编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的GAP基因的启动子的变体

摘要

本发明涉及具有启动子活性的分离的多核苷酸(编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的gap基因的启动子的变体);以及涉及生产和/或分泌精细化学品的微生物，所述微生物包含具有启动子活性的分离的多核苷酸，其能使各种基因与特定的起始菌株相比过表达;以及涉及使用本发明的微生物制备制备精细化学品的方法。

说明书

本发明涉及使用遗传修饰的微生物来制备精细化学品的方法，在所述微生物中编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的gap基因的启动子的变体使各种基因能够过表达。

现有技术

精细化学品(特别是指氨基酸、有机酸、维生素、核苷和核苷酸)被用于人类医学，用于药物、化妆和食品工业以及用于动物营养。

许多这些化合物是通过发酵棒状杆菌的菌株来制备的，特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。由于非常重要，一直有努力在改善其生产方法。所述方法可以针对发酵相关的手段来进行改善，如例如，搅拌和氧气供应，或者针对营养培养基的组成如例如发酵期间的糖浓度，或者针对产物形式的建立例如通过离子交换层析的手段，或者针对微生物本身的内在性能特征。

通过利用诱变、突变体的选择和挑选的方法来改善这些微生物的性能特征。以此方式获得了对于抗代谢物具抗性并产生化合物的菌株，所述抗代谢物如例如赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-半胱氨酸或者缬氨酸类似物2-噻唑丙氨酸，所述化合物例如L-氨基酸如L-赖氨或L-缬氨酸。

多年来，重组DNA技术的方法已同样被用于改善产L-氨基酸的谷氨酸棒状杆菌菌株，其中通过例如增强或减弱个体氨基酸生物合成基因，以及研究对所述化合物生产的作用。

关于谷氨酸棒状杆菌的生物学、遗传学和生物技术的总结可以参见“Handbook of Corynebacterium glutamicum”(Eds.:L.Eggeling和M.Bott，CRC Press，Taylor&Francis，2005)，Journal of Biotechnology的特刊中(主编:A.Pühler)题目为"A New Era in Corynebacterium glutamicumBiotechnology"(Journal of Biotechnology104/1-3，(2003))，以及T.Scheper(总编辑)的书"Microbial Production of L-amino acids"(Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology79，Springer Verlag，Berlin，Germany，2003)中。

谷氨酸棒状杆菌基因组的核苷酸序列在Ikeda和Nakagawa的(AppliedMicrobiology and Biotechnology62，99-109(2003))中，以及在EP1108790和Kalinowski等人(Journal of Biotechnology104/1-3，(2003))中有描述。

谷氨酸棒状杆菌基因组的核苷酸序列从National Library of Medicine(Bethesda，MD，USA)的National Center for Biotechnology Information(NCBI)中的数据库、从DNA Data Bank of Japan(DDBJ，Mishima，Japan)、或者从European Molecular Biologies Laboratories(EMBL，Heidelberg，Germany，和Cambridge，UK)的核苷酸序列数据库获得。

Patek et al(Journal of Biotechnology104，311-323(2003))已描述和分析了谷氨酸棒状杆菌编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的gap基因的天然启动子。

在US2008/0050786中，SEQ ID NO:20示出了称作seqP-RBS_20的484bp的DNA分子，其含有包括了核糖体结合位点的gap基因的启动子。此启动子可有利地用于表达各种基因，如例如编码天冬氨酸激酶的lysC基因,。为清楚起见，该序列被列为SEQ ID NO:1。

发明目标

本发明的目标是提供编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的gap基因的启动子和/或表达单元的变体，在所述变体的控制下，各种基因，如例如编码天冬氨酸激酶的lysC基因可有利地表达。

发明描述

在进行本发明期间，发现SEQ ID NO:2所示的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032gap基因启动子的活性，在用核碱基腺嘌呤置换所述启动子位置362处的核碱基鸟嘌呤之后得到了提高。

在如下核碱基的置换后，发现了启动子活性的进一步提高:在SEQ IDNO:2所示的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032gap基因启动子中用胸腺嘧啶置换位置265处的胞嘧啶、用胞嘧啶置换位置269处的鸟嘌呤、用胸腺嘧啶置换位置290处的腺嘌呤、和用腺嘌呤置换位置292处的鸟嘌呤。

因此，本发明涉及具有启动子活性的分离的多核苷酸，其包含具有SEQID NO:3或SEQ ID NO:34所示核苷酸序列的多核苷酸。

本发明还涉及具有启动子活性的分离的多核苷酸，其基本由具有SEQID NO:3或SEQ ID NO:34所示核苷酸序列的多核苷酸组成。术语"基本"在此背景中是指，长度不超过(≤)1000、不超过(≤)800、不超过(≤)700、不超过(≤)600、不超过(≤)500或不超过(≤)400个核苷酸的多核苷酸，和长度不超过(≤)15000、不超过(≤)10000、不超过(≤)7500、不超过(≤)5000、不超过(≤)2500、不超过(≤)1000、不超过(≤)800、不超过(≤)700、不超过(≤)600、不超过(≤)500或不超过(≤)400个核苷酸的多核苷酸被分别加至SEQIDNO:3或SEQIDNO:34的多核苷酸的5′端和3′端。

两项列举中特征的任意有用组合都符合本文的发明。“有用组合”意指，例如导致实现有效重组的特征的组合。在要置换的DNA区域旁侧用相同长度添加会有助于该区域在实验过程中通过同源重组转移。相对长的旁侧同源区域对于环状DNA分子之间的有效重组是有利的，但是置换载体的克隆会随着旁侧长度的增加而变得更困难(Wang等人，Molecular Biotechnology32:43-53(2006))。因此，优选在每种情况中添加600至不超过(≤)1000个核苷酸的特定组合，而特别优选在每种情况中添加750-850个核苷酸。

本发明还涉及具有启动子活性的分离的多核苷酸，其由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:34所示的序列组成。

关于多核苷酸存在于生命体(如例如微生物)中的生物化学和化学结构的细节，可参见Berg et al的教科书“Biochemie”[生物化学](SpektrumAkademischer Verlag Heidelberg.Berlin，Germany，2003;ISBN3-8274-1303-6)。

由含有核碱基或碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的脱氧核糖核酸单体组成的多核苷酸称作脱氧核糖多核苷酸或脱氧核糖核酸(DNA)。由含有核碱基或碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的核糖核酸单体组成的多核苷酸称作核糖多核苷酸或核糖核酸(RNA)。所述多核苷酸中的单体通过3′→5′-磷酸二酯键彼此共价连接。

“具有启动子活性的多核苷酸”或“启动子”意指多核苷酸(优选脱氧核糖多核苷酸)或核酸(优选脱氧核糖核酸(DNA))，其功能性地连接至要转录的多核苷酸并确定所述多核苷酸转录起始的点和频率，由此能够影响所控制的多核苷酸的表达强度。

由于DNA的双链结构，与序列表的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:34中链互补的链也同样是本发明的对象。

“转录”意指从DNA模板开始产生互补RNA分子的过程。此过程中涉及诸如RNA聚合酶、“σ因子”和转录调节蛋白的蛋白。所合成的RNA(信使RNA，m-RNA)继而在随后产生多肽或蛋白的翻译过程中用作模板。

从化学角度来看，基因是多核苷酸。编码蛋白/多肽的多核苷酸在本文中与术语“基因”同义使用。相应地，“基因”和“编码区”这两个术语，以及“蛋白”和“多肽”这两个术语也同义使用。

“功能性连接”在此背景中意指本发明的具有启动子活性的多核苷酸与另外的寡核苷酸或多核苷酸的顺序排列，其导致所述另外的多核苷酸的转录。

如果所述另外的多核苷酸是编码多肽/蛋白的多核苷酸(在下文中称作第二多核苷酸)并且由多肽的编码区所组成、始于起始密码子、包括终止密码子、适宜时包括转录终止序列，则“功能性连接”意指本发明的具有启动子活性的多核苷酸与第二多核苷酸的顺序排列，其导致所述第二多核苷酸的转录以及所合成的RNA的翻译。

第二多核苷酸编码一或多个多肽。编码蛋白/多肽的多核苷酸基本上由起始密码子(选自ATG、GTG和TTG，优选ATG或GTG，特别优选ATG)、蛋白编码序列和一或多个终止密码子(选自TAA、TAG和TGA)组成。

如果第二多核苷酸编码多个蛋白/多肽，每个基因之前可以有核糖体结合位点。在适宜的时候，终止序列位于最后一个基因的下游。

第二多核苷酸优选编码精细化学品(优选选自成蛋白氨基酸、非成蛋白氨基酸、维生素、核苷、核苷酸和有机酸)生物合成途径中的一或多种多肽或蛋白。特别优选成蛋白氨基酸、非成蛋白氨基酸和有机酸。

第二多核苷酸优选由EP1108790A2的表1中所列的一或多种多核苷酸所组成，该文献援引加入本文。

第二多核苷酸优选由编码磷酸戊糖途径的酶的一或多种基因或多核苷酸所组成，所述酶选自:

a)编码葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶的Zwf亚基(Zwf，EC NO.:1.1.1.49)的多核苷酸(zwf基因),

b)编码葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶的OpcA亚基(OpcA，EC NO.:1.1.1.49)的多核苷酸(opcA基因),

c)编码6-磷酸葡糖酸内酯酶(DevB，EC NO.:3.1.1.31)的多核苷酸(devB基因),

d)编码转酮醇酶(Tkt，EC NO.:2.2.1.1)的多核苷酸(tkt基因),

e)编码转醛醇酶(Tal，EC NO.:2.2.1.2)的多核苷酸(tal基因),

f)编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(Gnd，EC NO.:1.1.1.44)的多核苷酸(gnd基因),

g)编码核酮糖磷酸3-差向异构酶(Rpe，EC NO.:5.1.3.1)的多核苷酸(rpe基因)，和

h)编码核糖-5-磷酸异构酶B(Rpi，EC NO.:5.3.1.6)的多核苷酸(rpi基因),

特别优选zwf和opcA基因。

第二多核苷酸优选由编码糖回补和糖异生的酶的一或多种基因或多核苷酸所组成，所述酶选自:

i)编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Ppc,EC NO.:4.1.1.31)的多核苷酸(ppc基因),

j)编码果糖1,6-二磷酸酶(Fbp,EC NO.:3.1.3.11)的多核苷酸(fbp基因)，和

k)编码丙酮酸羧化酶(Pyc，EC NO.:6.4.1.1)的多核苷酸(pyc基因),特别优选pyc基因。

涉及L-赖氨酸的制备，第二多核苷酸优选由编码L-赖氨酸生物合成的酶的一或多种基因或多核苷酸所组成，所述酶选自:

l)编码二氢吡啶二羧酸合酶(DapA，EC No.:4.2.1.52)的多核苷酸(dapA基因),

m)编码天冬氨酸-半醛脱氢酶(Asd，EC No.:1.2.1.11)的多核苷酸(asd基因),

n)编码内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(Ddh，EC No.:1.4.1.16)的多核苷酸(ddh基因),

o)编码二氨基庚酸脱羧酶(LysA，EC No.:4.1.1.20)的多核苷酸(lysA基因),

p)编码天冬氨酸氨基转移酶(Aat，EC No.:2.6.1.1)的多核苷酸(aat基因),

q)编码具有L-赖氨酸输出活性的多肽(LysE，赖氨酸流出通透酶)的多核苷酸(lysE基因),

r)编码二氢吡啶二羧酸还原酶(DapB，EC No.:1.3.1.26)的多核苷酸(dapB基因),

s)编码天冬氨酸激酶(LysC，EC NO.:2.7.2.4)的多核苷酸(lysC基因),

t)编码琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶，AT I类(DapC,EC No.:2.6.1.17)的多核苷酸(dapC基因),

u)编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶(tetrahydrodipicolinate succinylase)(DapD，EC NO.:2.3.1.117)的多核苷酸(dapD基因),

v)编码琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶(DapE，EC NO.:3.5.1.18)的多核苷酸(dapE基因)，和

w)编码二氨基庚二酸差向异构酶(DapF，EC NO.:5.1.1.7)的多核苷酸(dapF基因),

特别优选dapA、asd、ddh、lysA、lysE、dapB和lysC基因。更特别优选asd和lysC基因，因为特别使用此两个基因实现了L-赖氨酸生产特别额外的增强。

