狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株及其制备方法和狂犬病活疫苗

摘要

本发明涉及一种狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株及其制备方法和狂犬病活疫苗。其中，狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株表达编码突变糖蛋白，并且所述突变糖蛋白具有下列突变：信号肽第2位的氨基酸缺失；信号肽的第3位的氨基酸缺失；第333位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸；缺失psi假基因区；所述糖蛋白的G基因插入M基因之前。由此上述狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株更安全、有效、成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株及 其制备方法和狂犬病活疫苗。

背景技术

狂犬病是一种人畜共患的病毒性传染病，人一旦发病，病死率为100%。近两年我国人 狂犬病的发病和死亡数均超过3000人/年，并且疫情呈上升态势。人类主要是通过被患有 狂犬病的家养或野生动物咬伤而感染狂犬病毒。因此，控制家养或野生动物狂犬病感染不 仅可以降低这些动物的死亡率，而且可以有效控制人类感染狂犬病毒，是预防狂犬病的有 效手段。

控制动物感染狂犬病毒的主要手段是投撒口服减毒活疫苗。当前所有上市的口服狂犬 疫苗其病毒都来源于Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)株。ERA株是狂犬病病毒街毒 Street-Alabama-Dufferin(SAD)株的固定株。SAD株于1935年从美国阿拉巴马的一条疯狗中 分离，在小鼠脑、幼仓鼠肾BHK-21细胞和鸡胚中进行多次传代减毒后，获得ERA株。传 统的减毒活疫苗由于残余毒力或在体内繁殖变异可能导致接种的动物患病，具有一定的危 险性。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于 提出一种狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株及其制备方法。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株，所述狂犬 病病毒ERA减毒疫苗突变株表达编码突变糖蛋白，并且所述突变糖蛋白具有下列突变：信 号肽第2位的氨基酸缺失；信号肽的第3位的氨基酸缺失；第333位氨基酸由精氨酸突变 为谷氨酸；缺失psi假基因区；所述糖蛋白的G基因插入M基因之前。

根据本发明的具体实施例，上述突变糖蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO：1氨基酸序列为：

MQALLFVPLLVFPLCFGKFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSGFSYM ELKVGYILAIKMNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKM AGDPRYEESLHNPYPDYRWLRTVKTTKESLVIISPSVADLDPYDRSLHSRVFPSGKCSGV AVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERGLYKSLKG ACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSNETKWCPPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVR KREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVETWNEI LPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVLIPEMQSSLLQQHMELLESSVIPLVHPL ADPSTVFKDGDEAEDFVEVHLPDVHNQVSGVDLGLPNWGKYVLLSAGALTALMLIIFL MTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGETRL。

根据本发明的具体实施例，上述突变株的基因组中包含SEQ ID NO：2所示核苷酸序 列。SEQ ID NO：2核苷酸序列为：TGTTAAGCGT CTGATGAGTC CGTGAGGACG AAACTATAGG AAAGGAATTC CTATAGTCAC GCTTAACAAC CAGATCAAAG AAAAAACAGA CATTGTCAAT TGCAAAGCAA AAATGTAACA CCCCTACAAT GGATGCCGAC AAGATTGTAT TCAAAGTCAA TAATCAGGTG GTCTCTTTGA AGCCTGAGAT TATCGTGGAT CAACATGAGT ACAAGTACCC TGCCATCAAA GATTTGAAAA AGCCCTGTAT AACCCTAGGA AAGGCTCCCG ATTTAAATAA AGCATACAAG TCAGTTTTGT CAGGCATGAG CGCCGCCAAA CTTGATCCTG ACGATGTATG TTCCTATTTG GCAGCGGCAA TGCAGTTTTT TGAGGGGACA TGTCCGGAAG ACTGGACCAG CTATGGAATC GTGATTGCAC GAAAAGGAGA TAAGATCACC CCAGGTTCTC TGGTGGAGAT AAAACGTACT GATGTAGAAG GGAATTGGGC TCTGACAGGA GGCATGGAAC TGACAAGAGA CCCCACTGTC CCTGAGCATG CGTCCTTAGT CGGTCTTCTC TTGAGTCTGT ATAGGTTGAG CAAAATATCC GGGCAAAACA CTGGTAACTA TAAGACAAAC ATTGCAGACA GGATAGAGCA GATTTTTGAG ACAGCCCCTT TTGTTAAAAT CGTGGAACAC CATACTCTAA TGACAACTCA CAAAATGTGT GCTAATTGGA GTACTATACC AAACTTCAGA TTTTTGGCCG GAACCTATGA CATGTTTTTC TCCCGGATTG AGCATCTATA TTCAGCAATC AGAGTGGGCA CAGTTGTCAC TGCTTATGAA 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AGGACGCACG TCCACTCGGA TGGCTAAGGG AGGGC。

