一种检测HIV-1对酶抑制剂抗性的基因芯片及试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测HIV-1对逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂抗性的基因芯片及试剂盒。本发明公开的一组寡核苷酸探针的序列如SEQ ID No.1-SEQ ID No.126所示。本发明的基因芯片和试剂盒可同时检测中国境内的HIV-1对逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂是否耐药及耐药程度，该基因芯片和试剂盒操作简便、准确性高、通量大、耗时短，为协助临床及时掌握HIV的治疗效果并制定治疗方案提供参考。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测HIV-1对逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂抗性的基因芯片及 试剂盒。

背景技术

获得性免疫缺陷综合症（Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS），俗称艾 滋病，是以人类某些种类淋巴细胞为宿主的HIV引起的一种传染病。HIV感染后会破 坏易感淋巴细胞，使患者免疫系统功能减弱，致使对其它细菌、病毒及肿瘤丧失抵抗 力，最终由于感染或肿瘤导致患者死亡。自1985年中国发现首例艾滋病病人以来，我 国艾滋病感染人数逐年上升，中国疾病预防控制中心艾滋病预防控制中心数据显示， 中国累计报告艾滋病病毒感染者和病人43.4万，其中死亡8.8万。据联合国艾滋病规 划署、世界卫生组织和卫生部联合专家组评估，截止2011年年底，估计中国艾滋病感 染者和病人78万，其中存活艾滋病病人15.4万，当年新感染4.8万，死亡2.8万。

HIV属于逆转录病毒科（Retroviridae），慢病毒属（Lentivirus）。全球流行的 HIV根据血清型和病毒核酸序列分类可分为HIV-1和HIV-2两型。HIV颗粒直径约120nm， 大致呈球形。HIV外膜是类脂包膜，并嵌有病毒蛋白gp120和gp41，内部由病毒蛋白 p17形成的球形基质（Matrix）及p24形成的半锥形衣壳（Capsid），衣壳内部包含有 病毒的基因组和逆转录酶、整合酶和蛋白酶及其它成分。HIV的基因组为两条相同的 正链RNA，每条长约9.2-9.8kb，编码至少9个蛋白，两端是长末端重复序列（long  terminal repeats），含有顺式调控序列，控制前病毒的表达。基因组中的pol基因编 码聚合酶前体蛋白，聚合酶前体蛋白经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核 酸酶H，这些酶均为病毒增殖所必需。

抗HIV药物是目前唯一延缓艾滋病疾病进展以及降低艾滋病死亡率的有效治疗手 段。在抗HIV药物的开发过程中，逆转录酶最先成为抗病毒的靶点。目前已有多种逆 转录酶抑制剂应用于临床治疗，主要分为两类，核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）和非 核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）。其中NRTIs是最先问世的一类药物，临床证实对 HIV复制具有很强的抑制作用，其结构与核苷类似，为双脱氧核苷衍生物，可与细胞 内核苷竞争性地结合逆转录酶，从而终止逆转录反应；NNRTIs是一类通过与HIV逆 转录酶聚合位点附近的疏水结合口袋结合而发生作用的药物小分子，通过这种结合终 止逆转录反应。随着抗HIV药物的发展，蛋白酶抑制剂也发展起来。蛋白酶主要作用 是将病毒复制中产生的前体蛋白裂解，成为有活性的病毒结构蛋白和有活性的酶。蛋 白酶抑制剂属于多肽类化合物，可竞争性或非竞争性地抑制蛋白酶活性，导致蛋白前 体不能裂解和形成成熟的病毒颗粒。

随着抗艾滋病毒药物的广泛应用，随之而来的耐药问题已成为全球性的公共卫生 问题。如果耐药毒株一旦形成，在发展中国家缺乏二线药物的现实基础上，意味着被 拯救的生命再次陷入死亡的境地，多年来抗病毒治疗来之不易的成果将毁于一旦。中 国自2003年开始在全国范围内实施免费的抗艾滋病病毒治疗，到2010年10月底接受 治疗人数已超过10万人，但接受耐药检测的尚不足万人，大量即将或正在接受抗病毒 治疗的感染者迫切需要及时准确的耐药检测。耐药检测对于感染者个体而言，可以适 时地调整用药方案，收到最优治疗效果，避免承受不必要的副作用。对于艾滋病防治 的大局而言，及早发现耐药株并及时调整用药方案，将大大减少耐药株的传播几率， 一方面减少耐药株传播造成缺少可用的药物的情况发生，一方面可使有限的医疗资源 更合理地配置，减少浪费。可见，及时准确地检测耐药发生情况，是实现艾滋病可持 续性治疗的关键问题。

