一种杂交瘤细胞上清阶段微量抗体的筛选方法

摘要

本发明提供一种杂交瘤细胞上清阶段微量抗体的筛选方法，该筛选方法包括如下步骤：上清液预处理、上清液点样及后处理、上清液标记、点样测试、双抗体夹心检测。在杂交瘤法细胞上清阶段微量抗体时首先进行配对筛选，利用芯片的高灵敏及多通量的优点，避免大量的无目的的单抗纯化工作。制备这个种类的单克隆抗体时，可以使用这个方法预先筛选出配对甚至可以预筛临床检测效果好的配对抗体，再进行大规模制备，极大的提高了效率，降低了制备的成本及风险。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗体筛选方法，特别是一种杂交瘤细胞上清阶段微量抗体的 筛选方法。

背景技术

双抗体夹心法是临床体外诊断检测抗原最常用的ELISA方法，适用于检测 分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原的定量检测。其基本工作原理是：利 用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原 决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。

传统的经典双抗体夹心目标抗体筛选方法需要采用杂交瘤技术制备单克隆抗 体（简称单抗），在单抗纯化后通过ELISA方法和Western blotting测定抗体的 效价与特异性，还有抗体类型、相对亲和力测定，应用纯化的单抗建立双抗体夹 心ELISA检测方法筛选适合检测的配对抗体。传统方法制备单抗时，需要针对特 定免疫原的所有的阳性克隆进行扩大培养并进行单抗纯化。但是，制备出的单抗 并不一定能针对该免疫原进行双抗体夹心配对，制备存在一定的盲目性。即使筛 选出针对免疫原可以进行双抗体夹心配对的抗体，临床检测血清效果时也存在很 大的差异。

发明内容

本发明的目的是提供一种效率高、且可有目的地进行单抗纯化工作的杂交瘤 细胞上清阶段微量抗体的筛选方法，以解决现有技术中存在的问题。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种杂交瘤细胞上清阶段微量抗体的筛选方法，该筛选方法包括如下步骤：

（1）取细胞融合后所形成的杂交瘤细胞的培养上清液，通过盐析法去除杂质 后更换缓冲体系，获得预处理上清液；

（2）将步骤（1）中得到的预处理上清液中的抗体固定至微透镜阵列芯片；

（3）对步骤（2）的微透镜阵列芯片进行阳性反应，确认上清液中抗体活性 及在微透镜阵列芯片上的固定情况；

（4）将步骤（1）中得到的预处理上清液标记辣根过氧化物酶；

（5）使用免疫原及固定上清蛋白芯片对标记上清液分别进行双抗体夹心反应 筛选配对情况，然后通过复核、阴性对照确认、天然蛋白验证得出的适合的配对 上清。

如上所述的筛选方法，优选地，所述步骤（1）的具体操作方法是：a）取细 胞融合后所形成的杂交瘤细胞的培养上清液，向所述上清液加入上清液体积的 80%～150%的饱和硫酸铵溶液，在2～8℃条件下沉淀8～15h，在高速冷冻离心机 中，离心分离后得到沉淀物；b）所述沉淀物用0.4ml缓冲液溶解，用超滤管离心 分离，重复超滤2～6次后得到预处理上清液；

如上所述的筛选方法，优选地，所述步骤（2）的具体操作方法是：a）所述 步骤（1）获得的预处理上清液用点样缓冲液稀释5～20倍后点样至微透镜阵列芯 片；b）在25～37℃条件下孵育30～120min后用PBST洗板3～6次，加入封闭液， 在2～8℃条件下孵育8～15小时；

如上所述的筛选方法，优选地，所述步骤（3）的具体操作方法是：a）向所 述步骤（2）获得的微透镜阵列芯片加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠，在25～37℃ 条件下孵育30～120min后，PBST洗涤3～6次；b）使用化学发光扫描仪扫描得出 可反映上清液与微透镜阵列芯片的结合情况的图像；