涉及L-缬氨酸、L-异亮氨酸、α-酮异戊酸、α-酮-β-甲基戊酸或α-酮异己酸的制备，所述第二多核苷酸优选由编码L-缬氨酸、L-异亮氨酸、α-酮异戊酸、α-酮-β-甲基戊酸或α-酮异己酸生物合成的酶的一或多种基因或多核苷酸所组成，所述酶选自:

x)编码乙酰乳酸合酶的亚基(IlvBN，EC No.:4.1.3.18)的多核苷酸(ilvB基因和ilvN基因),

y)编码还原异构酶(IlvC，EC No.:1.1.1.86)的多核苷酸(ilvC基因),

z)编码二羟酸脱水酶(IlvD，EC No.:4.2.1.9)的多核苷酸(ilvD基因),

aa)编码转氨酶(IlvE，EC No.:2.6.1.42)的多核苷酸(ilvE基因),

bb)编码苏氨酸脱水酶(IlvA，EC No.:4.3.1.19)的多核苷酸(ilvA基因),

cc)编码高丝氨酸脱氢酶(Hom，EC-No.:1.2.1.11)的多核苷酸(hom基因),

dd)编码高丝氨酸激酶(ThrB，EC-No.:2.7.1.39)的多核苷酸(thrB基因),

ee)编码苏氨酸合酶(ThrC，EC-No.:4.2.3.1)的多核苷酸(thrC基因),

ff)编码异丙基苹果酸合酶(LeuA，EC-No.:2.3.3.13)的多核苷酸(leuA基因),

gg)编码异丙基苹果酸脱氢酶(LeuB，EC-No.:1.1.1.85)的多核苷酸(leuB基因),

hh)编码异丙基苹果酸异构酶的大亚基(LeuC，EC-No.:4.2.1.33)的多核苷酸(leuC基因),

ii)编码异丙基苹果酸异构酶的小亚基(LeuD，EC-No.:4.2.1.33)的多核苷酸(leuD基因),

对于异亮氨酸和缬氨酸，特别优选ilvBN、hom、ilvA、ilvC、ilvD和ilvE基因；对于α-酮戊酸(KIV)和α-酮-β-甲基戊酸(KMV)，特别优选ilvBN、ilvC和ilvD基因；而对于α-酮异己酸(KIC)，特别优选ilvBN、ilvC、ilvD、leuA、leuB、leuC和leuD基因。

涉及L-鸟氨酸的制备，第二多核苷酸优选由编码L-鸟氨酸生物合成的酶的一或多种基因或多核苷酸所组成，所述酶选自:

jj)编码赖氨酸/鸟氨酸转运蛋白(DE申请号102010003419.3)的多核苷酸(lysE基因),

kk)编码N-乙酰谷氨酸激酶(ArgB，EC-NO.:2.7.2.8)的多核苷酸(argB基因),

ll)编码谷氨酸脱氢酶(Gdh，EC-No.:1.4.1.3)的多核苷酸(gdh基因),

mm)编码谷氨酸N-乙酰基转移酶(ArgJ，EC-No.:2.3.1.35和EC-No.:2.3.1.1)的多核苷酸(argJ基因),

nn)编码N-乙酰基-γ-谷氨酰磷酸还原酶(ArgC，EC-No.:1.2.1.38)的多核苷酸(argC基因)，和

oo)编码乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD，EC-No.:2.6.1.11)的多核苷酸(argD基因),

特别优选lysE和argB基因。

本发明的启动子因而在每种情况中可用于在谷氨酸棒状杆菌中(过)表达所述第二多核苷酸。

第二多核苷酸的位置在本发明的启动子的下游，也即在其3'端，从而两个多核苷酸功能性地彼此相连，其中所述连接是直接连接或者通过接头寡核苷酸或接头多核苷酸的方式连接。优选两个多核苷酸通过接头寡核苷酸或接头多核苷酸的方式功能性地彼此相连。

所述接头寡核苷酸或接头多核苷酸由脱氧核糖核苷酸组成。

在此背景中，表述“直接功能性地彼此连接”意指核苷酸以在SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:34的3'端位置461处的腺苷核苷酸，直接连接至编码区起始密码子的第一个核苷酸。这导致了“无前端(leaderless)”的mRNA，其以5'-端AUG起始密码子为起点因而不具有任何其它翻译起始信号。

在此背景中，表述“通过接头寡核苷酸的方式功能性地彼此连接”意指核苷酸以在SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:34的3'端位置461处的腺苷核苷酸，由长度1、2、3、4、或5个核苷酸的寡核苷酸连接至编码区起始密码子的第一个核苷酸。

在此背景中，表述“通过接头寡核苷酸的方式功能性地彼此连接”意指核苷酸以在SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:34的3'端位置461处的腺苷核苷酸，由长度6至不超过(≤)600个核苷酸的多核苷酸连接至编码区起始密码子的第一个核苷酸。

在此背景中，表述“功能性地彼此连接”意指，第二多核苷酸以这样的方式连接至本发明的具有启动子活性的多核苷酸，其中所述方式确保第二多核苷酸的转录和所合成的RNA的翻译。

根据技术需要，所述接头多核苷酸的长度是：

6-600、6-500、6-400、6-300、6-200、6-180、6-160、6-140、6-120、6-100、6-80、6-60、6-50、6-40、6-30、6-28、6-27、6-26、6-25或者

8-600、8-500、8-400、8-300、8-200、8-180、8-160、8-140、8-120、8-100、8-80、8-60、8-50、8-40、8-30、8-28、8-27、8-26、8-25或者

10-600、10-500、10-400、10-300、10-200、10-180、10-160、10-140、10-120、10-100、10-80、10-60、10-50、10-40、10-30、10-28、10-27、10-26、10-25或者

12-600、12-500、12-400、12-300、12-200、12-180、12-160、12-140、12-120、12-100、12-80、12-60、12-50、12-40、12-30、12-28、12-27、12-26、12-25或者

14-600、14-500、14-400、14-300、14-200、14-180、14-160、14-140、14-120、14-100、14-80、14-60、14-50、14-40、14-30、14-28、14-27、14-26、14-25或者

16-600、16-500、16-400、16-300、16-200、16-180、16-160、16-140、16-120、16-100、16-80、16-60、16-50、16-40、16-30、16-28、16-27、16-26、16-25或者

18-600、18-500、18-400、18-300、18-200、18-180、18-160、18-140、18-120、18-100、18-80、18-60、18-50、18-40、18-30、18-28、18-27、18-26、18-25或者

20-600、20-500、20-400、20-300、20-200、20-180、20-160、20-140、20-120、20-100、20-80、20-60、20-50、20-40、20-30、20-28、20-27、20-26、20-25个核苷酸。

在特别优选的实施方案中，所述接头多核苷酸长度是20、21、22、23、24或25个核苷酸，因为这优选产生功能性构建体，如实施例3-5中所述。

所述接头多核苷酸优选为包含确保所合成RNA翻译的核苷酸序列的多核苷酸。此序列在本领域中也称作核糖体结合位点(RBS)或者ShineDalgarno序列。

本发明因为还涉及基本由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:34的多核苷酸组成的分离的多核苷酸，其以在其3'端位置461处的腺苷核苷酸，直接或者通过确保RNA翻译的接头多核苷酸的方式，功能性地连接至第二多核苷酸，所述第二多核苷酸在其5'端含有ATG或GTG起始密码子并编码一或多个多肽。优选两个多核苷酸通过接头多核苷酸的方式功能性地彼此相连。

本发明因为还涉及基本由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:34的多核苷酸组成的分离的多核苷酸，其经SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:34的3'端位置461处的腺苷核苷酸功能性地接头寡核苷酸。

另外，本发明还涉及基本由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:34的多核苷酸组成的分离的多核苷酸，其经在其3'端位置461处的腺苷核苷酸功能性地连接至确保RNA翻译的接头多核苷酸。

在此背景中，术语“基本”意指，长度不超过(≤)1000、不超过(≤)800、不超过(≤)700、不超过(≤)600、不超过(≤)500或不超过(≤)400个核苷酸的多核苷酸被加至SEQIDNO:3或SEQIDNO:34的多核苷酸的5′端并且长度不超过(≤)1000、不超过(≤)800、不超过(≤)700、不超过(≤)600、不超过(≤)500或不超过(≤)400个核苷酸的多核苷酸被加至第二多核苷酸的3'端，或者长度不超过(≤)15000、不超过(≤)10000、不超过(≤)7500、不超过(≤)5000、不超过(≤)2500、不超过(≤)1000、不超过(≤)800、不超过(≤)700、不超过(≤)600、不超过(≤)500或不超过(≤)400个核苷酸的多核苷酸被加至接头寡核苷酸或多核苷酸的3′端。

两项列举中特征的任意有用组合都符合本文的发明。“有用组合”意指，例如导致实现有效重组的特征的组合。在要置换的DNA区域旁侧用相同长度添加会有助于该区域在实验过程中通过同源重组转移。相对长的旁侧同源区域对于环状DNA分子之间的有效重组是有利的，但是置换载体的克隆会随着旁侧长度的增加而变得更困难(Wang等人，Molecular Biotechnology32:43-53(2006))。

因此，优选在每种情况中添加600至不超过(≤)1000个核苷酸的特定组合，而特别优选在每种情况中添加750-850个核苷酸。另外，当接头寡核苷酸或接头多核苷酸的3′功能性地连接至第二多核苷酸(其在5′端含有ATG或GTG起始密码子并编码一或多个多肽)时，接头寡核苷酸或接头多核苷酸的3′处的旁侧序列长度可增加至不超过(≤)15000个核苷酸。

棒状杆菌属(优选谷氨酸棒状杆菌)的核糖体结合位点已有很好的描述。Von Amador等人(Microbiology，145，915-924(1999))已经确定了谷氨酸棒状杆菌16S rRNA的反-Shine Dalgarno序列，其在SEQ ID NO:4中示出。Martin等人(Journal of Biotechnology104，41-53(2003))所报道的序列在SEQ ID NO:5中示出。

适宜的核糖体结合位点的其它例子还有:

谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)ATCC13032的ppc基因的核糖体结合位点(O’Regan等人,基因77，237-251(1989))，在SEQ ID NO:6中示出;

谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的aceA基因的核糖体结合位点(Reinscheid等人，Journal of Bacteriology176(12)，3474-3483(1994))，在SEQ ID NO:7中示出;

谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的thiX基因的核糖体结合位点(Reinscheid等人，Journal of Bacteriology176(12)，3474-3483(1994))，在SEQ ID NO:8中示出;

谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的sod基因的核糖体结合位点(WO2005/059144)，在SEQ ID NO:9中示出;

谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的tuf基因的核糖体结合位点(WO2005/059093)，在SEQ ID NO:10中示出;

EP1918378中SEQ ID NO:44的核糖体结合位点，在SEQ IDNO:11中示出;

谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的fbp基因的核糖体结合位点，在SEQ ID NO:12中示出;

谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的gap基因的核糖体结合位点(Eikmanns，Journal of Bacteriology174(19)，6076-6086(1992))，在SEQ ID NO:13中示出。

优选所述接头多核苷酸含有gap基因的核糖体结合位点(在SEQ IDNO:13中示出)，或fbp基因的的核糖体结合位点(在SEQ ID NO:12中示出)。

所述接头多核苷酸特别优选的实施方案(其含有gap基因的核糖体结合位点)在SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中示出。

所述接头多核苷酸特别优选的实施方案(其含有fbp基因的核糖体结合位点)在SEQ ID NO:18中示出。

所述接头多核苷酸的这些特别优选的实施方案确保RNA的翻译以有利的方式进行。

为了促进具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:34的核苷酸序列的本发明多核苷酸、确保RNA的翻译的所述接头多核苷酸、以及编码一或多个多肽的第二多核苷酸(在其5′端具有ATG或GTG起始密码子)之间的化学连接，可以在所述多核苷酸的5′和3′端处掺入克隆所需的功能性核苷酸序列并且即使在所述克隆之后也至少部分保留。

术语“克隆所需的功能性核苷酸序列”在本文中表示任何存在的REII(II型限制性内切酶)切割位点，其序列通常由4-8个核苷酸组成。

另外，需要在此提到的是，通过诱变引物或从头基因合成(例如通过GENEART AG(Regensburg，Germany))的手段而对核苷酸序列进行的位点特异性诱变以去除限制性内切酶的切割位点，可以在序列中引入沉默突变以使所述切割位点可有利地用于随后的克隆步骤。

通过将本发明的启动子功能性地连接至所述确保RNA翻译的接头多核苷酸而得到的多核苷酸在下文中也称作表达单元。

本发明还涉及本发明的启动子或本发明的表达单元用于在微生物中表达所期望的基因或多核苷酸的用途。本发明的启动子或本发明的表达单元确保转录和所合成的RNA(优选mRNA)翻译成多肽。

优选在棒状杆菌属的微生物中进行表达。优选基于棒状杆菌属中如下物种的菌株:Corynebacterium efficiens(保藏的典型菌株有DSM44549)，谷氨酸棒状杆菌(保藏的典型菌株有ATCC13032)，和产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)(保藏的典型菌株有ATCC6871)。特别优选谷氨酸棒状杆菌物种。

以此方式可以表达具有相应宿主中不存在或检测不到的特性(优选酶活性)的多肽。因而，例如，Yukawa等人描述了在组成型Ptrc启动子的控制下于谷氨酸棒状杆菌R中表达用于利用D-木糖的大肠杆菌(Escherichiacoli)基因(Applied Microbiology and Biotechnology81，691-699(2008))。

本发明的启动子或本发明的表达单元还用于在微生物中过表达所期望的基因或多核苷酸(过表达)。

过表达通常意指，与起始菌株(亲本菌株)或野生型菌株(如果后者是起始菌株)相比，核糖核酸、蛋白质(多肽)或酶的细胞内浓度或活性的增加。起始菌株(亲本菌株)意指已经经历过导致过表达的措施的菌株。

对于过表达，优选重组过表达的方法。这包括使用体外提供的DNA分子制备微生物的所有方法。此类DNA分子的包括例如启动子、表达盒、基因、等位基因、编码区等。通过转化、接合、转导或类似方法将其引入所期望的微生物中。

在本发明的情况中，启动子优选是SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:34的多核苷酸，且表达盒优选是SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:34的多核苷酸(经在其3'端位置461处的腺苷核苷酸功能性地连接至确保RNA翻译的接头多核苷酸)。

使用本发明的启动子或本发明的表达单元的过表达的措施增加相应多肽的活性或浓度，通常以所述措施导致过表达前的菌株中的所述多肽的活性或浓度水平为基础增加至少10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400%或500%，优选不超过1000%、2000%、4000%、10000%或20000%。

表达或过表达的程度可以通过测量从基因转录的mRNA的量或浓度来确定，通过测定多肽的量或浓度和通过测定酶活性的水平来确定。

mRNA的量尤其可以通过使用“Northern印迹”和定量RT-PCR的方法确定。定量RT-PCR涉及在聚合酶链式反应之前逆转录。来自Roche Diagnostics的LightCycler^TM系统(Boehringer Mannheim GmbH，Roche MolecularBiochemicals，Mannheim，Germany)可以用于此目的，例如在Jungwirth等人中(FEMS Microbiology Letters281，190-197(2008))所描述的。通过1维和2维蛋白凝胶分级和随后的使用合适的评估软件的对凝胶中蛋白质浓度的光学鉴定可以测定所述蛋白质的浓度。为棒状细菌制备蛋白质凝胶和鉴定蛋白质的常用方法是由Hermman等人描述的程序(Electrophoresis，22:1712-23(2001))。通过使用对被检测的蛋白质特异性的抗体的蛋白印迹(Sambrook等人，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)和随后的使用合适的浓度测定软件的光学评估(Lohaus和Meyer(1998)Biospektrum5:32-39；Lottspeich，Angewandte Chemie321:2630-2647(1999))同样可以测定蛋白质的浓度。所收集数据的统计学显著性通过T检验的手段来确定(Gosset，Biometrika6(1):1-25(1908))。

使用本发明的启动子过表达所期望基因的措施可以适宜的方式与其它过表达措施组合。

通过在现有技术中可获得的多种方法来实现过表达。这些包括增加拷贝数以及修饰指导或控制所述基因表达的核苷酸序列。

可以通过在细菌细胞质中复制的质粒的手段来增加拷贝数。为此，用于具有很大差异的微生物组的质粒在现有技术中有大量描述，所述质粒可以用于设置基因拷贝数所期望的提高。适合于棒状杆菌属的质粒在例如Tauch等人(Journal of Biotechnology104(1-3)，27-40，(2003))或在Stansen等人的文献中(Applied and Environmental Microbiology71，5920-5928(2005))有所描述。

通过引入更多的拷贝进入微生物染色体可以使拷贝数进一步增加至少一个(1)拷贝。适合于棒状杆菌属的方法在例如专利WO03/014330、WO03/040373和WO04/069996中有描述。

还可以在所期望基因的上游放置多个启动子或将其功能性地连接至所要表达的基因并以这种方式实现表达的提高。这在例如WO2006/069711中有描述。

在适宜的情况中，可通过抑制(阻抑蛋白)或促进(激活蛋白)转录的蛋白质来控制基因的转录。相应地，通过增加激活蛋白的表达或通过减少或关闭阻抑蛋白的表达同样可以实现过表达。

延伸的速率受密码子使用的影响。可以通过使用起始菌株中常用的t(转运)RNA密码子来增强翻译。另外，将起始密码子替换为许多微生物中(大肠杆菌中为77%)更常用的ATG起始密码子能够可观地敢删梵音，因为在RNA水平，AUG密码子比GUG和UUG密码子有效两至三倍，例如(Khudyakov等人，FEBS Letters232(2):369-71(1988)；Reddy等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA82(17):5656-60(1985))。还可以优化起始密码子周围的序列，因为起始密码子与旁侧区之间的协同效应已有描述(Stenstrom等人,基因273(2):259-65(2001);Hui等人，EMBO Journal3(3):623-9(1984))。

对操作DNA、消化和连接DNA、转化和选择转化体的操作说明尤其可以参见Sambrook等人的已知的手册“Molecular Cloning:A LaboratoryManual，Second Edition”(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。

本发明还涉及包含本发明多核苷酸的载体。

Kirchner和Tauch(Journal of Biotechnology104:287-299(2003))描述了用于谷氨酸棒状杆菌的载体的选择。

使用本发明的载体进行的同源重组使得通过载体转运至细胞内的本发明多核苷酸所能够置换染色体上的DNA区段。为了载体的环状DNA分子和染色体上靶DNA之间的有效重组，在要用本发明的多核苷酸置换的DNA区域的末端提供同源于靶位点的核苷酸序列(其确定载体整合的位点以及DNA置换的位点)。

因而，本发明具有启动子活性的多核苷酸可以：1)在染色体中已经与第二多核苷酸的天然基因座处的天然启动子置换，或者2)已经与第二多核苷酸在后者的天然基因座处或者在另一基因座处整合。“第二多核苷酸的天然基因座处的天然启动子”意指基因天然发生的启动子被置换，天然发生的启动子通常以单一拷贝的方式在相应野生型或相应起始生物体的基因座处以其核苷酸序列的形式天然存在。

“另一基因座”意指其核苷酸序列与第二多核苷酸的序列不同的基因座。所述其它基因座或所述其它基因座处的核苷酸序列优选位于染色体内，并且通常不是生长和产生所期望的化合物所必需的。还可以在染色体内使用基因间区域，即，无编码功能的核苷酸序列。

优选在棒状杆菌属的微生物中进行表达或过表达。在棒状杆菌属内，优选基于如下物种的菌株:Corynebacterium efficiens(保藏的典型菌株有DSM44549)，谷氨酸棒状杆菌(保藏的典型菌株有ATCC13032)，和产氨棒状杆菌(保藏的典型菌株有ATCC6871)。特别优选谷氨酸棒状杆菌物种。

某些代表性谷氨酸棒状杆菌物种在现有技术中也以其它名称为人所知。这些包括例如：菌株ATCC13870，被称为嗜醋酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)；菌株DSM20137，被称为百合棒状杆菌(Corynebacterium lilium)；菌株ATCC17965，被称为栖糖蜜棒状杆菌(Corynebacterium melassecola)；菌株ATCC14067，被称为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)；菌株ATCC13869，被称为乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)；和菌株ATCC14020，被称为散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)。

术语“产谷氨酸小球菌(Micrococcus glutamicus)”也用于谷氨酸棒状杆菌。某些代表性Corynebacterium efficiens物种在现有技术中也已称为热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)，如例如菌株FERMBP-1539。

用于本发明的表达或过表达措施的微生物或菌株(起始菌株)优选已经具有将所期望的精细化学品分泌至周围营养培养基中并在该处积累的能力。在下文中，对此也使用“产生”这一表述。更具体地，用于过表达措施的菌株具有在≤(不超过)120小时、≤96小时、≤48小时、≤36小时、≤24小时或≤12小时内于细胞中或于营养培养基中将所期望的精细化学品积累至浓度≥(至少)≥0.10g/l、0.25g/l、≥0.5g/l、≥1.0g/l、≥1.5g/l、≥2.0g/l、≥4g/l或≥10g/l的能力。起始菌株优选通过诱变和选择、通过重组DNA技术或通过这两种方法的组合来制备。

本领域技术人员理解，适用于本发明的措施的微生物也可通过如下方法获得：首先利用SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:34的本发明的启动子在野生型菌株(谷氨酸棒状杆菌典型菌株ATCC13032或菌株ATCC14067)中过表达所期望的基因，继而，通过另外的现有技术中所述的遗传学措施来使所述微生物产生所期望的精细化学品。

对于本发明的措施而言，术语“精细化学品”意指氨基酸、有机酸、维生素、核苷和核苷酸。特别优选成蛋白氨基酸、非成蛋白氨基酸和有机酸。

“成蛋白氨基酸”是指天然蛋白中出现的氨基酸，也即在微生物、植物、动物和人类的蛋白质中出现的氨基酸。它们作为蛋白质的结构单元，其中它们经肽键彼此相连。

术语蛋白和多肽可互换。

下文提到的成蛋白L-氨基酸是指选自如下的氨基酸(包括其盐)：L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸，以及适宜的情况下L-硒代半胱氨酸和L-吡咯赖氨酸。特别优选L-氨基酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-脯氨酸。更特别优选L-赖氨酸和L-缬氨酸。