现有HIV耐药检测技术分为两大类。

第一类是表型耐药检测，经典的表型耐药检测方法需要分离病毒，一般需要8-12 周时间，重复性差，不适合临床应用。改进后的重组病毒表型耐药检测方法能直接测 出HIV-1对药物的敏感度，并能揭示事先存在或交叉耐药的情况，检测需2-3周，但 是对环境及人员要求高，且非常昂贵。

第二类是基因型耐药检测，是通过分子生物学方法扩增病人HIV-1药物靶点周围 基因，以基因测序和序列分析技术或杂交技术确定病毒变异位点，与大型数据库中已 知的耐药基因变异数据相比较，间接地估计耐药与否及耐药程度。其中DNA序列分析 是最精确的方法，但耗时约1周，检测通量小，对环境及人员要求高，分析基因型耐 药结果时，需要掌握大量相关知识，如突变与抗病毒药物及其它药物的交叉耐药等， 才能对结果进行正确的评价。

基因芯片是指将许多特定的寡核苷酸片段作为探针，以原位合成法或合成点样法 有规律地排列固定在支持物表面，形成DNA探针微阵列，然后将标记的样品与DNA探 针微阵列杂交，按照碱基配对原理，最匹配的探针将结合最多的标记物，获得最强的 检测信号。以玻璃为固相载体支持物，以荧光基团为标记物的样品信号可以适应自动 化的检测系统，进行自动分析。基因芯片技术可实现对生物样品快速、高通量地检测， 并可使用自动化的检测系统。现有的基因芯片仅针对逆转录酶耐药性进行分析，并且 由于HIV复制过程中的高突变性，核酸序列多态性明显，致使大量探针结合程度低， 信号无法识别，临床适用性不强。

目前艾滋病治疗最为有效的办法是鸡尾酒疗法，通常会从核苷类逆转录酶抑制剂、 非核苷类逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂中选择几种组合使用，而对于不同类的药物 都需要做出耐药分析后才能够制定药物的组合，以便能够达到最好的治疗效果。为适 应艾滋病抗病毒治疗的现状，开发一种能同时覆盖逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂耐 药性检测的基因芯片成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测HIV-1对逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂抗性的基 因芯片及试剂盒。

本发明提供的一组寡核苷酸探针，该组寡核苷酸探针的序列如SEQ ID No.1-SEQ  ID No.126所示；

所述SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的寡核苷酸 探针序列检测HIV-1蛋白酶_10_L野生型位点；

所述SEQ ID No.5所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶_46_M野生型位点；

所述SEQ ID No.6所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶M46I突变型位点；

所述SEQ ID No.7所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶M46L突变型位点；

所述SEQ ID No.8所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶L10R突变型位点；

所述SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶 _63_L野生型位点；

所述SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.16所示的寡核苷酸探针序列检 测HIV-1蛋白酶L63P突变型位点；

所述SEQ ID No.13所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶_82_V野生型位点；

所述SEQ ID No.14所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶V82I突变型位点；

所述SEQ ID No.15所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶V82T突变型位点；

所述SEQ ID No.17和SEQ ID No.21所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶 _84_I野生型位点；

所述SEQ ID No.18和SEQ ID No.22所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶 I84V突变型位点；

所述SEQ ID No.19和SEQ ID No.23所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶 _90_L野生型位点；

所述SEQ ID No.20和SEQ ID No.24所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶 L90M突变型位点；

所述HIV-1蛋白酶的野生型位点为不耐HIV-1蛋白酶抑制剂的位点；

所述HIV-1蛋白酶的突变型位点为耐HIV-1蛋白酶抑制剂的位点；

所述SEQ ID No.25和SEQ ID No.29所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶_41_M野生型位点；

