一种大肠杆菌分泌表达外源蛋白的质粒载体及其构建方法

摘要

本发明公开了一种大肠杆菌分泌表达外源蛋白的质粒载体及其构建方法。具体地，本发明公开了一种重组分泌型表达载体，该载体含有碱性磷酸酶PhoA分泌信号肽及多聚组氨酸序列，能够在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达外源重组蛋白。本发明还公开了上述表达载体的构建、PhoA引导肽-外源蛋白融合基因克隆及融合蛋白表达与检测技术。该载体能使外源蛋白在胞外稳定表达，从而可应用于常规蛋白的分泌表达。

说明书

技术领域

本发明涉及用于蛋白的表达与纯化技术领域，具体是涉及分泌表达外源蛋白的质粒载体及其构建方法。 

技术背景

蛋白的表达纯化技术在酶与活性蛋白的低成本提取、蛋白功能研究、蛋白结构分析等多个领域有着较为重要的应用。对所纯化的蛋白最基本的要求是蛋白能较好的分散于相应溶液并具备良好的生物活性。目前常规的表达载体多数基于大肠杆菌胞内表达技术，其优点是大肠杆菌易于培养和破碎，有利于蛋白的纯化。不足是所表达外源蛋白局限于细胞内部，由于空间所限可溶部分的蛋白产量有限，且有很多蛋白因此在胞内形成聚集或包涵体，需要做进一步的变、复性处理。而聚集或包涵体形式的蛋白往往由于各种分子修饰作用，难以重新分散于合适的体系。在寻找复性条件时需要更多的条件摸索过程因而形成成本消耗。 

发明内容

发明人通过克隆技术引入碱性磷酸酶PhoA的信号肽序列构建了能够分泌至大肠杆菌细胞外的外源蛋白表达载体，该载体具备Lac诱导表达系统、PhoA信号肽、多克隆位点、多聚组氨酸标签以及T7终止子，实验验证了外源蛋白的诱导分泌表达能力。因此，本发明为胞外活性外源蛋白的提取提供了一种新的表达载体。 

因此，本发明提供了一种以PhoA信号肽引导蛋白分泌表达的大肠杆菌克 隆表达质粒载体，所述质粒载体含有Lac操纵子-碱性磷酸酶PhoA引导肽-TEV（烟草蚀蚊病毒蛋白酶）识别位点-多克隆位点-多聚组氨酸肽基因序列。 

在一个优选的实施方案中，所述多克隆位点是源于pET22b质粒、位于TEV酶识别序列下游的NcoI至XhoI等系列限制性内切酶识别序列。 

在一个优选的实施方案中，所述多聚组氨酸肽的长度是6个氨基酸。优选地，多聚组氨酸肽基因序列后有T7终止子序列。优选地，所述质粒载体以质粒pET22b（例如其序列为SEQ ID NO.3）构建。 

在一个实施方案中，所述质粒载体的序列是SEQ ID NO.6。 

在一个实施方案中，本发明还提供了含有本发明的表达质粒载体的宿主菌，例如大肠杆菌BL21。在一个实施方案中，所述质粒载体的序列是SEQ ID NO.6。 

在一个实施方案中，本发明还提供了一种构建分泌型融合蛋白的表达质粒载体的方法，所述方法通过PCR扩增技术、限制性内切酶切割和T4连接酶连接，在本发明的表达质粒载体的多克隆位点上插入待表达的外源蛋白肽段基因序列。 

在一个实施方案中，本发明提供了一种诱导分泌型外源蛋白表达的方法，其中本发明的方法构建的分泌型外源蛋白的表达质粒载体在宿主菌受到IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导后表达。在一个具体实施方案中，所述外源蛋白是表面免疫相关蛋白Sip蛋白。在一个具体实施方案中，含所述表面免疫相关蛋白Sip蛋白的表达质粒载体具有SEQ ID NO.9的序列。 

在一个具体的实施方案中，一种检测分泌型外源蛋白方法，其中本发明的表达质粒载体表达的外源蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳方法检测到。在一个具体实施方案中，所述外源蛋白是表面免疫相关蛋白Sip蛋白。在一个具体实施方案中，含所述表面免疫相关蛋白Sip蛋白的表达质粒载体具有SEQ ID NO.9的序列。 

