻装置亦能够整体转移或运输；

2)细胞复苏

2.1)旋开密封盖1，并使冷冻装置的液滴容器2侧朝上放置；

2.2)将冷冻装置置于水浴锅内，在37℃温水中将细胞液滴解冻，待 其成为冰水混合物时，移出水浴锅；

2.3)将冷冻薄膜5上溶解后的液滴用移液枪转移到试管内，同时试 管内加入1ml培养液，震荡以稀释冷冻液；

2.4)将含有细胞的试管离心，弃上清液后，加入45μl培养液，得到 解冻后的细胞悬液。

为了进一步阐述所述冷冻装置和冷冻方法的优势，在上述冷冻细 胞方法的基础上，对NIH-3T3细胞做了非接触冷冻实验，并在冷冻 结束后，使用荧光染料对细胞进行死活染色，并在荧光显微镜下观察 统计死活细胞数量。使用本冷冻方法得到的细胞的存活率为84％± 1％。图3给出了冷冻后细胞的代表性死活染色图，其中左图的白色 亮点为活细胞，右图的白色亮点为死细胞。图4则给出了冷冻前、加 冷冻保护液后以及冷冻后的细胞存活率统计图。