所述SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31所示的寡核 苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶M41L突变型位点；

所述SEQ ID No.28和SEQ ID No.36所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶_65_K野生型位点；

所述SEQ ID No.32和SEQ ID No.40所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶K65R突变型位点；

所述SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶_62_A野生型位点；

所述SEQ ID No.35所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶A62V突变型位 点；

所述SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.41和SEQ ID No.42所示的寡核 苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_67_D野生型位点；

所述SEQ ID No.39和SEQ ID No.43所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶D67N突变型位点；

所述SEQ ID No.44所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_75_V野生型位 点；

所述SEQ ID No.45和SEQ ID No.46所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶_74_L野生型位点；

所述SEQ ID No.47所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶L74V突变型位 点；

所述SEQ ID No.48所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶V75I突变型位 点；

所述SEQ ID No.49、SEQ ID No.52和SEQ ID No.53所示的寡核苷酸探针序列检 测HIV-1逆转录酶_103_K野生型位点；

所述SEQ ID No.50和SEQ ID No.54所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶K103N突变型位点；

所述SEQ ID No.51和SEQ ID No.55所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶K103S突变型位点；

所述SEQ ID No.56、SEQ ID No.60所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶 _70_K野生型位点；

所述SEQ ID No.57和SEQ ID No.61所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶K70R突变型位点；

所述SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.63和SEQ ID No.65所示的寡核 苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶K101E突变型位点；

所述SEQ ID No.62和SEQ ID No.64所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶_101_K野生型位点；

所述SEQ ID No.66和SEQ ID No.70所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶_106_V野生型位点；

所述SEQ ID No.67和SEQ ID No.71所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶V106I突变型位点；

所述SEQ ID No.68和SEQ ID No.72所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶V106A突变型位点；

所述SEQ ID No.69所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_151_Q野生型 位点；

所述SEQ ID No.73所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶Q151M突变型位 点；

所述SEQ ID No.74、SEQ ID No.75和SEQ ID No.76所示的寡核苷酸探针序列检 测HIV-1逆转录酶_108_V野生型位点；

所述SEQ ID No.77所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶V108I突变型位 点；

所述SEQ ID No.78和SEQ ID No.82所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶_116_F野生型位点；

所述SEQ ID No.79和SEQ ID No.83所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶F116Y突变型位点；

所述SEQ ID No.80和SEQ ID No.84所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶_181_Y野生型位点；

所述SEQ ID No.81和SEQ ID No.85所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶Y181C突变型位点；

所述SEQ ID No.86和SEQ ID No.90所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶_184_M野生型位点；

所述SEQ ID No.87和SEQ ID No.91所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶M184V突变型位点；

所述SEQ ID No.88和SEQ ID No.92所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶M184I突变型位点；

所述SEQ ID No.89和SEQ ID No.93所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶_190_G野生型位点；

所述SEQ ID No.94和SEQ ID No.98所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录 酶_188_Y野生型位点；

所述SEQ ID No.95、SEQ ID No.96、SEQ ID No.99和SEQ ID No.100所示的寡核 苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶Y188L突变型位点；

所述SEQ ID No.97所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶G190A突变型位 点；

所述SEQ ID No.101所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶G190S突变型 位点；

所述SEQ ID No.102、SEQ ID No.103、SEQ ID No.104、SEQ ID No.106SEQ ID No.107 和SEQ ID No.108所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_210_L野生型位点；

所述SEQ ID No.105和SEQ ID No.109所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转 录酶L210W突变型位点；

所述SEQ ID No.110和SEQ ID No.111所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转 录酶_215_T野生型位点；

所述SEQ ID No.112所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶T215Y突变型 位点；

所述SEQ ID No.113所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶T215F突变型 位点；

所述SEQ ID No.114和SEQ ID No.115所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转 录酶_179_V野生型位点；

所述SEQ ID No.116所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶V179D突变型 位点；

所述SEQ ID No.117所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_219_K野生型 位点；

所述SEQ ID No.118所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶K219Q突变型 位点；