下文提到L-赖氨酸或赖氨酸不仅是指碱基，还指盐，如例如赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。

非成蛋白氨基酸尤其包括L-鸟氨酸和L-高丝氨酸。

有机酸尤其包括α-酮酸，特别优选α-酮异己酸(KIC)、α-酮戊酸(KIV)和α-酮-β-甲基戊酸(KMV)。

谷氨酸棒状杆菌物种分泌L-赖氨酸或产L-赖氨酸的菌株的实例有:

谷氨酸棒状杆菌MH20-22B(=DSM16835)；

在Menkel等人(Applied and Environmental Microbiology55(3)，684-688(1989))中有描述并且保藏为DSM16835；

Georgi等人(Metabolic Engineering7，291-301(2005))和EP1717616A2中所描述的谷氨酸棒状杆菌DM1729，并保藏为DSM17576；

US6,783,967所述的谷氨酸棒状杆菌DSM13994；以及

Blombach等人(Appl Environ Microbiol.2009Jan;75(2):419-27)中所描述的谷氨酸棒状杆菌DM1933。

Corynebacterium efficiensis物种分泌L-赖氨酸或产L-赖氨酸的菌株的实例:

US5,250,423所述的热产氨棒状杆菌AJ12521(=FERMBP-3304)。

产L-赖氨酸微生物通常具有“反馈”-抗性的或密集化的(densensitized)天冬氨酸激酶。“反馈”-抗性天冬氨酸激酶是指，与野生形式(野生型)相比，该天冬氨酸激酶(LysC)对于由赖氨酸和苏氨酸混合物或者AEC(氨乙基半胱氨酸)和苏氨酸混合物或者单独赖氨酸或者单独AEC带来的抑制敏感性较低。编码这些(与野生型相比)密集化的天冬氨酸激酶的基因或等位基因也称作lysC^FBR等位基因。谷氨酸棒状杆菌物种适宜于所述天冬氨酸激酶的情况的野生型是菌株ATCC13032。现有技术描述了许多编码天冬氨酸激酶变体(与野生型蛋白相比具有氨基酸取代)的lysC^FBR等位基因。棒状杆菌属细菌中的lysC基因也称作ask基因。肠杆菌(Enterobacteriaceae)中的lysC基因所编码的天冬氨酸激酶也称作天冬氨酸激酶III。

关于导致密集化的谷氨酸棒状杆菌天冬氨酸激酶蛋白的氨基酸取代的详细信息尤其在WO2009141330A1(第10页21行至第13页17行)中有描述，其援引加入本文。优选携有选自如下的氨基酸取代的天冬氨酸激酶变体:L-异亮氨酸取代氨基酸序列的位置380处的L-苏氨酸和任选存在的L-苯丙氨酸取代位置381处的L-丝氨酸，L-异亮氨酸取代位置311处的L-苏氨酸和L-苏氨酸取代位置279处的L-丙氨酸。

谷氨酸棒状杆菌物种分泌L-甲硫氨酸或产L-甲硫氨酸的菌株的实例:

WO2007/011939所述的谷氨酸棒状杆菌M1179(=DSM17322)。

棒状杆菌分泌L-色氨酸或产L-色氨酸的菌株的已知代表性实例有:

US5,563,052所述的谷氨酸棒状杆菌K76(=Ferm BP-1847)；

US5,605,818所述的谷氨酸棒状杆菌BPS13(=Ferm BP-1777)；和

US5,235,940所述的谷氨酸棒状杆菌Ferm BP-3055。

棒杆状细菌分泌L-缬氨酸或产L-缬氨酸的菌株的实例有:

US5,188,948所述的乳发酵短杆菌FERM BP-1763；

US5,521,074所述的乳发酵短杆菌FERM BP-3007；

US5,521,074所述的谷氨酸棒状杆菌FERM BP-3006；和

US5,188,948所述的谷氨酸棒状杆菌FERM BP-1764。

产L-缬氨酸的微生物通常具有“反馈”-抗性的或密集化的乙酰乳酸合酶(AHAS，EC4.1.3.18)，其是合成异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸的平行途径中的第一个酶(Umbarger，H.E.1987.Biosynthesis of the branched-chainamino acids，p.352-367。在F.C.Neidhardt，J.L.Ingraham，K.B.Low，B.Magasanik，M.Schaechter，和H.E.Umbarger(ed.)，Escherichia coli andSalmonella typhimurium:Cellular and Molecular Biology中。American Societyfor Microbiology，Washington，D.C.)。该全酶总是由两个大亚基和两个小亚基组成。大的AHAS亚基形成催化结构域并且由ilvB所编码，而小的亚基作为调节结构域并由ilvN所编码。“反馈”-抗性乙酰乳酸合酶是指，与野生形式(野生型)相比，该乙酰乳酸合酶对于由支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸或其混合物所带来的抑制敏感性较低。谷氨酸棒状杆菌物种适宜于所述乙酰乳酸合酶的情况的野生型是菌株ATCC13032，而黄色短杆菌物种中适宜的野生型是菌株ATCC14067。

谷氨酸棒状杆菌中编码乙酰乳酸合酶的ilvBN已在例如Keilhauer等人(Journal of Bacteriology175(17):5595-603(1993))或EP1108790中有描述。登录号L09232描述了所述基因的序列。

不受支链氨基酸(亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)反馈抑制的AHAS变体酶例如在Mendel等人(Journal of Molecular Biology325，275-284(2003)、Elisakova等人(Applied and Environmental Microbiology71，207-213(2005))、Wada等人(Bioscience Biotechnology&Biochemistry，72(11)，2959-2965，(2008))和在EP1491634中有描述。优选在ilvN-编码的小亚基中携有一或多个如下氨基酸取代的“反馈”-抗性乙酰乳酸合酶的变体，所述氨基酸取代选自:L-天冬氨酸取代氨基酸序列位置20处的甘氨酸，L-天冬氨酸取代氨基酸序列位置21处的L-异亮氨酸，L-苯丙氨酸取代氨基酸序列位置22处的L-异亮氨酸，除了L-丙氨酸之外的任意成蛋白氨基酸、优选L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸、特别优选L-缬氨酸在位置42处取代以及任选存在的L-亮氨酸在位置47处取代L-组氨酸。

棒状杆菌分泌L-异亮氨酸或产L-异亮氨酸菌株的已知代表性实例有:

US4,656,135所述的黄色短杆菌FERM BP-760；

US5,294,547所述的黄色短杆菌FERM BP-2215；和

US4,656,135所述的谷氨酸棒状杆菌FERM BP-758。

棒杆状细菌分泌L-高丝氨酸或产L-高丝氨酸菌株的已知代表实例有:

US3,189,526所述的产谷氨酸小球菌ATCC14296；和

US3,189,526所述的产谷氨酸小球菌ATCC14297。

谷氨酸棒状杆菌分泌L-鸟氨酸或产L-鸟氨酸菌株的已知代表实例有:

US5,188,947所述的乳发酵短杆菌FERM-BP2344；

US5,188,947所述的谷氨酸棒状杆菌FERM-BP2345。

分泌α-酮酸或产α-酮酸的菌株基于例如:

谷氨酸棒状杆菌，菌株ATCC13032,

黄色短杆菌，菌株ATCC14067和

乳发酵短杆菌，菌株ATCC13869。

本发明提供了生产精细化学品的微生物，所述微生物通过使用SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:34的本发明的启动子而具有与特定起始菌株相比一或多个基因提高了的表达。

本发明还提供了用于发酵制备精细化学品的方法，其包括步骤:a)在适宜培养基中培养上文所述的本发明的微生物，得到发酵液，以及b)浓缩a)的发酵液和/或微生物细胞中的精细化学品。

本文优选从含有精细化学品的发酵液获取所述精细化学品或者液态或固态的含精细化学品的产物。

所产生的微生物可以连续地培养(例如在WO05/021772中所描述的)，或者以用于产生所期望的有机化合物的分批方法(batch process)(分批培养)或分批加料(fed-batch)或重复分批加料(repeated fed-batch)的方法不连续地培养。关于已知培养方法的一般性质的概述可得自Chmiel的教科书中(Bioprozesstecknik[生物过程技术]1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik[生物过程工程简介](Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或在Storhas的教科书中(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[生物反应器及周边设备](Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，Germany1994))。

要使用的培养基或发酵培养基必须以适合的方式满足各个菌株的需求。American Society for Bacteriology(Washington D.C.，USA，1981)的“Manual of Methods for General Bacteriology”中有对各种微生物的培养基的描述。术语培养培养基和发酵培养基或培养基是可以互换的。

作为碳源，可以使用糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖浆、来自甜菜或甘蔗加工的含有蔗糖的溶液、淀粉、淀粉水解物和纤维素；可以使用油和脂肪，例如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子脂肪；可以使用脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸；可以使用醇，例如甘油、甲醇与乙醇；可以使用有机酸，例如醋酸或乳酸。

作为氮源，可以使用有机的含氮化合物，例如蛋白胨、酵母提取物、肉类提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素；或使用无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。所述氮源可以单独或以混合物的方式使用。

作为磷源，可以使用磷酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或相应的含有钠盐类。

所述培养基还必须包含生长所必需的盐，例如以金属(例如钠、钾、镁、钙和铁)的氯化物或硫酸盐的形式，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质，可以使用基本的生长因子，例如氨基酸(例如高丝氨酸)和维生素(例如硫胺素、生物素或泛酸)。

所述起始材料可以单批次添加至所述培养物，或在培养过程中以适合的方式补料。

培养物的pH可以通过以适当的方式使用碱性化合物(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)来控制。通常调整pH至6.0-8.5，优选6.5-8。为了控制起泡，可以使用止泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了保持质粒的稳定性，可以向培养基添加适合的选择性物质，例如抗生素。优选在有氧条件下进行发酵。为了保持这些条件，向培养物中导入氧气或含氧气体混合物，例如空气。同样可以使用富含过氧化氢的液体。适当时，在升高的压力进行发酵，例如在0.03-0.2MPa的升高的压力下。培养温度通常在20℃-45℃且优选25℃-40℃，特别优选30℃-37℃。在分批或分批加料方法中，优选连续培养直至形成足够回收的量的所需的有机化合物。这通常可在10小时-160小时内实现。在连续方法中，可能有更长的培养时间。所述微生物的活性导致发酵培养基和/或所述微生物细胞中有机化合物的集中(积累)。

适合的发酵培养基的实例尤其可以在专利US5,770,409、US5,990,350、US5,275,940、WO2007/012078、US5,827,698、WO2009/043803、US5,756,345和US7,138,266中找到。

为了测定在发酵过程中的一或多个时间点的浓度，可以通过用离子交换层析的方式分离L-氨基酸来分析L-氨基酸，优选阳离子交换层析及随后使用茚三酮的柱后衍生化，如Spackman等人(Analytical Chemistry30:1190-1206(1958))中所述。也可使用邻苯二甲醛而非茚三酮用于柱后衍生化。离子交换层析的综述文章可参见Pickering(LC.GC(Magazine ofChromatographic Science)7(6)，484-487(1989))。

同样可以使用例如邻苯二甲醛或苯基异硫氰酸酯进行柱前衍生化，并通过反相层析(RP)优选地以高效液相色谱(HPLC)的形式来分馏所得的氨基酸衍生物。此类方法在例如Lindroth等人(Analytical Chemistry51:1167-1174(1979))中有描述。

进行光度学检测(吸光度、荧光)。

有关氨基酸分析的综述可以尤其参见Lottspeich和Zorbas的“Bioanalytik”教科书(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany1998)。