在一个具体的实施方案中，用本发明的表达质粒载体表达的外源蛋白能有效分泌至胞外，提高可溶外源蛋白的产量和得率。在一个具体实施方案中，所述 外源蛋白是表面免疫相关蛋白Sip蛋白。在一个具体实施方案中，含所述表面免疫相关蛋白Sip蛋白的表达质粒载体具有SEQ ID NO.9的序列。 

本发明针对目前大肠杆菌中表达的外源蛋白多为胞内蛋白，从而部分蛋白易于形成包涵体、不利于纯化的问题，设计和构建了在大肠杆菌胞外表达外源蛋白的质粒载体。该载体在商业质粒pET22b的基础上引入碱性磷酸酶PhoA的信号肽，在其下游设计多克隆位点，TEV酶识别切割序列和用于蛋白纯化的多聚组氨酸肽段，实现外源蛋白基因的插入、外源蛋白的分泌表达和活性蛋白的提取。由于采用Lac诱导系统，在IPTG诱导的条件下即可启动外源蛋白的高效表达。该质粒表达体系为外源蛋白的表达和纯化提供新的材料。 

附图说明：

图1为PhoA-Sip融合蛋白表达的SDS-PAGE凝胶电泳图。样品顺序为：M：分子量标记（单位：kDa）。1-3：诱导前的菌液上清(1)、菌体破碎沉淀(2)、菌体破碎上清(3)；4-6：诱导后的菌液上清(4)、菌体破碎沉淀(5)、菌体破碎上清(6)；7、8为不含质粒的BL21全菌（两个重复）。 

图2：商业大肠杆菌表达质粒pET22b中用于外源蛋白基因克隆及表达的主要元件。 

图3：表达质粒中用于外源蛋白基因克隆表达的元件示意图。 

图4：测得序列与设计的质粒pET22b-PhoA预测序列做blast比较的结果。 

图5：将测得序列与含PhoA-Sip序列的融合基因的预测序列做blast比较的结果。 

具体实施方式

下面将结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式做进一步详细描述。以下实施例将有助于说明本发明，但不以任何形式限制本发明。 

1.pET22b-PhoA的构建 

设计上游引物pET22b_phoA-S: 

GGAATTCCATATGAAACAAAGCACTATTGC(5’-3’)（SEQ ID NO.1），和下游引物pET22b_phoA-AS: 

CATGCCATGGCTCCCTGAAAATACAGGTTTTCGGCTTTTGTCACA GGG(5’-3’)（SEQ ID NO.2），以PhoA的基因模板扩增PhoA信号肽基因序列，除了PhoA信号肽的相应匹配序列以外，上游引物带有NdeI酶切位点（连接了相应酶切保护碱基），下游引物带有NcoI酶切位点（连接了保护碱基）、以及TEV酶识别切割序列。扩增PhoA基因序列按Primer Star HS DNA聚合酶(Takara)试剂盒说明书操作。用DNA琼脂糖凝胶电泳方法检测扩增基因片段大小，按照胶回收试剂盒（OMEGA）说明书回收基因，溶解于溶解液或无菌水。 

以NdeI和NcoI(Takara公司)分别对pET22b和所扩增的PhoA信号肽基因酶切，条件参照厂商提供的说明书进行。用DNA胶纯化方法提纯酶切后的片段，16℃下用T4连接酶对酶切后的载体和上述扩增的PhoA信号肽基因序列片段过夜连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，具体方法参照《分子克隆》第三版的CaCl₂热激转化法。以含有氨苄青霉素100μg/mL的LB平板（胰化蛋白胨10gL^-1，酵母提取物5g L^-1，NaCl10g L^-1，琼脂粉20g L^-1，下文LB培养基不含琼脂）对菌落在37℃下进行培养，16-24小时后以菌落PCR的方法对阳性菌落进行筛选。方法如下：准备200微升的PCR小管，加入5-10微升无菌水，以无菌枪头挑取菌落，打散至无菌水中，加入DreamTaq MM试剂盒（Takara）提供的等体积2×缓冲液和适量的DreamTaq MM聚合酶，在PCR仪中进行菌落PCR（引物分别是：pET22b_phoA-S；pET22b_phoA-AS），实验条件参照PCR酶试剂盒提供的说明书设置。 

用DNA琼脂糖凝胶电泳方法检测扩增的基因片段，将正确扩增结果对应的菌落经行培养，送至测序公司测序，以确保质粒的序列正确。抽提质粒保存于-80℃。 

大肠杆菌表达质粒pET22b为商业购买，全长5493bp，环状，序列如下（SEQ ID NO.3）： 

AGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCATGGATATCGGAATTAATTCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACT ATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTT CCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCG GTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGA AACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCG 

