基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法

摘要

本发明涉及一种检测RNA PAS（Poly A Site）的方法，提供了一种基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法，包括含有oligo dT的磁珠制备，即将5'端生物素修饰的oligo dT引物与带链霉亲和素的磁珠混合结合；用所述磁珠与总RNA混合，筛选含有Poly A的RNA；逆转录，双链cDNA第二链合成，双链cDNA断裂；移除Poly A结构；末端修饰后连接测序接头；文库回收。该方法减少了RNA水平操作，在DNA水平移除Poly A序列，消除Poly结构对测序的影响；选择双链DNA断裂酶处理，在不影响文库质量的基础上在DNA水平断裂；简化实验流程，降低实验难度和造价，使其应用范围更广。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测RNA PAS（Poly A Site）的方法，尤其涉及一种基于3T-seq （TT-mRNA Terminal Sequencing）技术在全基因组范围内分析APA(Alternative  Polyadenylation)的方法。

背景技术

在人类基因组中，有一半以上的基因存在多个聚腺苷酸化位点(PAS，Poly A  Site)。在前体mRNA成熟过程中，通过改变前体mRNA的切割位点和聚腺苷酸化 位点（PAS）而从一个编码区产生带有不同长度的3’非编码区(3’UTR)的成熟 mRNA，这种情况称为选择性聚腺苷酸化(APA，Alternative Polyadenylation)。APA 在调控细胞增殖、分化、转运和发育以及疾病发生如肿瘤发生发展等生理和病理过 程都发挥了至关重要的作用。

在全基因组范围内研究APA变化的现有技术有多种，但原理都相近。其中两 种最具有代表性方法为SAPAS（Sequencing APA Sites）和3P-Seq（Poly(A)Position  Profiling by sequencing）。文献记载的SAPAS方法（Fu Y,Sun Y,Li Y,Li J,Rao X, Chen C,Xu A.Differential genome-wide profiling of tandem3'UTRs among human  breast cancer and normal cells by high-throughput sequencing.Genome Res.2011, 21(5):741-747.），其实验原理如下：将RNA直接加热断裂后，用含有oligo dT的 引物逆转录出第一链cDNA，链置换的方法合成双链cDNA。然后用突变的oligo dT （TTTTCTTTTTTCTTTTTT）与测序接头连接作为PCR引物扩增，扩增出的产物 中则不含有poly A结构，以此避免poly A结构对测序质量的影响。文献中记载的 3P-Seq方法（Jan CH,Friedman RC,Ruby JG,Bartel DP.Formation,regulation and  evolution of Caenorhabditis elegans3'UTRs.Nature,2011,469(7328):97-101.），其实验 原理图如下：用oligo dT将含有poly A序列的RNA筛选出后，3'端加上一个带 Biotin修饰的RNA接头，然后经过RNase T1断裂RNA后用含有链霉亲和素的磁 珠筛选含有poly A的片段，再用只含有dTTP的逆转录体系将poly A结构逆转录 成杂合双链，利用RNase H的特性水解poly A结构，将含有APA位点的片段从磁 珠上释放下来，两端加上RNA接头后合成双链cDNA，进行PCR扩增后即为可用 于测序的文库。

现有技术中SAPAS法不能彻底消除polyA未切除对测序的影响，3P-Seq法中 RNA水平操作繁杂，经过多步的RNA连接和酶切，对RNA的损伤和损失也较大， 不适用于少量样品文库的构建。且此方法难度较大、成本较高。另外，操作过程中 断裂方式存在局限性，即3P-Seq法中RNase T1酶切断裂和SAPAS法中RNA直接 加热断裂的方法不能做到既能不损伤RNA同时又能随机断裂。

发明内容

有鉴于现有技术不能彻底消除Poly结构对测序的影响、因操作繁杂引起的 RNA损伤和损失、断裂方式的局限的缺陷，本发明旨在提供一种基于3T-seq （TT-mRNA Terminal Sequencing）全基因组范围分析APA的方法，以尽可能减少 RNA水平操作，在DNA水平移除Poly A序列，消除Poly结构对测序的影响；尽 可能简化实验流程，降低步骤繁琐引起的损失，同时降低实验难度和造价，使其应 用范围更广；选择合适的断裂方法，尽量做到在不影响文库质量的基础上在DNA 水平断裂。

本发明采用以下技术方案解决上述问题：

提供一种基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法，包括：（1）含有oligo dT 的磁珠制备；（2）用所述磁珠与总RNA混合，筛选含有Poly A的RNA；（3）逆 转录，双链cDNA第二链合成，双链cDNA断裂；（4）在DNA水平移除Poly A 结构；（5）末端修饰后连接测序接头；（6）文库回收及扩增。

进一步地，oligo dT引物5'端含有Gsu I酶切位点，用以后续移除Poly A结构。 Gsu I酶可以移除识别位点下游14-16个碱基，使文库分子留下AA的粘性末端。