可以通过用离子交换层析的方式分离酮酸和其它分泌产物，来进行测定发酵过程中一或多个时间点α-酮酸浓度的分析，优选使用在磺酸化的苯乙烯-二乙烯苯聚合物上H+形式的阳离子交换层析，例如通过0.025M硫酸及随后于215nm(或者也可在230或275nm)以UV检测的方式。优选可以利用REZEK RFQ–Fast Fruit H+柱(Phenomenex)，而分离相的其它供应商(例如来自BioRad的Aminex)也是可行的。类似的分离在供应商相应的应用实例中有描述。

基于使用不含有本发明启动子变体的微生物进行的方法或发酵方法，对于一或多种选自如下的参数：浓度(每单位体积形成的化合物)、产率(每单位消耗碳源所形成的化合物)、形成(每单位体积和时间形成的化合物)和比形成(每单位干细胞物质或干生物质和时间所形成的化合物、或者每单位细胞蛋白和时间所形成的化合物)或其他方法参数以及其组合，本发明的方法或发酵方法的性能增加了至少0.5%、至少1%、至少1.5%或至少2%。这在大规模产业工艺中被认为是非常值得努力的。

发酵措施导致了含有所期望的精细化学品(优选氨基酸或有机酸)的发酵液。

继而以液态或固态的形式提供或产生或回收含有精细化学品的产物。

发酵液是指其中已在一定温度下培养微生物一定时间的发酵培养基或营养培养基。所述发酵培养基或在发酵过程中所采用的培养基包含所有确保产生所期望化合物以及通常确保增殖和活力的物质或组分。

当发酵完成，获得的发酵液因而包含：

a)微生物的生物质(细胞团)，所述生物质因所述微生物细胞的增殖而产生，

b)在所述发酵过程中形成的精细化学品，

c)在所述发酵过程中可能形成的有机副产物，和

d)在所述发酵中未消耗完的所用的发酵培养基或起始原料的成分，例如维生素如生物素，或盐如硫酸镁。

有机副产物包括所述发酵物中使用的微生物所产生的除了特定的所期望的化合物之外任选地分泌的物质。

从培养容器或发酵罐中移除发酵液，在适宜的情况下收集并用于以液态或固态形式提供含有精细化学品的产物。对此，也使用表述“回收含精细化学品的产物”。在最简单的情况中，从发酵罐中移除的含有精细化学品的发酵液本身构成了回收的产物。

选自以下的一或多种措施实现了所期望的有机化合物的浓缩或纯化，所述措施为从发酵液中

a)部分(>0%至<80%)至完全(100%)或实质上完全(≥80%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%)去除水，

b)部分(>0%至<80%)至完全(100%)或实质上完全(≥80%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%)去除生物质，所述生物质在去除前任选经灭活，

c)部分(>0%至<80%)至完全(100%)或实质上完全(≥80%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%、≥99.3%、≥99.7%)去除在发酵过程中形成的有机副产物，和

d)部分(>0%至<80%)至完全(100%)或实质上完全(≥80%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%、≥99.3%、≥99.7%至<100%)去除所用的发酵培养基或起始材料中在发酵中未消耗完的成分。以这种方式分离具有期望的所述化合物含量的产物。

部分(>0%至<80%)至完全(100%)或实质上完全(≥80%至<100%)去除水(措施a))也称作干燥。

在所述方法的变体中，完全或实质上完全去除水、生物质、有机副产物和所用的发酵培养基的未消耗完组分导致获得纯的(≥80%重量或≥90%重量)或高度纯的(≥95%重量、≥97%重量、≥99%重量)所期望有机化合物(优选L-氨基酸)的产物形式。大量的对a)、b)、c)或d)的措施的技术说明在现有技术中可获得。

对于氨基酸L-赖氨酸或其盐的情况，现有技术中基本上已知四种不同的产物。

一组含L-赖氨酸包括纯化的L-赖氨酸浓缩的水成碱性溶液(EP-B-0534865)。另一组,例如如US6,340,486和US6,465,025中所述，包括含有L-赖氨酸发酵液的水成酸性含生物质浓缩物。最熟知的一组固态产物包括粉状或晶状形式的纯化的或纯的L-赖氨酸，其通常是盐的形式，如例如，L-赖氨酸单盐酸盐。另一组固态产物形式在例如EP-B-0533039中有描述。其中所描述的产物形式包括除L-赖氨酸之外大部分的在发酵生产期间使用的且未消耗完的起始材料，以及适宜的情况下，比例为>0%-100%的所使用的微生物的生物质。

适宜于各种产物形式的多种多样的方法已知可用于从发酵液产生含有L-赖氨酸的产物或者纯化的L-赖氨酸。

基本上用于产生纯的固态L-赖氨酸的方法是离子交换层析的那些方法(在适宜的情况下其中使用活性炭)，以及结晶的方法。以此方式获得了相应的碱或相应的盐，如例如单盐酸盐(Lys-HCl)或者赖氨酸硫酸盐(Lys₂-H₂SO₄)。

EP-B-0534865描述了用于从发酵液产生水成碱性含L-赖氨酸溶液的方法。在其中所描述的该方法中，将生物质从发酵液中分离并弃去。使用碱如例如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵来设定9至11之间的pH。通过浓缩和冷却之后结晶而从该液中去除无机成分(无机盐)并用作肥料或弃去。

在使用棒状杆菌属细菌产生赖氨酸的方法中，优选那些导致含有发酵液成分的产物的方法。这些特别用作动物饲料添加剂。

根据需要，可以通过如例如离心、过滤、倾析、或其组合的分离方法来完全或部分地从发酵液中去除生物质，或者将生物质完全留在其中。在适宜的情况下，在适合的加工步骤中将生物质或含生物质发酵液失活，例如通过热处理(加热)或者通过加入酸。

在一种过程中，生物质被完全或实质上完全去除，从而没有(0%)生物质或者最多30%、最多20%、最多10%、最多5%、最多1%或最多0.1%的生物质留在所制备的产物中。在另一过程中，生物质未被去除或者仅仅去除了小部分，从而所有的(100%)生物质或者超过70%、80%、90%、95%、99%或99.9%的生物质留在所制备的产物中。因而，在本发明的一个方法中，生物质以从≥0%到≤100%的比例被去除。

最后，在完全或部分去除生物质之前或之后，可以用无机酸(如例如盐酸、硫酸、或磷酸)或有机酸(如例如丙酸)调节发酵后所获得的发酵液至酸性pH，从而改善终产物的操控特性(GB1,439,728或EP1331220。同样可以将具有全部生物质含量的发酵液酸化。最后，也可以通过加入亚硫酸氢钠(NaHSO₃，GB1,439,728)或另外的盐来使发酵液稳定，例如加入亚硫酸的铵盐、碱金属盐或碱土金属盐。

在去除生物质期间，发酵液中存在的任何有机或无机的固体被部分地或完全地去除。至少部分(>0%)、优选达至少25%程度的、特别优选达至少50%程度的以及更特别优选达至少75%程度溶于发酵液的有机副产物、及溶解的未消耗完的发酵培养基成分(起始材料)保留在产物中。在适宜的情况下，它们也完全(100%)或实质上完全(意指>95%或>98%或者超过99%)保留在产物中。如果产物就此而言包含至少部分的发酵液成分，则其也由术语“基于发酵液的产物”来描述。

随后，通过已知的方法从发酵液中去除水，或者将所述发酵液增稠或浓缩，所述方法如例如，使用旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜蒸发器、通过反渗透或通过纳米过滤。可继而通过冻干、喷干、喷射成粒(spraygranulation)的方法或者通过其它方法如循环流化床将此浓缩的发酵液加工成自由流动的产物，特别是细粉或者优选的粗粒颗粒，如例如根据PCT/EP2004/006655中所述。在适宜的情况下，通过筛选或除尘从所获得的颗粒中分离所期望的产物。

同样可以直接干燥发酵液，也即没有之前通过喷干或喷射成粒的浓缩。

“自由流动”意指粉末，在一系列口大小不同的玻璃口容器中，能够至少无阻碍地流出具5mm(毫米)口的容器(Klein:Seifen，Fette，Wachse94，12(1968))。

“精细”是指粉末主要(>50%)具有直径20-200μm的颗粒大小。

“粗粒”是指主要(>50%)为直径200-2000μm颗粒大小的产物。

可以通过激光衍射光谱的方法来确定颗粒大小。相应的方法在R.H.Müller和R.Schuhmann的教科书“in der Laborpraxis”Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart(1996)中或者在M.Rhodes，published的教科书“Introduction to Particle Technolog”Wiley&Sons(1998)中有描述。

继而可以通过适宜的压缩和成粒方法将自由流动的精细粉末转化成粗粒的、非常自由流动的、可储存和基本无尘的产物。

术语“无尘”指产物仅含有颗粒大小低于直径100μm的小部分(<5%)。

本发明含义中的“可储存的”是指，产物在干燥阴凉的环境中可以储存至少一(1)年或更长、优选至少1.5年或更长、特别优选两(2)年或更长，而未实质上损失存在的各种氨基酸。“实质上损失”是指>5%的损失。

本发明还涉及WO2007/042363A1中所述的原理。就此而言,进行了其中使用根据本发明所获得的发酵液(在适宜的情况下，其中生物质被完全或部分去除)的方法，其包括如下步骤:

a)通过加入硫酸将pH降低至4.0-5.2、特别是4.9-5.1，以及通过在适宜的情况下加入一或多种另外的含硫酸盐化合物而在发酵液中建立了0.85-1.2、优选0.9-1.0、特别优选>0.9至<0.95的摩尔硫酸盐/L-赖氨酸比，和

b)通过去除水分将以此方式获得的混合物浓缩，并在适应的情况下成粒,

其中在适宜的情况下在步骤a)之前进行如下的一种或两种措施:

c)测量摩尔硫酸盐/L-赖氨酸比以确定所需的含硫酸盐化合物的量

d)加入选自如下组的含硫酸盐化合物：硫酸铵、适当比例的亚硫酸氢铵和硫酸。

在适宜的情况下，在步骤b)之前，还以基于发酵液0.01-0.5%重量、优选0.1-0.3%重量、特别优选0.1-0.2%重量的浓度加入亚硫酸盐、优选碱金属亚硫酸盐、特别优选亚硫酸氢钠。

在上述方法步骤的背景中可提及的优选含硫酸盐化合物特别有硫酸铵和/或硫酸氢铵或者氨水和硫酸的适宜混合物以及硫酸本身。

摩尔硫酸盐/L-赖氨酸比V以如下公式计算:V=2x[SO₄^2-]/[L-赖氨酸]。此公式虑及了SO₄^2-阴离子和硫酸是二价的这一事实。V=1的比例意味着存在理想化学计量配比的Lys_2-(H₂SO₄)，而发现V=0.9的比例是10%的硫酸盐短缺以及V=1.1的比例是10%的硫酸盐过量。

在成粒或压缩期间，使用如下是有利的：通常的有机或无机辅助物或者载体如淀粉、明胶、纤维素衍生物或者类似的物质，如通常用于加工食品或饲料作为粘合剂、胶凝剂或增稠剂，或者其它的物质如例如，硅石、硅酸盐(EP0743016A)和硬脂酸盐。

用油或者脂处理所得的颗粒表面也是有利的，如WO04/054381中所述。可用的油有矿物油、植物油或者植物油的混合物。此类油的实例有大豆油、橄榄油、大豆油/卵磷脂混合物。以相同的方式，硅油、聚乙烯二醇或羟乙基纤维素也是适宜的。用所述油处理表面可实现产物提高的耐磨性和降低含尘量。基于总饲料添加剂的量，产物中的油含量是0.02-2.0%重量、优选0.0-1.0%重量、及特别优选0.2-1.0%重量。