所述SEQ ID No.119所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶K219E突变型 位点；

所述SEQ ID No.120所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_221_H野生型 位点；

所述SEQ ID No.121和SEQ ID No.122所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转 录酶_227_F野生型位点；

所述SEQ ID No.123所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶F227L突变型 位点；

所述SEQ ID No.124和SEQ ID No.126所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转 录酶H221Y突变型位点；

所述SEQ ID No.125所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_221_H野生型 位点；

所述HIV-1逆转录酶的野生型位点为不耐HIV-1逆转录酶抑制剂的位点；

所述HIV-1逆转录酶的突变型位点为耐HIV-1逆转录酶抑制剂的位点；

所述野生型位点中，数字代表氨基酸的位置，数字后面的字母表示此位置的氨基 酸残基种类；

所述突变型位点中，中间的数字代表突变氨基酸的位置，数字前面的字母表示此 位置氨基酸突变前的氨基酸残基种类，数字后面的字母表示此位置氨基酸突变后的氨 基酸残基种类，以HIV-1蛋白酶L10R突变型位点和HIV-1逆转录酶M41L突变型位点 为例，L10R的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位氨基酸由L突变为R，M41L的意 思是HIV-1病毒的逆转录酶的第41位氨基酸由M突变成L。

所述寡核苷酸探针大小均为15-50个核苷酸，优选15-30个核苷酸。

上述寡核苷酸探针中，所述寡核苷酸探针的5’端用NH₂-（T）n修饰，其中（T） n表示n个寡聚dT，其中n为10-35，优选15-25，具体为20。

一种用于检测HIV-1中与逆转录酶抑制剂耐药性和/或蛋白酶抑制剂耐药性相关 的突变位点的基因芯片也属于本发明的保护范围，该基因芯片包含固相载体和设于固 相载体上的探针；

所述固相载体为硅片、用功能基团修饰的玻片或用功能基团衍生的膜；

所述功能基团具体为醛基基团；

所述设于固相载体上的探针包含上述任一所述的寡核苷酸探针组；

所述耐药性的相关突变位点如下：L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V、L90M、 M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、V106I/A、V108I、 F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、 H221Y和F227L；

所述L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V和L90M为HIV-1蛋白酶中与HIV-1蛋 白酶抑制剂耐药性相关的突变位点；

所述M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、V106I/A、 V108I、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、 K219Q/E、H221Y和F227L为HIV-1逆转录酶中与HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性相关的 突变位点；

所述突变位点中，中间的数字代表突变氨基酸的位置，数字前面的字母表示此位 置氨基酸突变前的氨基酸残基种类，数字后面的字母表示此位置氨基酸突变后的氨基 酸残基种类，以HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点L10R和HIV-1逆转录酶抑 制剂耐药性相关的突变位点M41L为例，L10R的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位 氨基酸由L突变为R，M41L的意思是HIV-1病毒的逆转录酶的第41位氨基酸由M突变 成L；

所述逆转录酶抑制剂为HIV-1核苷类逆转录酶抑制剂和/或HIV-1非核苷类逆转录 酶抑制剂。

上述基因芯片中，所述设于固相载体上的探针还包含表面化学质控探针和杂交质 控探针，所述表面化学质控探针如SEQ ID No.130所示，所述杂交质控探针如SEQ ID  No.131所示。

所述表面化学质控探针的5’端用荧光基团-（T）m修饰，3’端被NH₂修饰，（T） m表示m个寡聚dT，m为10-35，优选15-25，具体为20，荧光基团具体为HEX；

所述杂交质控探针的5’端被NH₂-（T）k修饰，（T）k表示k个寡聚dT，k为 10-35，k具体为20。

一种用于检测HIV-1中与逆转录酶抑制剂耐药性和/或蛋白酶抑制剂耐药性相关 的突变位点的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述任一所述的探针或 上述任一所述的基因芯片和引物组；