在本发明的另一方面，本发明还提出了一种制备前面所述的狂犬病病毒ERA减毒疫苗 突变株的方法，包括：

（1）利用表达载体对宿主细胞进行转染；

（2）对步骤（1）中所得到的经过转染的宿主细胞进行培养；

（3）对步骤（2）中所得到的培养物进行过滤，以便获得所述狂犬病病毒ERA减毒疫 苗突变株。

下面详细描述制备狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株的方法。

根据本发明的具体实施例，首先利用表达载体对宿主细胞进行转染。根据本发明的具 体示例，其中，表达载体携带第一核酸分子，第一核酸分子编码突变糖蛋白，并且突变糖 蛋白具有下列突变：信号肽第2位的氨基酸缺失；信号肽的第3位的氨基酸缺失；第333 位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸；缺失psi假基因区；糖蛋白的G基因插入M基因之前。

根据本发明的具体实施例，第一核酸分子编码的突变糖蛋白具有前面SEQ ID NO：1 所示的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，第一核酸分子具有前面SEQ ID NO：2所 示的核苷酸序列。

根据本发明的另一个实施例，第一核酸分子的5’端连接有编码锤头状核酶的核酸分子， 第一核酸分子的3’端连接有编码丁型肝炎核酶的核酸分子。由此可以促进全长病毒RNA的 恢复。

在本发明的一些实施例中，在利用表达载体对宿主细胞进行转染中，可以将表达载体 与辅助载体对宿主细胞进行共转染。根据本发明的具体实施例，辅助载体可以包括:第一载 体，第二载体，第三载体以及第四载体。其中，第一载体携带N基因序列；第二载体携带 P基因序列；第三载体携带L基因序列；以及第四载体携带编码T7RNA聚合酶的核酸分子。

在本发明的一些实施例中，表达载体和第一至第四载体均为pBlue质粒。

在本发明的一些实施例中，用于转染的宿主细胞可以为BHK-21细胞。

在本发明的一些实施例中，用于制备狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株的方法可以具体 包括：将BHK-21细胞于10%的新生牛血清的MEM完全培养基中培养至6孔板90%汇合 度时；用4ug/孔的表达载体和第一载体、第二载体、第三载体以及第四载体脂质体2000法 对所述BHK-21细胞进行共转染；将经过所述共转染后的BHK-21细胞置于5%的CO₂培养 箱中并于37℃的温度下培养4-6小时后弃掉上清液；补加5%的所述新生牛血清的MEM完 全培养基，并置于5%的CO₂培养箱中于37℃的温度下培养72小时，将细胞冻融3次，离 心收集上清液并采用0.22um的滤膜进行过滤，以便获得所述狂犬病病毒ERA减毒疫苗突 变株。根据本发明的具体实施例，上述表达载体为pBlueERA；第一载体为pBlueN(2ug/孔)， 第二载体为pBlue P(1ug/孔)，第三载体为pBlueL(1ug/孔)，第四载体为pT7(2ug/孔)。

根据本发明的具体实施例，狂犬病病毒株ERA从ATCC获得。ERA感染BHK-21细 胞，在补充5%新生牛血清的MEM培养基中生长。上清离心20000g，1小时。收集沉淀 用RNA病毒核酸提取试剂盒提取ERA基因组，凝胶电泳检测基因组完整性。反转录试剂 盒生成ERA基因组cDNA。根据Genebank中ERA序列，设计引物，将全长序列分4段合 成。

1F：GTCACTGGTAACTGGTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACG

AAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCACGCTTAACAACCAGATCAAAG

（KpnⅠ/Ham）（SEQ ID NO：3）

1R：CTGCAGGTTTTTTTCATG（PstⅠ）（SEQ ID NO：4）

2F：CCCGGGAGGCAACACC（SamⅠ）（SEQ ID NO：5）

2R：ACTAGTTAATAGTTTTTTTCAC（SpeⅠ）（SEQ ID NO：6）

3F：CTGCAGAACATCCCTCAAAAGACTCAAGGAAAGATGCAGGCTCTC（PstⅠ） （SEQ ID NO：7）

3R：CCCGGGGTTTTTTTTCAAAAAGAACCCCCC（SamⅠ）（SEQ ID NO：8）

4F：ACTAGTCATTAGATCAGAAG（SpeⅠ）（SEQ ID NO：9）

4R:GCGGCCGCGCCCTCCCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATG CCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCACGCTTAACAAATAA ACAACA(NotⅠ/HdvRz)（SEQ ID NO：10）

G蛋白突变引物

5F：GCTCATACAAGTCGAAACTTGGAATGAGATCCT（SEQ ID NO：11）

5R：AGGATCTCATTCCAAGTTTCGACTGACTTGTAGTGAGC（SEQ ID NO：12）

利用上述引物，通过一系列PCR反应，扩增覆盖基因组的4个片段，利用片段间重叠 的酶切位点，在载体pBluescriptⅡ(+)上连接装配成突变的ERAcDNA克隆，在cDNA两端 分别连接锤头状核酶（Ham）和丁型肝炎核酶（HdvRz），测序正确的质粒则为pBlueERA。 具体克隆过程见下图1。

根据本发明的具体实施例，以pBlueERA为模板，设计引物，分别扩增N、P、L基因 序列，并分别克隆至pBluescriptⅡ(+)载体T7启动子下游，测序正确后，得到pBlueN，pBlue P，pBlueL。

提取大肠杆菌BL21（DE3）基因组，PCR扩增T7RNA聚合酶基因并将其克隆于 pcDNA3.1(+)质粒CMV/T7启动子下游，测序正确后，得到pT7。

根据本发明的具体实施例，上述利用反向遗传学技术以狂犬病毒cDNA为对象进行基 因突变、敲除和位置置换，恢复的突变株比现有疫苗株更安全、更有效、更廉价。

在本发明的再一方面，本发明还提出了一种狂犬病活疫苗，该狂犬病活疫苗包括前面 所述的狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株。该疫苗可用于野生动物，如流浪犬等动物的免疫 预防。由于狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株利用反向遗传学技术获得，更加安全、可靠、 有效，进而降低接种动物患病的风险。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和 容易理解，其中：

图1是根据本发明一个实施例的制备狂犬病病毒ERA减毒疫苗突变株的流程示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同 或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描 述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性 的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1

反向遗传学质粒构建

根据Genebank中ERA序列，设计引物，将全长序列分4段合成（R1-R4）。R1中引入 锤头核酶（Ham），R3引入G蛋白信号肽部分缺失和333位氨基酸突变，R4引入丁型肝炎 核酶。

1F：GTCACTGGTAACTGGTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACG

AAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCACGCTTAACAACCAGATCAAAG

（KpnⅠ/Ham）（SEQ ID NO：3）

1R：CTGCAGGTTTTTTTCATG（PstⅠ）（SEQ ID NO：4）

2F：CCCGGGAGGCAACACC（SamⅠ）（SEQ ID NO：5）

2R：ACTAGTTAATAGTTTTTTTCAC（SpeⅠ）（SEQ ID NO：6）

3F：CTGCAGAACATCCCTCAAAAGACTCAAGGAAAGATGCAGGCTCTC（PstⅠ） （SEQ ID NO：7）

3R：CCCGGGGTTTTTTTTCAAAAAGAACCCCCC（SamⅠ）（SEQ ID NO：8）

4F：ACTAGTCATTAGATCAGAAG（SpeⅠ）（SEQ ID NO：9）

4R:GCGGCCGCGCCCTCCCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATG CCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCACGCTTAACAAATAA ACAACA(NotⅠ/HdvRz)（SEQ ID NO：10）