进一步地，oligo dT引物的5'端含有Gsu I的酶切位点的保护序列。优选地， 保护序列的碱基数为9个。

进一步地，oligo dT引物的5'端用生物素修饰，用以与带链霉亲和素的磁珠 连接。

进一步地，oligo dT引物序列为 5'-GAGCTAGTTCTGGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'。其中，V代表A、C或 G，N代表A、T、C或T。oligo dT引物的3'端一共含有18个T，经过Gsu I酶 切和末端修饰后，文库分子余下2个T作为标记用于测序结果的筛选。采用3T-Seq 技术构建胃癌细胞系的APA文库，经过Illumina测序，共得到30million reads的 数据，采用2个T筛选数据发现92.8%的reads被筛出并成功比对到RNA3'端。 因此认为2个T在后期数据筛选有效测序结果完全足够。增加T的个数来可以提 高筛选效率，根据目前Illumina测序的水平估算，若不超过5个T则不会对测序 质量产生很大的影响。因此本方法适用于2-5个T作为筛选标签的应用。

进一步地，所述逆转录使用未甲基化的dATP、dGTP、dTTP和甲基化的dCTP， 以封闭基因序列中的Gsu I酶切位点。

进一步地，在所述双链cDNA第二链的合成中，使用未甲基化的dCTP、dATP、 dGTP和dUTP，通过RNase H、E.coli DNA聚合酶、E.coli DNA连接酶的作用 进行合成。dUTP代替dTTP合成第二链cDNA，目的是在后续进行文库PCR时加 入USER酶裂解掉第二条链，使测序文库具有链特异性。

进一步地，双链cDNA的断裂使用双链DNA断裂酶处理、DNase I处理或超 声断裂。优选地，采用双链DNA断裂酶处理。优选地，双链cDNA的断裂后，片 段大小在200-400bp，经洗涤后留在所述磁珠上的片段为目的片段。

进一步地，所述移除Poly A结构为：利用Gsu I酶进行酶切，释放连接在所述 磁珠上的目的片段。

进一步地，本发明的方法适用于起始总RNA量为10ug-100ug。

3T-Seq（TT-mRNA Terminal Sequencing）技术是用于在全基因组范围内研究 APA变化的技术。该技术的原理图1所示，首先需要构建一种特殊的含有oligo dT 的磁珠，用这种磁珠筛选含有poly A的RNA，然后在磁珠上逆转录合成第一链 cDNA，逆转录体系中用甲基化的dCTP替代正常的dCTP，随后使用dCTP、dATP、 dGTP、dUTP合成双链cDNA。经过断裂后磁珠上留下的即为含有APA位点的片 段，再经过Gsu I酶切除去poly A结构，将目的片段从磁珠上释放下来，两端经过 修饰后添加Illumina测序接头，经过片段大小筛选后PCR扩增，即得到可用于 Illumina二代测序的文库。

本发明的有益效果为：

1.构建了特殊的含有oligo dT的磁珠，该磁珠既能筛选含有poly A结构的 RNA，同时含有酶切位点可以移除文库中的poly A结构。而普通的商业oligo dT磁 珠只能用于筛选含有poly A的RNA。本发明的磁珠具有以下特点：（1）oligo dT 引物的5'端添加生物素修饰，用于连接带有链霉亲和素的磁珠。（2）oligo dT序 列的5'端加上一个Gsu I的酶切识别位点以及9个碱基的保护序列，用于poly A 结构的移除。（3）磁珠上结合的oligo dT经Gsu I酶酶切后，其3'端保留2-5个T， 能用于后期数据处理时数据的筛选。

2.断裂方式的选择：为了减少对RNA的损伤，本发明选择在DNA阶段断裂， DNA水平断裂与现有断裂方式相比减少了对RNA的损伤，提高了产率。双链cDNA 合成后，使用NEB公司的双链cDNA断裂酶将双链cDNA断裂成200-400bp的片 段，经过磁珠筛选后，挂在磁珠上的片段即为靠近RNA3'端且含有Poly A位点的 片段。

3.移除Poly A结构的策略：为了方便操作和降低实验难度，本发明选择在DNA 水平移除Poly A结构，提高测序质量，使APA的鉴定更加准确。在逆转录时，我 们在oligo dT的5'端引入了Gsu I的酶切识别位点，Gsu I是一种第三型限制性内 切酶，在识别位点的下游16个碱基的位置切割形成两个碱基的粘性末端，而且具 有甲基化封闭敏感特性。当识别位点（CTGGAG）中的碱基C被甲基化时，该识 别位点被封闭，无法被Gsu I识别。由于Poly A结构移除的同时也将文库片段从磁 珠上释放下来，为了防止移除Poly结构时文库片段上也含有这个酶切位点而造成 APA位点的假阳性，我们在逆转录的时候使用甲基化的dCTP替代正常的dCTP， 而在第二链cDNA合成的时候换回正常的dCTP，这样就可以在保证oligo dT中的 Gsu I酶切位点完好而其他识别位点被甲基化封闭，避免了假阳性结果的产生。