所述引物组由三条引物组成，其序列分别如SEQ ID No.127、SEQ ID No.128和 SEQ ID No.129所示；

所述SEQ ID No.127为正向引物，SEQ ID No.128和SEQ ID No.129为反向引物；

所述正向引物在PCR体系中的浓度是上述任一所述反向引物在PCR体系中浓度的 2-10倍，具体为8倍；

所述引物的大小均为15-50个核苷酸，优选15-40个核苷酸；

所述正向引物的5’端用荧光基团标记，荧光基团具体为TAMRA。

所述耐药性的相关突变位点如下：L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V、L90M、 M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、V106I/A、V108I、 F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、 H221Y和F227L；

所述L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V和L90M为HIV-1蛋白酶中与HIV-1蛋 白酶抑制剂耐药性相关的突变位点；

所述M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、V106I/A、 V108I、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、 K219Q/E、H221Y和F227L为HIV-1逆转录酶中与HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性相关的 突变位点；

所述突变位点中，中间的数字代表突变氨基酸的位置，数字前面的字母表示此位 置氨基酸突变前的氨基酸残基种类，数字后面的字母表示此位置氨基酸突变后的氨基 酸残基种类，以HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点L10R和HIV-1逆转录酶抑 制剂耐药性相关的突变位点M41L为例，L10R的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位 氨基酸由L突变为R，M41L的意思是HIV-1病毒的逆转录酶的第41位氨基酸由M突变 成L；

所述逆转录酶抑制剂为HIV-1核苷类逆转录酶抑制剂和/或HIV-1非核苷类逆转录 酶抑制剂。

上述试剂盒中，所述试剂盒还包含PCR扩增试剂、杂交缓冲液、芯片洗涤液Ⅰ以 及芯片洗涤液Ⅱ和产品说明书；

所述PCR扩增试剂由ddH₂O、PCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶组成；

所述杂交缓冲液由SSC、Denhardt's液、硫酸葡聚糖、十二烷基硫酸钠、SEQ ID  No.132所示的DNA分子和ddH₂O组成；

所述SSC在杂交缓冲液中的浓度为3.33×，Denhardt's在杂交缓冲液中的浓度为 8.33×，硫酸葡聚糖在杂交缓冲液中的浓度为4.17%，十二烷基硫酸钠在杂交缓冲液 中的浓度为0.67%，SEQ ID No.132所示的DNA分子在杂交缓冲液中的浓度为0.83nM，% 代表质量体积百分数g/100ml；

所述SEQ ID No.132为SEQ ID No.131所示的杂交质控探针的靶标序列，该序列 的5’端被荧光基团标记，荧光基团具体为TAMRA；

所述芯片洗涤液Ⅰ由SSC、十二烷基硫酸钠和水组成，SSC在芯片洗涤液Ⅰ的浓度 为2×，十二烷基硫酸钠在芯片洗涤液Ⅰ中的浓度为0.2%，%代表质量体积百分数 g/100ml；

所述芯片洗涤液II由SSC和水组成，SSC在芯片洗涤液II中的浓度为0.2×；

产品说明书记载如下内容：所述PCR为不对称PCR，该PCR反应可分为四个步骤， 第一个步骤是95℃变性600s，第二个步骤是由35-45个（优选45个）循环组成，每 个循环由95℃变性30s、55℃退火30s和72℃延伸80s组成，第三个步骤由10-25个 （优选20个）循环组成，每个循环由95℃变性30s和60-80℃（优选72℃）延伸80s 组成，第四个步骤是60-80℃（优选72℃）延伸420s。

上述任一所述的探针、上述任一所述的基因芯片、上述任一所述试剂盒在制备检 测HIV-1的耐药性相关的突变位点的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述的探针、上述任一所述的基因芯片、上述任一所述试剂盒在制备检 测HIV-1对HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性和/或HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变 位点的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述的应用中，所述耐药性相关的突变位点如下：L10R、M46I/L、L63P、 V82I/T、I84V、L90M、M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、 V106I/A、V108I、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、 T215Y/F、K219Q/E、H221Y和F227L；

所述L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V和L90M为HIV-1蛋白酶中与HIV-1蛋 白酶抑制剂耐药性相关的突变位点；

所述M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、V106I/A、 V108I、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、 K219Q/E、H221Y和F227L为HIV-1逆转录酶中HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性相关的突 变位点；

