利用龙眼铁氧还蛋白基因转化兰科植物提高抗病力的方法

摘要

本发明提供一种利用龙眼铁氧还蛋白基因转化兰科植物提高抗病力的方法，属于基因工程技术领域。利用转基因技术将龙眼铁氧还蛋白基因Dlfd3(登录号：JF733784)导入兰科植物文心兰，所获转化植株表现更高的移栽成活率和对抗病害的能力。与野生型植株相比，转基因植株抵抗软腐病能力提高，由高感软腐病（Di=100）提升为中抗软腐病(Di=27.5)，移栽成活率由79.3%提高至95.7%,均达极显著差异水平。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种利用龙眼铁氧还蛋白基因转化兰科植物提高抗病力的方法，具体涉及龙眼铁氧还蛋白基因的应用及兰花育种。

背景技术

文心兰（Oncidium）又名舞女兰、金蝶兰、瘤瓣兰等，是重要的盆切花经济栽培品种。文心兰易患软腐病(Soft rot)，在组培苗的移栽阶段，软腐病更能带来毁来性的打击。目前，该病没有特别有效的防治方法，因此选育抗软腐病文心兰品种的是文心兰育种的重要课题。文心兰可以进行广泛的属内杂交和属间杂交，但无论属内杂交还是属间杂交其亲和力都差，在自然条件下结果较为罕见，难以利用传统的育种方法改变某些品种的单一性状，因而利用转基因技术快速提升文心兰经济栽培性状成为文心兰育种的重要手段。

 铁氧还蛋白基因（ferredoxin，fd）基因作为一个大的基因家族在植物中普遍存在，植物FD蛋白多为[2Fe-2S]类型，在光合作用PSI系统中参与电子传递，作为Ferredoxin-NAD(P)(+) oxidoreductase (FNR)的电子供体参与NADP的再生，与植株体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的累积密切相关。由于ROS在植物抗性的产生中起信号传导和超敏反应 (hypersensitive response，HR)及细胞程序性死亡 (programmed cell death，PCD)能源来源的双重作用，现已证实源自甜椒（Capsicum annuum）的类铁氧还蛋白基因（pflp）可帮助水稻、烟草、拟南芥以及文心兰在内的许多植物获得广谱抗性，但转化定位不同亚细胞器fd基因对植株能否产生抗病性有重要影响。

此前，我们以龙眼胚性愈伤组织转录组数据为基础，分离克隆6个不同类型铁氧还蛋白NCBI GenBank基因登录号分别为JF733781、JF733783、JF733784、JF733785、JF733787、JF733788、JX996183，其中，获得cDNA全长的为JF733784、JF957855、JF957858、JF957857，分别命名为Dlfd3、DlMFDX1、Dlfdc1、DlMFDX2。进化树分析显示， Dlfd3、Dlfdc1与甜椒pflp基因有一定的同源性，可能在提高植物抗病性方面具有生理作用。此前，有关类铁氧还蛋白基因提高植物抗病性方面仅见源自甜椒的类铁氧还蛋白被报道，源自其他物种的不同类型的fd基因是否且有提高抗病性功能仍未知。本发明通过将源自龙眼的两个铁氧还蛋白基因Dlfd3、Dlfdc1利用农杆菌介导技术导入文心兰切花栽培种南茜（Onc.Gower Ramsey）原球茎（protocorm-like body，PLB）, 成功获得了转化植株，经软腐病（soft rot）接菌试验，发现转化Dlfd3基因文心兰植物可以显著提高文心兰种苗抗软腐病能力。

 发明内容：

本发明的目的是提供一种利用龙眼铁氧还蛋白基因转化兰科植物提高抗病力的方法，利用转基因技术将龙眼铁氧还蛋白基因Dlfd3导入兰科植物，提高转化植株对抗病害的能力。其中所述的兰科植物为文心兰或石斛兰，优选文心兰。所抵抗病害为软腐病。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用龙眼铁氧还蛋白基因转化兰科植物提高抗病力的方法，利用转基因技术将龙眼铁氧还蛋白基因Dlfd3，NCBI GenBank基因登录号：JF733784，导入兰科植物，获得具有抗病害能力的转化植株。

    所述的兰科植物为文心兰或石斛兰。

所述抗病害为软腐病。

 本发明的有益效果：

1、本发明通过系统研究，首次克隆了龙眼铁氧还蛋白基因Dlfd3及Dlfdc1 cDNA全长。

2、利用转基因技术将龙眼铁氧还蛋白导入兰科植物，可以显著提高兰科植物的移栽成活率。

3、利用转基因技术将龙眼铁氧还蛋白导入兰科植物，可以显著提高兰科植物的抵抗软腐病的能力。

 附图说明：

图1 载体结构图。

图2 转化Dlfd3/ Dlfdc1植株的PCR鉴定。其中，A为转化Dlfdc1植株，B为转化Dlfd3植株；取筛选培养后的生根苗叶片进行转化后PCR鉴定。在500bp左右呈现阳性条带的为整合外源基因植株。

图3 转化Dlfd3植株移栽对比试验。生根苗生长至6 cm以上进行移栽，每个处理移栽128株，重复3次，移栽2个月后统计成活率。超表达Dlfd3阳性植株移栽成活率显著高于野生型。其中WT: 野生型，E2: 超表达Dlfdc1阳性植株，E3：超表达Dlfd3阳性植株。

图4转化Dlfd3/ Dlfdc1植株移栽抗软腐病能力试验。超表达Dlfd3阳性植株移栽抗软腐病能力显著高于野生型。其中WT: 野生型，E2: 超表达Dlfdc1阳性植株，E3：超表达Dlfd3阳性植株。