在大肠杆菌表达质粒pET22b中，用于外源蛋白基因克隆及表达的主要元件如图2所示。 

设计的待插入外源基因的PhoA-poly His区域序列为（SEQ ID NO.4）： 

ATGAAACAAAGCACTATTGCACTGGCACTCTTACCGTTACTGTTTACCCCTGTGACAAAAGCCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGCCATGGATATCGGAATTAATTCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA 

含上述融合序列的质粒构建过程如下： 

以NdeI和NcoI(其酶切位点以圆圈标记)切除pET22b中pelB leader区域（pET22b中编码介导目的蛋白转移到周质空间的一段导肽，SEQ ID NO.3中下划线所示），得到线性质粒载体片段(I)。 

以实验室保存的PhoA引导肽基因序列ATGAAACAAAGCACTATTGCACTGGCACTCTTACCGTTACTGTTTACCCCTGTGACAAAAGCC（SEQ ID NO.10）为模板，通过引物pET22b_phoA-S和pET22b_phoA-AS扩增，得到如下序列（SEQ ID NO.5）： 

AAACAAAGCACTATTGCACTGGCACTCTTACCGTTACTGTTTACCCCTGTGACAAAAGCCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAG

其中，斜体代表保护碱基，有阴影部分显示酶切序列。该序列经过NdeI和NcoI限制性内切酶消化后，得到片段(II)。将带有互补粘性末端的片段(I)和(II)连接，得到目的表达质粒。序列如下（SEQ ID NO.6）： 

AGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCCATGGATATCGGAATTAATTCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGC AGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACA CTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGT GGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCAC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下划线突出显示的是插入序列，即phoA信号肽(60bp)-TEV识别序列(21bp)-G，其中末端G为增加的碱基，为防止阅读框移码突变而设计。 

该表达质粒中用于外源蛋白基因克隆表达的元件示意图如图3所示。 

样品送至生工生物工程（上海）有限公司进行T7反向测序，将测得序列与设计的质粒pET22b-PhoA预测序列做blast比较，结果如图4所示。 

如图4所示，序列1为pET22b-PhoA测序的序列，序列2为构建质粒的设计序列（取与测序相同数目碱基进行比对），星号为二者相吻合的序列，上述结果表明质粒成功构建。 

2以pET22b-PhoA作为克隆表达载体构建Sip表达质粒 

选用无乳链球菌的表面免疫相关蛋白Sip蛋白为受试蛋白，评价载体对外源蛋白分泌表达的情况。 

以Sip蛋白基因序列为模板，设计带有限制性内切酶SalI和NotI酶切位点接头的上下游引物，上游引物为ACGCGTCGACCAAGAAACAGATACGAC(5’-3’)（SEQ ID NO.7），下游引物为ATAAGAATGCGGCCGCGTTAAAGGATACGT(5’-3’)（SEQ ID NO.8）。按上述第1节所描述的步骤扩增和纯化Sip蛋白基因，以限制性内切酶SalI和NotI对扩增的Sip基因产物和pET22b-PhoA质粒分别进行酶切，胶回收目的片段，16℃下用T4连接酶对酶切后的载体和Sip基因片段过夜连接。 

参照上述第1节所述的步骤，将连接产物转化大肠杆菌和筛选阳性克隆，平板为含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB琼脂平板，扩增引物为Sip基因扩增上下游引物。抽提并保存序列正确的质粒。 