所述突变位点中，中间的数字代表突变氨基酸的位置，数字前面的字母表示此位 置氨基酸突变前的氨基酸残基种类，数字后面的字母表示此位置氨基酸突变后的氨基 酸残基种类，以HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点L10R和HIV-1逆转录酶抑 制剂耐药性相关的突变位点M41L为例，L10R的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位 氨基酸由L突变为R，M41L的意思是HIV-1病毒的逆转录酶的第41位氨基酸由M突变 成L。

上述任一所述的应用中，所述逆转录酶抑制剂为HIV-1核苷类逆转录酶抑制剂和/ 或HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂。

本发明的基因芯片将HIV-1逆转录酶和蛋白酶基因同时作为检测突变位点的区域， 通过PCR扩增的样品目的片段与探针杂交的信号强弱来判定病毒基因组中是否存在某 种耐药相关位点突变，并且通过在寡核苷酸探针上引入连续简并碱基，增强了探针对 非检测位点碱基多态性的耐受性。本发明的基因芯片和试剂盒可同时检测中国境内的 HIV-1对逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂是否耐药及耐药程度，该基因芯片和试剂盒 操作简便、准确性高、通量大、耗时短，为协助临床及时掌握HIV的治疗效果并制定 治疗方案提供参考。

附图说明

图1为基因芯片、点阵位置及点阵中探针排列示意图。

图2为81份临床样本各检测位点的总检测成功率。

图3为发生耐药性突变的病毒株的基因芯片检测结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一、寡核苷酸探针的合成

（一）针对HIV-1逆转录酶23个耐药性相关的氨基酸残基的29种突变类型和蛋 白酶6个耐药性相关的氨基酸残基的8种突变类型，设计了包括全部野生型位点的核 苷酸序列以及突变型位点的核苷酸序列共126条寡核苷酸探针，如表1所示。

表1寡核苷酸探针

表1中对应检测位点的表示形式为：

酶的种类_氨基酸位点_氨基酸残基类型野生型

或，

酶的种类突变前的氨基酸残基类型氨基酸位点突变后的氨基酸残基类型突变 型

序列中Y＝C／T；R＝A／G；N=A／C／G/T；S＝C／G；W＝A／T；K＝G／T；D＝ A/G/T。

SEQ ID No.1-SEQ ID No.24为包含HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关位点的寡核 苷酸探针；

SEQ ID No.25-SEQ ID No.126为包含HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性相关位点的 寡核苷酸探针；

SEQ ID No.1-SEQ ID No.126中部分寡核苷酸探针含有单个或多个简并碱基的核 苷酸位点，表示该位点存在多种等位基因。

（二）合成表1中的SEQ ID No.1-SEQ ID No.126的寡核苷酸探针，将各个寡核 苷酸探针的5’端用NH₂-（T）n修饰，其中（T）n表示n个寡聚dT，其中n为20。

二、引物的合成

（一）合成用于扩增目的片段的引物，如表2所示。

表2引物序列

序列号 引物名称 Sequence(5'-3') SEQ ID No.127 PROF4-F TCACTTGCTTCCGTTGAGGCCCAAATCACTCTTTGGC SEQ ID No.128 RTR8 GGAGTTCATAACCCATCC SEQ ID No.129 RTR9 GGAGTTCATATCCCATCC

（二）合成表2中SEQ ID No.127-SEQ ID No.129所示的引物，其中PROF4-F 为正向引物，RTR8和RTR9为反向引物，将正向引物PROF4-F的5’端用荧光基团TAMRA 标记。

三、质控探针和靶标序列的合成

（一）合成质控探针和靶标序列，如表3所示。

表3质控探针及靶标序列

序列号 序列名称 Sequence(5'-3') SEQ ID No.130 QC-00002 gcaagacaagtggaagtgtg SEQ ID No.131 EC-00012 gcaaccaccaccggagg SEQ ID No.132 QC-00011 cctccggtggtggttgc