优选的产物具有≥97%重量的比例为100-1800μm的颗粒大小或者≥95%重量的比例为直径300-1800μm的颗粒大小。尘(也即颗粒大小<100μm的颗粒)的比例优选>0-1%重量，特别优选不超过0.5%重量。

然而，作为选择，产物还可被吸附至已知的并常用于饲料加工的有机或无机载体上，如例如，硅石、硅酸盐、膳食、糠、面粉、淀粉、糖或者其它，和/或产物还可用常用的增稠剂或粘合剂来混合和稳定。此用途和方法的实例在文献中有描述(Die Mühle+Mischfuttertechnik132(1995)49，817页)。

最后，还可通过包被过程给产物带来薄膜形成物，如例如，金属碳酸盐、硅石、硅酸盐、藻酸盐、硬脂酸盐、淀粉、树胶、和纤维素醚，如DE-C-4100920中所述，使其成为对动物胃部消化稳定的状态，特别是反刍动物的胃部。

为在产物中建立所期望的L-赖氨酸浓度，根据需要，可以在加工期间以浓缩物的形式加入L-赖氨酸，或者在适宜的情况下，以液态或固态形式加入基本上纯的物质或其盐。这些可单独加入或者作为混合物加入至所得的或浓缩的发酵液，或者在干燥或成粒过程中加入。

本发明还涉及与制备固态含赖氨酸产物的方法的组合，该方法的原理在US20050220933中有描述。这涉及进行期中使用根据本发明获得的发酵液的方法，且所述方法包括如下步骤:

a)过滤发酵液，优选用膜过滤器，以得到含生物质的浆料和滤出物,

b)浓缩所述滤出物，从而优选得到含量为48-52%重量的固体,

c)将步骤b)中获得的浓缩物成粒，优选在50℃-62℃的温度，和

d)用一或多种包被物质将步骤c)所获得的颗粒包被。

优选用于步骤d)的包被物质选自:

d1)步骤a)所获得的生物质,

d2)含L-赖氨酸的化合物，优选选自L-赖氨酸盐酸盐或L-赖氨酸硫酸盐,

d3)基本无L-赖氨酸的物质，其L-赖氨酸含量<1%重量、优选<0.5%重量，优选选自淀粉、角叉菜胶、琼脂、硅石、硅酸盐、膳食、糠和面粉，和

d4)放水物质，优选选自油、聚乙烯二醇和液态石蜡。

通过相应于步骤d1)-d4)、特别是d1)-d3)的措施，将L-赖氨酸的含量调节至所期望的值。

在含L-赖氨酸产物的生产中，优选对离子的比例进行调节，从而使对应于下式：2x[SO₄^2-]+[Cl^-]-[NH₄⁺]-[Na⁺]-[K⁺]-2x[Mg²⁺]-2x[Ca²⁺]/[L-Lys]的摩尔离子比为0.68-0.95、优选0.68-0.90、特别优选0.68-0.86，如Kushiki等人在US20030152633中所述。

对于L-赖氨酸的情况，以此方式产生的固态产物具有(基于发酵液的)如下的赖氨酸含量(赖氨酸碱基):10%重量-70%重量或20%重量-70%重量、优选30%重量-70%重量及特别优选40%重量-70%重量(基于产物的干物质)。71%重量、72%重量、73%重量的最大赖氨酸碱基含量同样是可能的。

含L-赖氨酸固态产物中的含水量达5%重量、优选达4%重量、及特别优选低于3%重量。

实施例1

DM1547gap基因的启动子区的测序

通过多次的非定向诱变、选择和突变体挑选从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032制备了谷氨酸棒状杆菌菌株DM1547。该菌株对赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸具抗性。

根据布达佩斯条约，于2001年1月16日将DM1547菌株的纯培养物作为DSM13994保藏在Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen(DSMZ，Braunschweig，Germany)。所述菌株DSM13994在EP1239040中列出。

谷氨酸棒状杆菌基因组ATCC13032的核苷酸序列在Iked和Nakagawa(Applied Microbiology and Biotechnology62，99-109(2003))中、在EP1108790中以及在Kalinowski等人(Journal of Biotechnology104(1-3)，(2003))中有描述。谷氨酸棒状杆菌R基因组的的核苷酸序列在Yukawa等人(Microbiology153(4):1042-1058(2007))中有描述。

Corynebacterium efficiens基因组的核苷酸序列在Nishio等人(GenomeResearch.13(7)，1572-1579(2003))中有描述。

谷氨酸棒状杆菌和Corynebacterium efficiens基因组的核苷酸序列同样可得自National Library of Medicine(Bethesda，MD，USA)的National Centerfor Biotechnology Information(NCBI)、DNA Data Bank of Japan(DDBJ，Mishima，Japan)、或者European Molecular Biologies Laboratories(EMBL，Heidelberg，Germany，和Cambridge，UK)的核苷酸序列数据库。

通过Eikmanns等人(Microbiology140:1817–1828(1994))所述的方法从菌株DM1547分离染色体DNA。借助于聚合酶链反应来扩增含有gap基因上游区域的DNA区段。鉴于谷氨酸棒状杆菌的gap基因的已知序列，下述寡核苷酸被用作引物:

Pgap3-1(SEQ ID NO:31):

5`cgtttggggtcaatgtccat3`

Pgap3-2(SEQ ID NO:32):

5`cccagtccaggttctttg3`

所示的引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成。它们使得能扩增529bp的DNA区段。所述Pgap3-2引物结合对应于与SEQ ID NO:30(和SEQ ID NO:33)互补的链中位置742-759的区域。所述Pgap3-1引物结合对应于SEQ ID NO:30(和SEQ ID NO:33)的链中位置231-250的区域。

使用Phusion High Fidelity DNA聚合酶(New England Biolabs，Frankfurt，Germany)来进行PCR反应。反应混合物依照厂商信息制备，并且在总共50μl的体积中含有:10μl的供应的5×Phusion HF缓冲液，每种浓度200μm的脱氧核苷三磷酸,浓度0.5μm的引物，大约50ng的模板DNA和两个单位的Phusion聚合酶。通过加入H₂O而将体积调节至50μl。

所述PCR混合物首先在98℃经历了30秒的起始变性。这之后是35个循环的：于98℃的表型步骤20秒、引物结合DNA的步骤在60℃进行20秒、和延伸步骤在72℃延伸引物60秒。在最后于72℃的延伸步骤5分钟之后，对PCR混合物进行琼脂糖凝胶电泳(0.8%琼脂糖)。鉴别出了长度大约0.53kb的DNA片段，用来自Qiagen(Hilden，Germany)的QIAquickGel Extraction试剂盒将该片段从所述凝胶分离并纯化。

由Agowa(Berlin，Germany)确定了经扩增的PCR产物的DNA片段的核苷酸序列。

菌株DM1547的gap基因启动子区的核苷酸序列在位置379含有核碱基腺嘌呤(参见SEQ ID NO:33)。野生型的启动子区(参见SEQ ID NO:30)在此位置含有核碱基鸟嘌呤。此突变在下文中称作Pgap3。

实施例2

载体pK18mobsacB_IBcg0054的构建

为表征本发明的突变体，将包含启动子的gap基因的上游区域用于增强合成的操纵子。所述合成的操纵子由lysC基因的等位基因编码的密集化的谷氨酸棒状杆菌天冬氨酸激酶(其中在所编码的天冬氨酸激酶蛋白中的位置311处的野生型核碱基苏氨酸已被置换为核碱基异亮氨酸(参见WO00/63388和US6,893,848))、和asd基因编码的谷氨酸棒状杆菌天冬氨酸-半醛脱氢酶所组成。所述合成的操纵子经同源重组被整合至谷氨酸棒状杆菌染色体内的基因间区域中，以致所述插入导致了lysC和asd基因拷贝数的增加。使得所述合成的操纵子能够掺入的同源DNA序列由Geneart AG(Regensburg，Germany)合成。此DNA序列示于SEQ ID NO:35并标注为IBcg0054。所述DNA序列含有383bp的基因间区域，其旁侧有595bp的区域(编码推定的膜蛋白的cg0055基因和编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的cg0057基因的部分)以及663bp的区域(编码铁摄取蛋白的cg0054基因的部分)。

在酶AvrII和NsiI的限制性切割位点之外，在用于插入各种DNA序列的基因间区域内的中心位置，为了亚克隆整个片段的程序而产生了限制性内切酶MunI和HindIII的旁侧切割位点。

用限制性内切酶MunI和HindIII消化1660bp的Geneart片段(SEQIDNO:35)，并继而将其亚克隆至等人(Gene，145，69-73(1994))所述的可移动载体pK18mobsacB中。为此，用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化pK18mobsacB。将以此方式制备的载体与IBcg0054片段混合，并用Ready-To-Go T4DNA Ligase试剂盒(Amersham-Pharmacia，Freiburg，Germany)来处理该混合物。

随后，用连接混合物转化大肠杆菌菌株S17-1(Simon等人，Bio/Technologie1:784-791，1993)(Hanahan，in DNA cloning.A practicalapproach.Vol.1.ILR-Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)。通过将转化混合物在补加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂上铺板来选择携有质粒的细胞(Sambrock等人，Molecular Cloning:a laboratory manual.2^nd Ed.ColdSpring Harbor，New York，1989)。

借助Qiagen QIAprep Spin Miniprep试剂盒来从转化体中分离质粒DNA，并用酶EcoRI和HindIII的限制性切割和随后的琼脂糖凝胶电泳来查验。该质粒具有名称pK18mobsacB_IBcg0054。

实施例3

置换载体pK18mobsacB_PgapWT_lysCT311I_asd、

pK18mobsacB_Pgap3_lysCT311I_asd和

pK18mobsacB_Pg3N3_lysCT311I_asd的构建

在含有于各自启动子PgapWT、Pgap3和Pg3N3控制下的lysC和asd基因的合成操纵子的DNA盒(已插入实施例2所述的基因间区域)的基础上对gap基因上游区域中的突变进行表征。所述合成操纵子由Geneart AG(Regensburg，Germany)合成并被分别命名为PgapWT_lysCT311I_asd、Pgap3_lysCT311I_asd和Pg3N3_lysCT311I_asd。DNA序列分别在Seq IDNo:36(PgapWT_lysCT311I_as)、Seq ID No:37(Pgap3_lysCT311I_asd)、和Seq ID No:38(Pg3N3_lysCT311I_asd)中示出。

所述gap基因的启动子区域包含位置9-469，在此区域中的构建体的序列在每种情况对应于Seq ID No:2(PgapWT)、Seq ID No:3(Pgap3)或Seq IDNo:34(Pg3N3)中所示的序列。其下游跟随有lysC基因的等位基因所编码的敏感性降低的谷氨酸棒状杆菌天冬氨酸激酶的编码序列，所述等位基因中在所编码的天冬氨酸激酶的位置311处的野生型核碱基苏氨酸已经被置换为核碱基异亮氨酸(参见WO00/63388和US6,893,848)。另外，lysC起始密码子内的核碱基鸟嘌呤已经被置换为核碱基腺嘌呤。其下游又跟随有asd基因所编码的谷氨酸棒状杆菌天冬氨酸-半醛脱氢酶的编码序列。所述gap基因的核糖体结合位点在每种情况中均位于所述两个基因lysC和asd的上游(以Seq ID No:16的形式在lysC上游，以Seq ID No:26的形式在asd上游)，并且gap基因的终止序列位于asd的下游。