如上所述的筛选方法，优选地，所述步骤（4）的具体操作方法是：将步骤（1） 中得到的预处理后上清液用过碘酸钠氧化法标记上辣根过氧化物酶；

如上所述的筛选方法，优选地，所述步骤（5）的具体操作方法是：a）将免 疫原用封闭液稀释至0.1～1μg/ml，加入步骤（2）处理过的微透镜阵列芯片的微孔 内，在25～37℃条件下孵育60～150min；b）PBST洗涤2～6次；c）在微透镜阵列 芯片的微孔内加入用封闭液5～20倍稀释的步骤（3）处理的辣根过氧化物酶标记 上清液的，25-37℃孵育60～150min；d）PBST洗涤5～8次；e）使用化学发光扫 描仪扫描，得出图像；f）根据图像，微透镜阵列芯片上有光信号的点所对应的上 清液即为可以配对的上清液；g）得出的配对上清液重复步骤（6）中的a)～e)的 反应，同时在进行步骤a)时增加以封闭液代替免疫原进行反应的阴性对照；当阴 性对照微透镜阵列芯片无光信号，且免疫原反应有信号时，确定配对信息的真实 有效；h）对于筛选出的配对上清，使用天然蛋白质代替免疫原重复步骤（6）中 的a)～e)的反应，得出光信号的数值与临床检测浓度线性拟合评价，筛选出最适 合临床检测的配对上清信息。

如上所述的筛选方法，优选地，所述步骤（1）中离心分离操作的离心力是 10000～15000g，运行时间是10～30min。

如上所述的筛选方法，优选地，所述超滤管的截留分子量小于上清液中抗体 的分子量。

如上所述的筛选方法，优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲 液的浓度为0.01mol/L，pH为7.2。

如上所述的筛选方法，优选地，所述点样缓冲液为碳酸盐（CBS）和30%甘 油的混合物，所述CBS浓度为0.05mol/L。

如上所述的筛选方法，优选地，所述封闭液为磷酸盐缓冲液与牛血清白蛋白 混合物，该磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为7.2，牛血清白蛋白与磷酸盐 缓冲液的质量体积比为1：100～5：100。

本发明的有益效果为：

常规方法制备抗体时，需要将针对免疫原所有的阳性克隆扩大培养，获得足 够多的细胞上清液后进行蛋白纯化，利用纯化的蛋白进行相关的测试。而且，如 果测试结果不理想，需要重复免疫、细胞培养、抗体纯化、测试的过程来获得优 质的抗体，制备周期长，耗费成本高。本发明在阳性克隆细胞上清中微量抗体时， 利用微透镜阵列芯片的高灵敏及多通量的优点，首先进行相关测试，筛选出配对 效果好的阳性克隆，再进行扩大培养及蛋白纯化，避免了盲目的扩大培养及蛋白 纯化工作，可以将目前传统的制备时间缩短一倍甚至更多，极大的提高了效率， 并且降低了制备的成本及风险。

附图说明

图1为杂交瘤细胞上清阶段微量抗体的筛选方法的流程图；

图2为上清液点样至微透镜阵列芯片上的示意图；

图3为微透镜阵列芯片上清固定阳性测试的示意图；

图4为一个上清的免疫原配对示意图；

图5为本发明实施例1中上清的天然蛋白配对示意图；

图6为上清液与微透镜阵列芯片的结合情况的示意图；

图7为本发明实施例2中上清的天然蛋白配对示意图。

具体实施方式

杂交瘤细胞上清阶段微量抗体的筛选方法的流程图见图1，下面结合附图对 本发明方法做进一步说明。

实施例1：杂交瘤细胞上清阶段微量抗体的筛选

1、取细胞融合后所形成的杂交瘤细胞的培养上清液，通过盐析法去除杂质后 更换缓冲体系，获得预处理上清液，具体步骤如下：

a)29份细胞上清液分别加入等体积饱和硫酸铵溶液，4℃沉淀15小时， 12000g离心10min，弃上清液得到沉淀物；

b)沉淀物分别用浓度为0.01mol/L，pH为7.2的磷酸盐缓冲液溶解后，分别 置于容积为0.5ml，分子量为50KD的millipore超滤管，12000g离心分离10min， 重复超滤2次后得到预处理上清液；

2、将步骤1预处理上清抗体固定至微透镜阵列芯片：

a)所述步骤1预处理上清液使用点样缓冲液稀释10倍后使用GSD1800点样 仪点样至微透镜阵列芯片的58个位置（即29份杂交瘤细胞上清液，每份做两个 平行），如图2所示，所述点样缓冲液为CBS和30%甘油的混合物，所述CBS 浓度为0.05mol/L；

b)37℃孵育30min，用PBST洗板3次；加入封闭液4℃封闭8小时备用； 所述PBST的配制方法为：向浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中加入体积为磷酸 盐缓冲液体积的万分之五的吐温20；所述封闭液为磷酸盐缓冲液与牛血清白蛋白 混合物，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为7.2，牛血清白蛋白与磷酸 盐缓冲液质量体积比为5：100。