含PhoA-Sip序列的融合基因包括1392碱基对，编码463个氨基酸。其设计序列如下（SEQ ID NO.9）： 

ATGAAACAAAGCACTATTGCACTGGCACTCTTACCGTTACTGTTTACCCCTGTGACAAAAGCCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGCCATGGATATCGGAATTAATTCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACCAAGAAACAGATACGACGTGGACAGCACGTACTGTTTCAGAGGTAAAGGCTGATTTGGTAAAGCAAGACAATAAATCATCATATACTGTGAAATATGGTGAT ACACTAAGCGTTATTTCAGAAGCAATGTCAATTGATATGAATGTCTTAGCAAAAATTAATAACATTGCAGATATCAATCTTATTTATCCTGAGACAACACTGACAGTAACTTACGATCAGAAGAGTCATACTGCCACTTCAATGAAAATAGAAACACCAGCAACAAATGCTGCTGGTCAAACAACAGCTACTGTCGATTTGAAAACCAATCAAGTTTCTGTTGCAGACCAAAAAGTTTCTCTCAATACAATTTCGGAAGGTATGACACCAGAAGCAGCAACAACGATTGTTTCGCCAATGAAGACATATTCTTCTGCGCCAGCTTTGAAATCAAAAGAAGTATTAGCACAAGGGCAAGCTGTTAGTCAAGCAGCAGCTAATGAACAGGTATCACCAGCTCCTGTGAAGTCGATTACTTCAGAAGTTCCAGCAGCTAAAGAGGAAGTTAAACCAACTCAGACGTCAGTCAGTCAGTCAACAACAGTATCACCAGCTTCTGTTGCCGCTGAAACACCAGCTCCAGTAGCTAAAGTAGCACCGGTAAGAACTGTAGCAGCCCCTAGAGTGGCAAGTGTTAAAGTAGTCACTCCTAAAGTAGAAACTGGTGCATCACCAGAGCATGTATCAGCTCCAGCAGTTCCTGTGACTACGACTTCAACAGCTACAGACAGTAAGTTACAAGCGACTGAAGTTAAGAGCGTTCCGGTAGCACAAAAAGCTCCAACAGCAACACCGGTAGCACAACCAGCTTCAACAACAAATGCAGTAGCTGCACATCCTGAAAATGCAAGGCTCCAACCTCATGTTGCAGCTTATAAAGAAAAAGTAGCGTCAACTTATGGAGTTAATGAATTCAGTACATACCGTGCGGGAGATCCAGGTGATCATGGTAAAGGTTTAGCAGTTGACTTTATTGTAGGTAAAAACCAAGCACTTGGTAACGAAGTTGCACAGTACTCTACACAAAATATGGCAGCAAATAACATTTCATATGTTATCTGGCAACAAAAGTTTTACTCAAATACAAATAGTATTTATGGACCTGCTAATACTTGGAATGCAATGCCAGATCGTGGTGGCGTTACTGCCAACCACTATGACCACGTTCACGTATCCTTTAACGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA 

样品送至生工生物工程（上海）有限公司进行T7反向测序，将测得序列与含PhoA-Sip序列的融合基因的预测序列做blast比较，结果如图5所示。 

如图5所示，1为T7反向测序结果，2为插入Sip片段所设计的融合基因序列。星号为二者相吻合的序列，上述结果表明质粒成功构建。 

3以pET22b-PhoA作为表达载体表达分泌型Sip蛋白 

将上述成功构建的质粒转入大肠杆菌BL21，挑单克隆至小量LB培养基（含100μg/mL氨苄青霉素），于37℃摇瓶培养至对数生长期（OD0.6-0.8）。以1%的量转接至100mL LB培养基，37℃摇瓶培养至对数生长期（OD0.6-0.8），加入1-3mM IPTG，转移至16℃摇床培养12-14h。4000×g转速下离心培养液6分钟。将上清转移至干净离心管，同时保留菌体沉淀。上清加入1/10体积的三氯乙酸(TCA)，混匀，4℃下充分沉淀，12000×g转速下离心5-10分钟，移除上清，以去离子水清洗蛋白沉淀，12000×g转速下离心1min。吸去上清，重复洗涤沉淀一次。加入1×上样缓冲液，煮样5-10分钟使样品变性，准备SDS-PAGE鉴定。对于培养液菌体沉淀，对其超声破碎，12000×g转速下离心40min。对上清和沉淀分别加入2×和1×蛋白上样缓冲液。煮样5-10min，准备SDS-PAGE鉴定。按相同制样方法对诱导前的菌样进行处理，准备SDS-PAGE方法鉴定。将SDS-PAGE的所有样品12000×g转速下离心，以上清液上样，按从负极向正极的方向进行电泳。以考马斯亮蓝染色，脱色液对胶脱色以后，观察样品条带。结果如图1所示。 

图1中的SDS-PAGE结果表明，PhoA-Sip蛋白大小在49kDa附近，与预期分子量(48.8kDa)相符，以pET22b-PhoA作为表达载体成功地表达了分泌型Sip蛋白。 

附注：DNA琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳的制胶和缓冲液配制步骤参考《分子克隆》。所有涉及转化和细菌培养的步骤均为无菌操作。