为了亚克隆程序而产生了在合成操纵子旁侧的酶AvrII和NsiI的限制性切割位点。

用限制性内切酶AvrII和NsiI消化所述片段，并继而将其亚克隆至实施例2中所述的可移动载体pK18mobsacB_IBcg0054中。为此，用限制性内切酶AvrII和NsiI消化pK18mobsacB_IBcg0054。将以此方式制备的载体与PgapWT_lysCT311I_asd、Pgap3_lysCT311I_asd或Pg3N3_lysCT311I_asd片段混合，并用Ready-To-Go T4DNA Ligase试剂盒(Amersham-Pharmacia，Freiburg，Germany)来处理该混合物。

随后，用连接混合物转化大肠杆菌菌株S17-1(Simon等人，Bio/Technologie1:784-791，1993)(Hanahan，in DNA cloning.A practicalapproach.Vol.1.ILR-Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)。通过将转化混合物在补加有50mg/l卡那霉素的LB琼脂上铺板来选择携有质粒的细胞(Sambrock等人，Molecular Cloning:a laboratory manual.2^nd Ed.ColdSpring Harbor，New York，1989)。

借助Qiagen QIAprep Spin Miniprep试剂盒来从转化体中分离质粒DNA，并用酶AvrII和NsiI的限制性切割和随后的琼脂糖凝胶电泳来查验。基于gap-启动子等位基因，所述质粒分别被命名为pK18mobsacB_PgapWT_lysCT311I_asd、pK18mobsacB_Pgap3_lysCT311I_asd和pK18mobsacB_Pg3N3_lysCT311I_asd。pK18mobsacB_Pgap3_lysCT311I_asd以示例的方式在图1中示出。

实施例4

谷氨酸棒状杆菌菌株DM1729_PgapWT_lysCT311I_asd、DM1729_Pgap3_lysCT311I_asd和DM1729_Pg3N3_lysCT311I_asd的制备

要将突变PgapWT_lysCT311I_asd、Pgap3_lysCT311I_asd和Pg3N3_lysCT311I_asd引入到菌株谷氨酸棒状杆菌DM1729中。所述菌株DM1729是谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的氨乙基半胱氨酸-抗性突变体，并且在专利申请EP1717616A2以及在Georgi等人的(MetabolicEngineering7，291–301(2005))中有描述。其已经以名称DSM17576保藏在Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ，Braunschweig，Germany)。

根据等人的方案(Journal of Microbiology172:1663-1666(1990))，通过接合将实施例3中所述的载体，pK18mobsacB_PgapWT_lysCT311I_asd、pK18mobsacB_Pgap3_lysCT311I_asd和pK18mobsacB_Pg3N3_lysCT311I_asd转移至谷氨酸棒状杆菌菌株DM1729中。所述载体在DM1729中不能自我复制，并且仅在其被整合至染色体(重组事件的结果)之后才保留在细胞中。通过将接合混合物在补加有25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酸的LB琼脂上铺板来选择转接合子，也即具有整合的pK18mobsacB_PgapWT_lysCT311I_asd、pK18mobsacB_Pgap3_lysCT311I_asd或pK18mobsacB_Pg3N3_lysCT311I_asd的克隆。继而将卡那霉素抗性转接合子在补加了卡那霉素(25mg/l)的LB琼脂平板上划线并在33℃温育24小时。通过在非选择性LB液体培养基中将克隆培养30小时，随后再将它们在补加有10%蔗糖的LB琼脂上划线并在33℃温育24小时，由此选择其中质粒由于第二次重组而被切除的突变体。

与起始质粒pK18mobsacB一样，质粒pK18mobsacB_PgapWT_lysCT311I_asd、pK18mobsacB_Pgap3_lysCT311I_asd和pK18mobsacB_Pg3N3_lysCT311I_asd在卡那霉素抗性基因之外，还包括编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶(levansucrase)的sacB基因的拷贝。所述sacB基因蔗糖诱导的表达导致形成果聚糖蔗糖酶，其催化对谷氨酸棒状杆菌有毒的产物果聚糖的合成。因此，只有其中整合的pK18mobsacB_PgapWT_lysCT311I_asd、pK18mobsacB_Pgap3_lysCT311I_asd或pK18mobsacB_Pg3N3_lysCT311I_asd由于第二次重组而被切除的克隆能在补加了蔗糖的LB琼脂上生长。根据第二次重组相对于突变位点的位置，切除包括有等位基因置换或突变的掺入、或原始拷贝保留在宿主的染色体中。

在每种情况中对其中已发生所期望置换的克隆进行筛选，也即盒PgapWT_lysCT311I_asd、Pgap3_lysCT311I_asd或Pg3N3_lysCT311I_asd已掺入到基因间区域内。

为此，在每种情况中，对具有表型“在存在蔗糖时生长”和“在存在卡那霉素时不生长”的20个克隆，用聚合酶链反应(PCR)检查其中盒PgapWT_lysCT311I_asd、Pgap3_lysCT311I_asd或Pg3N3_lysCT311I_asd的整合。

为此，使用了如下的合成的寡核苷酸(引物):

引物cg0054_9.p(SEQ ID No.39):

5'CCACCCATCACCCTCACTTC3'

引物cg0054_10.p(SEQ ID No.40):

5'GCACTCTCGTTTGGCAGTTC3'

引物QlysC_WT_P2(SEQ ID No.41):

5'aagtgccgggatcattacta3'

所示的引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成。引物cg0054_9.p和cg0054_10.p使得1032bp的DNA片段能够被扩增(如果在基因间区域存在野生型排列)。在同一反应混合物中使用能够退火至lysC基因的另外的引物(QlysC_WT_P2)，使得1330bp的DNA片段能够被扩增，由此特异性地检测到合成操纵子PgapWT_lysCT311I_asd、Pgap3_lysCT311I_asd或Pg3N3_lysCT311I_asd整合至基因间区域IBcg0054。在所选择的用于PCR的条件下，引物cg0054_9.p和cg0054_10.p的组合在整合至基因间区域的情况中不会导致产生扩增子。另外，借助于所述的检测反应鉴别出由于技术原因而未产生扩增子的PCR反应。

使用来自Qiagen(Hilden，Germany)的Taq PCR Core试剂盒，其含有栖热水生菌(Thermus aquaticus)的Taq DNA聚合酶，在来自Eppendorf(Hamburg，Germany)的热循环仪中进行PCR反应。根据厂商的信息条件反应混合物的条件。该PCR混合物首先在94℃经历2分钟的初始变性。随后是35个循环的:于94℃变性30秒的步骤、于57℃将引物结合至DNA的步骤30秒、和于72℃延伸引物60s的延伸步骤。在最后于72℃的延伸步骤5分钟之后，通过在琼脂糖凝胶中电泳来查验以此方式获得的扩增产物。

以此方式，鉴别出了其中盒PgapWT_lysCT311I_asd、Pgap3_lysCT311I_asd或Pg3N3_lysCT311I_asd已被整合的突变体，且在每种情况中获得的谷氨酸棒状杆菌菌株之一被命名为DM1729_PgapWT_lysCT311I_asd、DM1729_Pgap3_lysCT311I_asd和DM1729_Pg3N3_lysCT311I_asd。

实施例5

L-赖氨酸的制备

在适宜于产生赖氨酸的营养培养基中培养实施例4中所获得的谷氨酸棒状杆菌菌株，DM1729_PgapWT_lysCT311I_asd、DM1729_Pgap3_lysCT311I_asd和DM1729_Pg3N3_lysCT311I_asd，以及起始菌株DM1729，并确定培养物上清中的赖氨酸含量。

对于此目的，首先在脑心琼脂平板(Merck，Darmstadt，Germany)上于33℃将克隆传代24小时。始自这些琼脂平板的培养物，在每种情况中都接种了预培养(100ml锥形瓶中10ml培养基)。用于预培养的培养基是MM培养基。将预培养于33℃在摇床上以240rpm温育24小时。从此预培养接种主要培养，从而使主要培养的起始OD(660nm)达到0.1OD。MM培养基也用于主要培养。

用氨水将CSL(玉米浆)、MOPS(吗啉基丙磺酸)和盐溶液调至pH7并高压灭菌。继而加入无菌底物和维生素溶液以及干燥灭菌的CaCO₃。

在100ml锥形瓶(有折流挡板)中于10ml的体积内进行培养。温度为33℃，以及每分钟250转和80%的湿度。

24小时后，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm的波长测量光密度(OD)。用来自Eppendorf-BioTronik(Hamburg，Germany)的氨基酸分析仪通过离子交换层析及随后使用茚三酮的柱后衍生化来确定所形成的赖氨酸的量。

实验的结果在表1中示出

表1:L-赖氨酸的制备

所有值均为用所列菌株进行三次实验的平均值

该结果表明，相对于上述的起始菌株，由于使用了本发明的启动子变体Pgap3和Pg3N3，而导致了形成所期望产物(L-赖氨酸)的正效应。

实施例6

置换载体pK18mobsacB_IBcg0054_Pg3_argJB的构建

始自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组序列,在GeneArt(Regensburg，Germany)合成了2722bp的DNA片段(Seq ID:29)，其携有Pgap3启动子以及基因argJ(编码谷氨酸N-乙酰基转移酶)和argB(编码N-乙酰谷氨酸激酶)。所述gap基因的启动子区域包含位置10-470，在此区域中的构建体的序列对应于Seq ID No:3(Pgap3)所示序列。其下游跟随有来自谷氨酸棒状杆菌的谷氨酸N-乙酰基转移酶和N-乙酰谷氨酸激酶的编码序列。经末端引入的切割位点SphI和BlnI用SphI和BlnI切割该片段，并继而将其克隆至同样经SphI和BlnI切割的载体pK18mobsacB_IBcg0054(来自实施例2)。该质粒被命名为pK18mobsacB_IBcg0054_Pg3_argJB。

Example7

谷氨酸棒状杆菌菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032_DargFRGH_Pg3_argJB的制备

根据等人(Journal of Microbiology172:1663-1666(1990))的方案，通过接合将实施例6提到的载体pK18mobsacB_IBcg0054_Pg3_argJB转移至谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032_DargFRGH(from patent applicationDE102010003419.3)中，类似于实施例4。