（二）合成表3中的质控探针和靶标序列。QC-00002为表面化学质控探针， EC-00012为杂交质控探针，QC-00011为杂交质控探针的靶标序列。

表面化学质控探针QC-00002的5’端用荧光基团-（T）m修饰，3’端被NH₂修饰， （T）m表示m个寡聚dT，m为10-35，优选15-25，下述实施例中m为20个。荧光基 团为HEX。表面化学质控探针的作用是质控探针与基底共价连接的效果。

杂交质控探针EC-00012的5’端被NH₂-（T）k修饰，（T）k表示k个寡聚dT，k 为10-35，实施例中为20；杂交质控探针的作用是质控杂交的效果。

杂交质控探针的靶标序列QC-00011的5’端被TAMRA标记。

上述核苷酸序列的合成与修饰由上海英骏生物科技有限公司完成。

芯片洗涤液I：含有终浓度为2×SSC，体积百分含量0.2%SDS的水溶液。

芯片洗涤液II：含有终浓度0.2×SSC的水溶液。

实施例1、HIV-1耐药性相关基因的扩增

一、中国医科大学附属第一医院提取来源于中国境内的HIV感染者共81个血液样 品（患者知情同意）的HIV-1病毒的RNA，反转录成cDNA。

二、分别取各样本的2μl cDNA加入到PCR扩增体系中，体系如表4所示。

表4PCR扩增体系

反应物名称 原始浓度 加样量（μl） ddH₂O / 19 10×PCR Buffer 10× 3 dNTPs 2.5mM 2.4 rTaq酶 5U/μl 0.6 PROF4-F 10μM 2.4 RTR8 10μM 0.3 RTR9 10μM 0.3 总量 / 28

其中用于扩增HIV-1逆转录酶和蛋白酶基因的PCR引物为PROF4-F、RTR8和RTR9， 其中正向引物PROF4-F的浓度为每条反向引物RTR8和RTR9浓度的8倍。

三、按照表5所示的PCR程序进行扩增。

表5PCR程序

表5所示的PCR为不对称PCR，该PCR反应可分为两个阶段的温度循环：第一阶 段的温度循环由变性、退火和延伸三个步骤组成，包括35-45个循环，优选45个循环， 本实施例中为45个循环；第二阶段的温度循环由变性和延伸两个步骤组成，包括10-25 个温度循环，优选20个循环，本实施例中为20个循环；第二阶段的延伸温度可为 60-80℃，优选72℃，本实施例中为72℃。最终获得待检测样本HIV-1病毒的逆转录 酶和蛋白酶基因的PCR扩增产物。

实施例2、芯片检测

一、芯片的制备

将表1的126种寡核苷酸探针和表3中的表面化学质控探针QC-00002，杂交质控 探针EC-00012按图1所示的排布喷点在固相载体（醛基化的玻璃基片）上，制备成检 测用芯片。

二、配制杂交缓冲液

按照表6配制杂交缓冲液。

表6杂交缓冲液组成成分

杂交缓冲液成分 原始浓度 终浓度 配制体积（mL） SSC 20× 3.33× 1.5 Denhardt's 50× 8.33× 1.5 硫酸葡聚糖 10% 4.17% 3.75 SDS 10% 0.67% 0.6 QC-00011 10nM 0.83nM 0.75 纯化水 /   0.9 总量 /   9

三、单链的制备

将实施例1得到的PCR产物98℃变性5分钟，然后将其立即浸入冰水混合物中， 冰浴3分钟。

四、杂交

（一）在基因微阵列芯片杂交盒的底部加入200μl蒸馏水（或纯化水），将芯 片正面向上，小心放入杂交盒内，盖片的四个凸台向下盖在芯片上。

（二）将18μl杂交缓冲液和12μl实施例1得到的待检测样本的HIV-1病毒的 PCR产物混合进行杂交反应，得到该样本病毒相应的杂交反应混合物。

（三）每个点阵经盖片的加样孔加入13.5μl杂交反应混合物，每种待检测样本 的HIV-1病毒相应的杂交反应混合物加入1、2或3、4两个微阵列，每个微阵列限加 一个样本的HIV-1病毒相应的杂交反应混合物，迅速盖上杂交盒并密封，记录芯片编 号、微阵列位置及对应的病毒样品编号。