具体实施方式

实施例1   

1、Dlfd3/ Dlfdc超表达载体构建

利用 Trizol^TM 试剂盒（Ivitrogen）提取龙眼胚性愈伤组织 RNA，利用 RevertAidTM First-Strand Synthesis System (Fermantas)合成 cDNA第一链。

根据龙眼铁氧还蛋白基因Dlfd3、Dlfdc1设计带限制性内切酶位点Bgl II、Spe I的上下游相应引物Dlfd3 F: 5’-GA AGATC TATGGCAACT GTGACCCTTAG-3’，Dlfd3 R: 5’-GG ACTAGT GTAAAGTTCG CCTTCCTTGTG-3’；Dlfdc1 F: 5’-GA AGATCT ATGG CAACACTTCACTTCAG-3’，Dlfdc1 R: 5’-GG ACTAGT ATCATCAGCA GTTGCCAGTTG-3’。 25μL PCR 反应体系：10 X PCR buffer ( plus Mg ²⁺) 2.5 μL，dNTPs ( 2.5 mmol·L^-1) 0.5 μL, 正向引物 (10 μmol·L^-1)  1 μL，反向引物( 10 μmol·L^-1 ) 1 μL，Taq( 5 U ·μL^-1) 0.2 μ L，ddH₂O 18.8 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性4 min, 94 ℃变性45 s, 54 ℃退火45 s，72 ℃延伸40 s，设35个循环， 最后72 ℃延伸10 min。1.0% (W/V)琼脂糖电泳检测 PCR产物，回收 500 bp 左右条带，导入PMD18-T（TAKARA）构建PMD18-T质粒。利用Fermentas FastDigest （Thermo Fisher Scientific）限制性内切酶Bgl II、Spe I双酶切pCAMBIA1302及PMD18-T-Dlfd3/Dlfdc1质粒，回收酶切质粒及500bp左右小片段，利用T4连接酶将龙眼Dlfd3/Dlfdc1基因导入pCAMBIA1302（p1302），构建p1302::Dlfd3/ Dlfdc1质粒，构建好的质粒经PCR检测，导入大肠杆菌感受态DH5α（TIANGEN），于含安苄青霉素50 mg·L^-1 LB固体培养基涂板，阳性菌株送华大基因测序，检测剪接正确性，完成双元表达载体p1302::Dlfd3/ Dlfdc1的构建（见图1）。

 2、农杆菌的制备

利用小量质粒提取试剂盒（TIANGEN）提取大肠杆菌DH5α中p1302::Dlfd3/ Dlfdc1质粒，利用钙通道法将质粒转化EHA105农杆菌感受态，于含卡那霉素及链霉素均为75mg/L YEB 固体培养基涂板，挑取阳性克隆子，于含卡那霉素及链霉素均为75mg/L YEB 液体培养基，置于摇床，28℃，250rpm，培养至OD600 =0.4，备用。

 3、文心兰的转化

       以继代 35 d PLB为培养材料，将 PLB置于 0.5M蔗糖MS液体培养基，置于 80 RPM摇床，高渗处理 2 h，再通过 3 d黑暗条件下预培养，将预处理后 PLB材料置于以MS液体培养基重悬的浓度为OD600=1.0的EHA105农杆菌菌液进行侵染 30min，置于 MS培养基黑暗条件下共培养 3d，以 200 mg/L  头孢（cefatoxime）洗菌 20 min，并转移至含 50 mg/L头孢  MS培养基，25℃，16h /d光照进行二阶共培养，30 d后转入含 5 mg·L^-1潮霉素筛选培养基，25℃，16h /d光照，培养 45d, 重复筛选培养 3 次，将抗性植株转入普通生根培养基培养 60 d，移栽至水草待测。

 4、转化后植株PCR检测

利用CTAB法提取转化后文心兰叶片基因组DNA。通过PCR检测目的基因条带验证T-DNA是否导入植株。PCR反应体系及反应条件同上。经检测，转Dlfdc1基因的11株侍测株有7棵植株有阳性条带，转Dlfd3基因的11株侍测株有8棵植株有阳性条带。

5、转化后植株的抗病性检测(见图2)。

       参照尹俊梅等方法，选取文心兰软腐病病叶，75%乙醇表面灭菌后挑取病健结合部组织液于NA固体培养基划板，挑取的单菌落于NA液体培养基置于摇床，28℃，250rpm，摇菌过夜，挑取有致病力菌液用于抗病性检测。利用10μL 枪头蘸取菌液，于第二片真叶表面打孔，以不穿透叶片为度，接种10 d后观察发病情况。参照尹俊梅等【尹俊梅，任羽，杨光穗，editors (2008) 石斛兰种质资源描述规范和数据质量控制规范.北京，统计发病指数.】方法，统计发病指数。经对比发现，与野生型植株相比，转Dlfd3基因植株抵抗软腐病能力提高，由高感软腐病（Di=100）提升为中抗软腐病(Di=27.5)(见图3，移栽成活率由79.3%提高至95.7%（见图4），达极显著差异水平。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  福建农林大学、三明农业科学研究院

 

<120>  利用龙眼铁氧还蛋白基因转化兰科植物提高抗病力的方法

 

<130>  4

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gaagatctat ggcaactgtg acccttag                                        28

 

 

<210>  2

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ggactagtgt aaagttcgcc ttccttgtg                                       29

 

 

<210>  3

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

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<210>  4

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

ggactagtat catcagcagt tgccagttg                                       29