为此目的，首先将该载体转化至大肠杆菌S17-1菌株内(Simon等人，Biotechnology1:784-791)。所述载体pK18mobsacB或pK18mobsacB_IBcg0054_Pg3_argJB在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中不能自我复制并且仅在其被整合至染色体(重组事件的结果)之后才保留在细胞中。通过将接合混合物在补加有15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酸的LB琼脂上铺板来选择具有整合的pK18mobsacB_IBcg0054_Pg3_argJB的克隆(Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2nd Ed.，ColdSpring Harbor，New York，1989)。继而将15个所建立的克隆在补加了卡那霉素(25mg/l)的LB琼脂平板上划线并于33℃温育16小时。为了选择其中质粒由于第二次重组而被切除的突变体，将克隆在非选择性LB液体培养基中培养20小时，随后再将它们在补加有10%蔗糖的LB琼脂上划线并在温育24小时。与起始质粒pK18mobsacB一样，质粒pK18mobsacB_IBcg0054_Pg3_argJB在卡那霉素抗性基因之外，还包括编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的sacB基因的拷贝。蔗糖诱导的表达导致形成果聚糖蔗糖酶，其催化对谷氨酸棒状杆菌有毒的产物果聚糖的合成。因此，只有其中整合的pK18mobsacB_IBcg0054_Pg3_argJB又被切除的克隆能在含有蔗糖的LB琼脂上生长。完整的盒IBcg0054_Pg3_argJB或者染色体基因间区域IBcg0054可以与质粒一起被切除。对大约40-50个菌落测试了表型“在存在蔗糖时生长”和“在存在卡那霉素时不生长”。为了确定盒IBcg0054_Pg3_argJB已保留在染色体中，通过Innis等人(PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications，1990，Academic Press)的标准PCR方法借助聚合酶链反应研究了具有表型5“在存在蔗糖时生长”和“在存在卡那霉素时不生长”的大约20个菌落。这涉及从菌落的染色体DNA扩增携带有基因间区域IBcg0054周围区域和所插入的arg基因的部分的DNA片段。如下引物寡核苷酸被选择用于所述PCR：

argA-E1:TGTCGCGGAAGTGCTGCAAC

cg0054_10.p:GCACTCTCGTTTGGCAGTTC

通过产生1949bp的DNA片段(在琼脂糖凝胶中检测)检测到了正确的克隆。

实施例8

使用谷氨酸棒状杆菌制备L-鸟氨酸

为了研究它们产生L-鸟氨酸的能力，在每种情况中将谷氨酸棒状杆菌ATCC13032_DargFRGH_Pg3_argJB的三个克隆和菌株ATCC13032_Delta_argFRGH的三个克隆在10ml测试培养基中于33℃预培养16小时。对于生产测定，在每种情况中用所获得的预培养物接种10ml测试培养基，使得起始OD₆₀₀(在600nm下的光密度)为0.1。每个克隆在三个摇瓶中测试，这样每个菌株由总共九个摇瓶代表。

所述测试培养基与Keilhauer等人在(Journal of Bacteriology(1993)175:5593-5603)中所描述的CgXII培养剂是相同的，但额外含有7.5g/l酵母提取物(Difco)、25μg/ml卡那霉素、1mM IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)和用40g/l蔗糖代替葡萄糖。为简单起见，在如下表2总结所述测试培养基的组成。

表2

组分每升含量(NH₄)₂SO₄20g尿素5gKH₂PO₄1gK₂HPO₄1gMgSO₄x7H₂O0.25g3-吗啉丙磺酸(MOPS)42gCaCl₂0.01gFeSO₄x7H₂O0.01gMnSO₄x H₂O0.01gZnSO₄x7H₂O0.001gCuSO₄0.0002gNiCl₂x6H₂O0.00002g生物素0.0002g原儿茶酸0.03g蔗糖40g酵母提取物7.5gpH(使用NaOH)7

在33℃及200rpm于100ml振荡烧瓶中进行培养。振荡器的偏转(deflection)为5cm。在24和48小时后从培养物取样，并测定光密度、蔗糖含量和L-鸟氨酸含量。为了测定蔗糖和L-鸟氨酸含量，通过简短离心(桌上离心型5415D(Eppendorf)以13000rpm、10分钟、室温去除所述细胞。

使用GENios微孔板光度计(Tecan，Reading，UK)在660nm的波长下测定光密度。在测量前用去离子水1:100稀释所述样品。

使用来自R-Biopharm AG(Darmstadt，Germany)的测试系统(Cat.No.10716251035)测定蔗糖。这涉及到蔗糖的转换以及使用偶联酶测定(己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)经NADH形成检测所形成的葡萄糖。

通过反相HPLC(Lindroth等人，Analytical Chemistry(1979)51:1167-1174)进行来自培养物上清的细胞外的氨基酸含量的定量测定，其使用与荧光检测器(G1321A)连接的HP1100系列HPLC仪器(Hewlett-Packard，Waldbronn，Germany)；使用HP ChemStation(Hewlett-Packard)进行系统控制和数据评估。在自动柱前衍生化中将1μL的氨基酸溶液与20μl的直接可用的邻苯二甲醛/2-巯基乙醇试剂(Pierce Europe BV，Oud-Beijerland，Netherlands)混合。用渐增的非极性相(甲醇)的梯度程序在前柱(40x4mmHypersil ODS5)和主要柱组合(Hypersil ODS5，两种柱均来自CS-Chromatographie Service GmbH，Langerwehe，Germany)分馏所得的发光的、巯基取代的异吲哚(Jones等，ournal of Chromatography(1983)266:471-482)。极性洗脱液为醋酸钠(0.1M；pH7.2)；流速为每分钟0.8mL。在230nm的激发波长和450nm的反射波长下检测所述衍生氨基酸的荧光。通过与外部标准比较而L-天冬氨酸作为额外的内部标准计算L-鸟氨酸和/或L-鸟氨酸盐酸盐的浓度。

L-鸟氨酸盐酸盐的分子量是168.6g mol^-1而L-鸟氨酸的分子量是132.1g mol^-1。

通过形成的L-鸟氨酸的量(L-鸟氨酸盐酸盐)除以所消耗的蔗糖的量计算产量。

结果示于表3。

表3:孵育24小时(表3A)和48小时(表3B)后的L-鸟氨酸形成。

缩写：ORN-HCL：L-鸟氨酸盐酸盐。

表3A:

表3B:

实施例9

置换构建体pK18mobsacB_homUP_Pg3_hom、pK18mobsacB_ilvAUP_Pg3_ilvA和pK18mobsacB_pycUP_Pg3_pyc的制备

置换载体pK18mobsacB_homUP_Pg3_hom的构建

始自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组序列,在GeneArt(Regensburg，Germany)合成了2549bp的DNA片段(Seq ID No.42)，其携有hom基因上游的部分基因区域、Pgap3启动子和hom基因的部分。经末端引入的切割位点BamHI和XbaI用BamHI和XbaI切割该片段，并继而将其克隆至同样经BamHI和XbaI切割的载体pK18mobsacB。该质粒被命名为pK18mobsacB_homUP_Pg3_hom。

置换载体pK18mobsacB_ilvAUP_Pg3_ilvA的构建

类似地，在GeneArt(Regensburg，Germany)合成了2442bp的DNA片段(Seq ID No.43)，其携有ilvA基因上游的部分基因区域、Pgap3启动子和ilvA基因的部分。经末端引入的切割位点BamHI和XbaI用BamHI和XbaI切割该片段，并继而将其克隆至同样经BamHI和XbaI切割的载体pK18mobsacB。该质粒被命名为pK18mobsacB_ilvAUP_Pg3_ilvA。

置换载体pK18mobsacB_pycUP_Pg3_pyc的构建

类似地，在GeneArt(Regensburg，Germany)合成了2072bp的DNA片段(Seq ID No.44)，其携有pyc基因上游的部分基因区域、Pgap3启动子和pyc基因的部分。经末端引入的切割位点BamHI和HindIII用BamHI和HindIII切割该片段，并继而将其克隆至同样经BamHI和HindIII切割的载体pK18mobsacB。该质粒被命名为pK18mobsacB_pycUP_Pg3_pyc。

实施例10

谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC14310_homUP_Pg3_hom、ATCC14310_ilvAUP_Pg3_ilvA和ATCC14310_pycUP_Pg3_pyc的制备

根据等人的方案(Journal of Microbiology172:1663-1666(1990))，通过接合将实施例9中提到的载体pK18mobsacB_homUP_Pg3_hom、pK18mobsacB_ilvAUP_Pg3_ilvA和pK18mobsacB_pycUP_Pg3_pyc转移至谷氨酸棒状杆菌菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC14310中(类似于实施例4)。

如下引物寡核苷酸用于所述菌株的检测PCR。

用于检测ATCC14310中homUP_Pg3_hom的引物:

Hom_Xl-A1GATCTAGACGTCCAGGAGTTCCTCTACG(SEQ ID No.45)

LC-hom2TGGCGTCCAAGATGAAGTTG(SEQ ID No.46)

通过产生1502bp的DNA片段来检测正确的克隆，所述片段在琼脂糖凝胶中检测并通过测序确认。

用于检测ATCC14310中ilvAUP_Pg3_ilvA的引物:

Pgap3_1.p CGAGTACTATGCATTGAAGCCTAAAAACGACCG(SEQ ID No.47)

ilvA-int-rev2ACCGCGGATCTTGTAGGAAC(SEQ ID No.48)

通过产712bp的DNA片段来检测正确的克隆，所述片段在琼脂糖凝胶中检测并通过测序确认。

用于检测ATCC14310中pycUP_Pg3_pyc的引物:

pycUP_3.p AGCACGTCAGCTGGTTCA(SEQ ID No.49)

2xpyc-1AGGTACGCCTTGACTGGTGA(SEQ ID No.50)

通过产生1004bp的DNA片段来检测正确的克隆，所述片段在琼脂糖凝胶中检测并通过测序确认。

实施例11

异亮氨酸的产生

在每种情况中，在具有折流挡板的锥形瓶(volume:100ml)中，通过于33℃预培养16h的方式，将含有0.5%葡萄糖的10ml Caso培养液与100μl来自实施例10的细菌(ATCC14310衍生菌)培养物一起温育并以200rpm摇动(振幅:5cm)。由所述预培养物，在三个100ml的具有折流挡板的锥形瓶中每个接种10ml的主要培养，其中接种体积为1%。含有40g的葡萄糖、20g的硫酸铵、0.5g的磷酸二氢钾、0.5g的磷酸氢二钾、20g的碳酸钙、0.25g的硫酸镁(七水)、10mg的硫酸铁(七水)、10mg的硫酸镁(x4H2O)、1mg的硫酸锌(七水)、0.2mg的硫酸铜和300mg/l的L-亮氨酸的培养基被用于主要培养。主要培养在33℃和速率200rpm(振幅:5cm)摇床上温育48h。通过离心移除所获得的培养液，并随后在上清中确定异亮氨酸的浓度。表4示出了结果。

表4:48小时的温育后L-异亮氨酸的产生

图1:质粒pK18mobsacB_Pgap3_lysCT311I_asd的图谱

图2:质粒pK18mobsacB_IBcg0054_Pg3_argJB的图谱

图3:质粒pK18mobsacB_homUP_Pg3_hom的图谱

图4:质粒pK18mobsacB_ilvAUP_Pg3_ilvA的图谱

图5:质粒pK18mobsacB_pycUP_Pg3_pyc的图谱

所使用的缩写和名称具有以下含义：

oriV:   源自pMB1的类ColE1

sacB:   编码果聚糖蔗糖酶蛋白的sacB基因

RP4mob:      RP4-活动化位点

Kan:         卡那霉素抗性基因

′cg0057:    编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的cg0057 基因的部分

cg0055:      编码推定的膜蛋白的cg0055基因

′cg0054:    编码铁摄取蛋白cg0054基因的部分

gap终止子:   gap基因的终止序列

启动子:      对应于SEQ ID No.3的gap基因的启动子 (也称作P gap 3)

gap RBS:     gap基因的核糖体结合位点

lysC:        lysC基因的等位基因，编码密集化的天冬氨酸激酶

asd:         编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的asd基因

argJ:        编码谷氨酸N-乙酰基转移酶的argJ基因

argB:        编码N-乙酰谷氨酸激酶的argB基因

homUP:       hom基因上游的基因区部分

hom’:       编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因的部分

ilvAUP:      ilvA基因上游的基因区部分

ilvA’:      编码苏氨酸脱水酶的ilvA基因的部分

pycUP:       pyc基因上游的基因区部分

pyc’:       编码丙酮酸羧化酶的pyc基因的部分

HindIII:     HindIII限制性内切酶的切割位点

BamHI:       BamHI限制性内切酶的切割位点

XbaI:        XbaI限制性内切酶的切割位点

AvrII:       AvrII限制性内切酶的切割位点

NsiI:        NsiI限制性内切酶的切割位点

SphI:        SphI限制性内切酶的切割位点

BlnI:        BlnI限制性内切酶的切割位点