北冬虫夏草MAT1-1-1基因和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Cmgpd)的克隆和分析

摘要

子囊菌(Ascomycetes)是真菌门中最大的一纲,本纲最重要的特征是产生子囊(ascus),内生子囊孢子(ascospore)。子囊是两性核结合的场所,结合的核经减数分裂,形成子囊孢子；其有性生殖过程的研究已有80多年。子囊真菌可根据形态差异分成两组：一组是单核酵母,而另一组是丝状真菌。在所有真菌中,众所周知的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)最有经济价值,被广泛用于面包制作、发酵和酿酒。在丝状子囊菌中,冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是一种丝状真菌,在中国已经作为一种中药被广泛使用了几个世纪。北冬虫夏草(Cordyceps militaris)作为冬虫夏草的替代品也是一种虫生真菌,同样含有很多生物活性成分,例如虫草素(3’-脱氧腺苷)、虫草酸和虫草多糖等。在本研究中,通过高效液相色谱法(HPLC)和苯酚-硫酸法分别检测了冬虫夏草和北冬虫夏草的各个部分中虫草素和虫草多糖的含量。结果表明：北冬虫夏草子实体中的虫草素含量为1.137%,北冬虫夏草菌丝体中的虫草素含量为0.7162%,冬虫夏草中的虫草素含量为0.000523%；北冬虫夏草子实体中的虫草多糖含量为3.35%,北冬虫夏草菌丝体中的虫草多糖含量为3.05%,冬虫夏草中的虫草多糖含量为7.83%。子囊真菌的菌种改良主要依靠随机突变法或经典的遗传育种法,从而筛选出目的特性改良了的突变体或杂交后代。实验室中真菌交配是遗传分析和菌种改良的有利工具。在异宗交配的子囊真菌中,典型的交配只能在形态相同而交配型不同的配偶菌株间进行,而交配型可分为MAT1型和MAT2型。通常MAT1型和MAT2型由单个交配型位点MAT1决定,因为MAT1位点上的等位基因没有相似性,所以这样的等位基因又被称为“独特型”(idiomorph)。MAT1型和MAT2型的独特型分别为MAT1-1和MAT1-2。尽管等位基因MAT1-1和MAT1-2的核苷酸序列相似性很低,但是MAT1-1和MAT1-2的两端侧翼序列具有高度同源性。子囊真菌的交配型等位基因编码含已确定或推测的DNA结合基元的蛋白。这些蛋白作为主要的转录调控因子,控制特异细胞的形成和有性形态的形成的途径。对于交配型的分子特性的充分理解将能降低菌种育种过程中所需花费的劳动力。通过基于PCR的交配型测试,证明本实验室保存的北冬虫夏草的交配型是MAT1型。虽然已有北冬虫夏草MAT1-1等位基因的部分DNA序列报道,但是北冬虫夏草交配型基因MAT1-1-1的3’端序列仍然是未知的。所以通过热不对称交错PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR,TAIL-PCR)技术,扩增了北冬虫夏草的MAT1-1序列全长。结果表明等位基因MAT1-1上含有两个交配型基因MAT1-1-1和MAT1-1-2,但是在MAT1-1-1基因和MAT1-1的3’端侧翼区域中间,并没有发现其它潜在的基因。北冬虫夏草的交配型位点上的MAT1-1的基因组织结构与另一个同科虫生真菌高雄山虫草(C. takaomontana)相似。另一方面,植物病原真菌瘤座菌属(Balansia)的菌种,麦角菌(Claviceps purpurea )和稻香柱菌(Epichloe typhina)同属于麦角菌科,其与虫草菌科的关系非常近,然而这些真菌除了含有MAT1-1-1和MAT1-1-2基因外还含有另外一个交配型基因MAT1-1-3。这些结果暗示麦角菌科的植物病原真菌可能是虫草菌科的虫生真菌的较早的祖先,可能在从植物进入动物的宿主迁移中丢失了MAT1-1-3基因。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GPD)基因的启动子被广泛用于驱动真菌中目的基因的组成型表达。然而,真菌的启动子具有种属的特异性,一些实验证明异源启动子具有较低的驱动活性。为了获得一种高效、稳定的启动子应用于将来的北冬虫夏草的转化实验,本研究利用TAIL-PCR技术,成功克隆了北冬虫夏草GPD基因全长(Cmgpd)。RT-PCR分析表明北冬虫夏草GPD基因是表达的,同时验证了其推测的仅有内含子在转录中已被去除。通过生物信息学分析,表明Cmgpd的上游启动子具有构建高效转化载体的潜在能力,可以用于驱动外源基因在北冬虫夏草中高效的组成型表达。

目录

摘要

ABSTRACT

第一章 研究概述

1.1 北冬虫夏草的研究进展

1.1.1 活性成分

1.1.2 药理功能

1.1.3 开发的产品

1.1.4 发展前景

1.2 丝状子囊菌与生殖相关的研究

1.2.1 丝状子囊菌的生殖周期

1.2.2 丝状子囊菌的交配型的作用

1.2.3 丝状子囊菌与生殖相关的分子生物学研究

1.2.4 真菌交配的策略

第二章 虫草属真菌中主要活性成分含量的比较

2.1 材料与试剂

2.1.1 材料

2.1.2 主要仪器和试剂

2.2 实验方法

2.2.1 北冬虫夏草菌丝体的制备

2.2.2 供测试材料的制备

2.2.3 高效液相色谱法检测虫草素含量

2.2.4 苯酚硫酸法检测虫草多糖含量

2.3 结果与分析

2.3.1 虫草素和葡聚糖测定的标准曲线

2.3.2 不同材料虫草素和虫草多糖含量检测结果

2.4 讨论

第三章 北冬虫夏草交配型基因MAT1-1-1 的克隆和分析

3.1 材料与试剂

3.1.1 菌种

3.1.2 试剂

3.2 实验方法

3.2.1 北冬虫夏草菌丝的培养

3.2.2 北冬虫夏草基因组DNA 的抽提及质量检测

3.2.3 北冬虫夏草交配型的鉴定

3.2.4 北冬虫夏草MAT1-1-1 全长克隆

3.3 结果与分析

3.3.1 所存北冬虫夏草菌株的交配型鉴定结果

3.3.2 北冬虫夏草MAT1-1-1 基因的克隆和分析

3.3.3 MAT1-1 位点的基因结构组织形式的分析

3.4 讨论

第四章 北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Cmgpd)的 克隆和分析

4.1 材料与试剂

4.1.1 菌种

4.1.2 试剂

4.2 实验方法

4.2.1 北冬虫夏草菌丝的培养

4.2.2 北冬虫夏草基因组DNA 的抽提及质量检测

4.2.3 北冬虫夏草总RNA 的抽提及质量检测

4.2.4 北冬虫夏草gpd 基因核心片断的克隆

4.2.5 TAIL-PCR 技术扩增北冬虫夏草gpd 基因全长

4.2.6 北冬虫夏草 cDNA 的合成和 RT-PCR

4.3 结果与分析

4.3.1 抽提的北冬虫夏草基因组DNA、总RNA 的质量评估

4.3.2 北冬虫夏草gpd 基因的克隆结果

4.3.3 北冬虫夏草gpd 基因的编码区序列的分析

4.3.4 北冬虫夏草gpd 基因的5’和3’端侧翼序列的分析

4.3.5 北冬虫夏草gpd 基因的内含子的分析

4.4 讨论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文