3、对步骤2中微透镜阵列芯片上清固定情况进行确认：

a)向步骤2中点样后向微透镜阵列芯片加入用封闭液按体积比1：1000稀释 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠（注：每份做一个平行样，另一个平行样用于做步骤 5，这种辣根过氧化物酶标记羊抗鼠采用武汉博士德公司BA1050，37℃孵育30min 后，PBST洗涤3次；

b)使用GSS2400化学发光扫描仪扫描得出可反映上清液与微透镜阵列芯片 的结合情况的图像，如图3所示；

4、预处理上清标记辣根过氧化物酶：将预处理后的29份上清液用过碘酸钠 氧化法分别标记上HRP。

5、使用免疫原对上清液进行双抗体夹心反应筛选配对情况，然后通过复核、 阴性对照确认、天然蛋白验证得出的适合的配对上清：

a)将免疫原使用封闭液稀释至0.5μg/ml，加入步骤2点样的微透镜阵列芯片 内，37℃反应60,min；

b)PBST洗涤3次；

c)在每个孔加入一种用封闭液稀释10倍的对应步骤4辣根过氧化物酶上清 液标记抗体，37℃反应60min；

d)PBST洗涤6次；

e)使用GSS2400化学发光扫描仪扫描，得出图像；

f)根据分析结果，得出可以配对的标记上清编号，重复这个标记上清的反应， 同时做阴性对照，确定配对信息的真实有效；

g)对于确定的配对上清，进行天然蛋白（例如临床血清）的评价，筛选出适 合临床检测的配对信息，如图4、图5所示。

实施例2：

1、取细胞融合后所形成的杂交瘤细胞的培养上清液，通过盐析法去除杂质后 更换缓冲体系，获得预处理上清液：

a)20份细胞上清液分别加入上清体积的150%的饱和硫酸铵溶液，4℃沉淀8 小时，12000g离心10min，弃上清液得到沉淀物；

b)沉淀物分别用浓度为0.01mol/L，pH为7.2的磷酸盐缓冲液溶解后，分别 置于容积为0.5ml，分子量为50KD的millipore超滤管，12000g离心分离10min， 重复超滤2次后得到预处理上清液；

2、将步骤1中预处理上清蛋白固定至微透镜阵列芯片，具体步骤如下：

a)所述步骤1预处理上清液使用点样缓冲液稀释5倍后使用GSD1800点样 仪点样至微透镜阵列芯片的60个位置，所述点样缓冲液为CBS和30%甘油的混 合物，所述CBS浓度为0.05mol/L；

b）25℃孵育60min，用PBST洗板6次；加入封闭液4℃封闭15小时备用； 所述PBST的配制方法为：向浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中加入体积为磷酸 盐缓冲液体积的万分之五的吐温20；所述封闭液为磷酸盐缓冲液与牛血清白蛋白 混合物，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为7.2，牛血清白蛋白与磷酸 盐缓冲液质量体积比为：1:100。

3、对步骤2中微透镜阵列芯片上清固定情况进行确认，具体步骤如下：

a)向对步骤2中点样后向微透镜阵列芯片加入用封闭液按体积比1：1000稀 释酶标记羊抗鼠，这种辣根过氧化物酶标记羊抗鼠采用武汉博士德公司BA1050， 25℃孵育60min后，PBST洗涤6次；

b)使用GSS2400化学发光扫描仪扫描得出可反映上清液与微透镜阵列芯片 的结合情况的图像，如图6所示；

4、将步骤1中预处理上清标记辣根过氧化物酶：

将步骤1中将预处理后的20份上清液用过碘酸钠氧化法分别标记上辣根过氧 化物酶。

5、使用免疫原对上清液进行双抗体夹心反应筛选配对情况，然后通过复核、 阴性对照确认、天然蛋白验证得出的适合的配对上清，具体步骤如下：

a)将免疫原使用封闭液稀释至1μg/ml，加入步骤2中点样的微透镜阵列芯片 内，25℃反应150min；

b)PBST洗涤6次；

c)在每个孔加入一种用封闭液稀释20倍的对应步骤4辣根过氧化物酶标记 的上清液抗体，25℃反应150min；

d)PBST洗涤8次；

e)使用GSS2400化学发光扫描仪扫描，得出图像；

f)根据分析结果，得出可以配对的标记上清编号，重复这个标记上清的反应， 同时做阴性对照，确定配对信息的真实有效；

h)对于确定的配对上清，进行天然蛋白（例如临床血清）的评价，筛选出适 合临床检测的配对信息，如图7所示。