G蛋白突变引物

5F：GCTCATACAAGTCGAAACTTGGAATGAGATCCT（SEQ ID NO：11）

5R：AGGATCTCATTCCAAGTTTCGACTGACTTGTAGTGAGC（SEQ ID NO：12）

狂犬病病毒株ERA从ATCC获得。ERA感染BHK-21细胞，33℃恒温培养，在补充 5%新生牛血清的MEM培养基中生长96小时。2000g离心10分钟去除细胞，取上清离心 20000g，1小时。收集沉淀，用Life technology公司的病毒RNA提取试剂盒提取ERA基 因组，凝胶电泳检测基因组完整性。用鼠源反转录酶（MLV）试剂盒生成ERA基因组cDNA， 反应体系中加入2ug纯化的ERA基因组RNA，50℃孵育90分钟，80℃孵育5分钟灭活逆 转录酶，然后补加2单位RNase H,37℃孵育20分钟以降解cDNA-RNA杂交链中的RNA。

利用上述引物，扩增覆盖基因组的4个片段R1-R4，方法如下：以上述ERA基因组cDNA 为模板，以1F、1R为引物扩增片段R1，以2F、2R为引物扩增片段R2，以4F、4R为引 物扩增片段R4，所用聚合酶均为高保真Pfu DNA聚合酶；以3F、5R为引物扩增片段R3 的G基因333位突变上游片段，以5F、3R为引物扩增片段R3的G基因333位突变下游 片段；等量上、下游片段混合为模板，以3F、3R为引物扩增片段R3。利用片段间重叠的 酶切位点，在载体pBluescriptⅡ(+)上连接装配成突变的ＥＲＡcDNA克隆，在cDNA两 端分别连接锤头状核酶（Ham）和丁型肝炎核酶（HdvRz），测序正确的质粒命名为 pBlueERA。扩增的R1及质粒pBluescriptⅡ(+)经KpnⅠ和PstⅠ双酶切后用T4DNA连接酶 连接，得到pBlueR1。pBlueR1及R3经PstⅠ和SamⅠ双酶切后用T4DNA连接酶连接， 得到pBlueR13。pBlueR13及R2经SamⅠ和SpeⅠ双酶切后用T4DNA连接酶连接，得到 pBlueR132。pBlueR132及R4经SpeⅠ和NotⅠ双酶切后用T4DNA连接酶连接，得到 pBlueR1324,即pBlueERA。

以pBlueERA为模板，设计引物，分别扩增N、P、L基因序列，并分别克隆至pBlue 载体T7启动子下游，测序正确后，命名为pBlueN，pBlue P，pBlueL。

提取大肠杆菌BL21（DE3）基因组，PCR扩增T7RNA聚合酶基因并将其克隆于 pcDNA3.1(+)质粒CMV/T7启动子下游，测序正确后，命名为pT7。

实施例2

病毒的恢复

BHK-21细胞于10%新生牛血清的MEM完全培养基中培养至6孔板90%汇合度时，脂 质体2000法共转染下列质粒：4ug/孔的pBlueERA和4种辅助质粒pBlueN(2ug/孔)，pBlue P(1ug/孔)，pBlueL(1ug/孔)，pT7(4ug/孔)。转染后细胞置于5%CO₂培养箱37℃培养4-6 小时后弃掉上清，补加5%新生牛血清的MEM完全培养基，并于37℃、5%CO₂培养箱中 培养72小时后，将细胞冻融3次，离心收上清，采用粒径0.22um滤膜过滤，得恢复后病 毒。

实施例3

恢复后病毒的滴定

24孔板培养BHK-21细胞至单层，将恢复后病毒10倍稀释后感染BHK-21细胞。37℃ 5%CO₂培养箱培养72小时后，80%丙酮于-20℃固定半小时，PBS洗涤后用FITC标记的狂 狂犬病病毒N蛋白抗体37℃染色60分钟。PBS洗涤后用荧光显微镜计数荧光孔。结果显 示，恢复后病毒在BHK-21细胞中扩增，其病毒滴度达6×10⁷TCID₅₀/ml。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包 含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定 指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况 下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。