（四）立即将密封好的杂交盒水平放入50℃预热的恒温水浴锅中放置1h。

（五）杂交反应结束后，将杂交盒水平取出拆开，将芯片取出，进行芯片洗涤。 具体步骤如下：将取出的芯片立即放在盛有平衡至室温（10-30℃）的芯片洗涤液Ⅰ的 容器（如烧杯）中的玻片架上，在恒温摇床上以80-100rpm的转速，室温洗涤3分钟， 将玻片架连同芯片一起取出放入另一个容器（如烧杯）中的平衡至室温（10-30℃）的 芯片洗涤液Ⅱ在恒温摇床上，以80-100rpm的转速，室温洗涤3分钟。然后将芯片连 同玻片架在离心机中800rpm离心5分钟，甩干后扫描。

五、杂交信号的扫描与结果分析

使用LuxScan10K-B微阵列芯片扫描仪和Luxscan3.0软件进行信号的读取。

通过软件扫描，获得每一个探针（SEQ ID No.1-SEQ ID No.126和SEQ ID No.130- SEQ ID No.131）杂交信号，当杂交信号大于100荧光强度值时判断为阳性。其中SEQ  ID No.130-SEQ ID No.131用于质控其所在点阵的结果。

对81例临床HIV-1病毒样品进行检测，以每一个样品针对同一氨基酸位点的所有 探针中荧光信号最高的探针所代表的氨基酸类型为待测样品在该位点的氨基酸类型， 按照此方法得出待测样本每个待测位点的氨基酸类型。

经测序表明，本发明的方法可将每种突变均检出，没有遗漏，81个样本中一共存 在HIV-1病毒蛋白酶6个耐药性相关的氨基酸残基的8种突变类型和逆转录酶23个耐 药性相关的氨基酸残基的29种突变类型，共可检出37种耐药相关的突变类型，如图 2所示。

部分样品的个别待检位点附近存在较严重的基因多态性，导致该位点所有探针信 号均为阴性，导致该位点检测失败，经计算每个耐药性位点的检测成功率如图2所示， 所有位点的检查成功率均达到90%以上，表明该方法对HIV-1的高基因多态性具有较 好的耐受力，能够达到很好的检测效果。

图2中，PRO代表HIV-1蛋白酶，RT代表HIV-1逆转录酶。图2中各个位点符号 中，中间的数字代表突变氨基酸的位置，数字前面的字母表示此位置氨基酸突变前的 氨基酸残基种类，数字后面的字母表示此位置氨基酸突变后的氨基酸残基种类，/表示 或。以PRO-L10R和RT-M41L为例，L10R的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位氨基 酸由L突变成R，RT-M41L的意思是HIV-1病毒的逆转录酶的第41位氨基酸由M突变 成L。

其中一个临床样品的检测结果如图3所示。图3表明，PRO-V82I代表检测样本的 HIV-1病毒的蛋白酶的第82位氨基酸残基存在V到I的突变，RT-K101E代表该样本的 HIV-1病毒的逆转录酶的第101位氨基酸残基存在K到E的突变，RT-M184V代表该样 本的HIV-1病毒的逆转录酶的第184位氨基酸残基存在M到V的突变，RT-G190S代表 该样本的HIV-1病毒的逆转录酶的第190位氨基酸残基存在G到S的突变。

六、耐药性结果

斯坦福耐药数据库可以根据耐药突变的位置和种类对HIV的药物耐药程度进行评 分，最后指示对某一具体药物耐药程度（高度，中度，低度，潜在低度，敏感）。以 此实现本发明检测中国境内HIV-1病毒对逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的耐药性检 测。

根据病毒耐药性位点的核苷酸序列得到耐药位点的氨基酸序列，将每一个HIV-1 病毒样品的蛋白酶和逆转录酶的氨基酸序列检测结果提交到如下网址 http://sierra2.stanford.edu/sierra/servlet/JSierra?action=sequenceInput与 美国斯坦福大学HIV耐药数据或数据库进行比较，即可得到该病毒毒株对逆转录酶抑 制剂和蛋白酶抑制剂的耐药性情况。