4.TT标签用于筛选数据精确定位APA位点。我们设计用于反转的引物中含有 18个T。Gsu I移除Poly A时切去14个A，2个A的粘性末端在末端修饰时被切 除，所以真正留在文库片段上的2个T用以标记文库片段的APA位点。

附图说明

图1本发明的3T-Seq技术的实验原理图。

具体实施方式

具体实施方式中使用的缓冲液成分如下：

配制缓冲液所需的试剂贮存母液（可从商业公司购置，也可购买相关试剂自行 配制）：

结合缓冲液1（20ml）：

DEPC处理水        10ml

5M NaCl           8ml

0.5M EDTA(PH8.0)  2ml

结合缓冲液2（20ml）：

洗涤缓冲液A（20ml）：

洗涤缓冲液B(20ml)：

洗涤缓冲液C(20ml)：

洗涤缓冲液D(20ml)：

以下洗涤缓冲液的配制母液均来源于相关商业公司产品，需要在相关公司购置 母液按照以下配方配制，建议每次实验时新鲜配制使用：

洗涤缓冲液1（400μl）：

DEPC处理水                          280μl

5×First-Strand Buffer(Invitrogen)  80μl

0.1M DTT(Invitrogen)                40μl

洗涤缓冲液2（200μl）：

无菌水                               178μl

10×Fragmentase Reaction Buffer(NEB) 20μl

100×BSA(NEB)                        2μl

洗涤缓冲液3（300μl）：

无菌水                               267μl

10×Buffer B(Fermentas)              30μl

100×BSA(NEB)                        3μl

洗涤缓冲液4：

无菌水                              176μl

10×Buffer B(Fermentas)             20μl

0.5mM SAM(Fermentas)                4μl

基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法的如下：

1.总RNA的抽提：

利用Trizol法或商业试剂盒从细胞或者组织抽提总RNA，用琼脂糖甲醛变性 电泳或者安捷伦2100Bioanalyzer检测RNA质量，高质量的RNA做起始材料对精 确分析APA变化很重要。本具体实施方式要求电泳结果能清晰看出28S rRNA和 18S rRNA条带并估算比值为2:1或者2100Bioanalyzer结果显示RIN值大于9.0。

2.带有oligo dT引物的磁珠的制备：

含有Gsu I酶切识别位点的oligo dT引物直接在商业公司合成，其序列为 5'-GAGCTAGTTCTGGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'，5'端需要生物素修饰。 将合成好的引物溶于RNA级别的10mM Tris-HCl（pH=7）配成100μM的溶液。 取50μl的M280链霉亲和素的磁珠（Invitrogen），用结合缓冲液1洗涤磁珠3次， 每次100μl。然后取5μl100μM的oligo dT引物与95μl结合缓冲液1进行混合，然 后与洗涤后的磁珠室温结合过夜，结合过程放置在INTELLI-MIXER混匀仪 （ELMI）上，防止磁珠沉淀。将未与磁珠结合的过量oligo dT引物用结合缓冲液 2洗去，共洗涤3次，每次100μl，即制成可用于本实验的带有oligo dT引物的磁 珠。

3.筛选带有Poly A的RNA：

使用第2步制成的带有oligo dT引物的磁珠，从总RNA中筛选含有Poly A的 RNA，本技术适用于10ug-100ug的总RNA做为起始材料。首先将总RNA在65 ℃加热5分钟后迅速入冰上，用结合缓冲液2将总RNA体积调至1ml，然后与新 鲜制成的带有oligo dT引物的磁珠混合，室温结合5-10分钟，用手轻摇，防止磁 珠沉淀。然后用洗涤缓冲液A洗涤2次，每次500μl，接着用洗涤缓冲液B500μl 洗涤1次，用以除去未结合的RNA。然后用1×第一链缓冲液III  Reverse Transcriptase附带5×第一链缓冲液稀释而来）洗涤4次，每次100μl。

4.逆转录：

将正常的dATP、dGTP、dTTP和甲基化的dCTP混合配成2.5mM“dNTP” 混合液用于逆转录，使用甲基化的dCTP以封闭基因序列中的GsuI酶切识别位点。 逆转录体系参考逆转录酶III Reverse Transcriptase（Life  Technologies）的说明书，反应直接在磁珠上进行，将反应体系放大至90μl，反应 温度选择42℃，防止温度较高致使链霉亲和素和生物素解离。

5.第二链的合成：

用洗涤缓冲液1洗涤磁珠3次，每次100μl，除去甲基化的dCTP，洗涤后用 30μl洗涤缓冲液1重悬磁珠。用dATP、dGTP、dCTP、dUTP混合配成10mM“dNTP” 备用。在重悬磁珠体系中按次序加入预冷的超纯水184μl、10×第二链缓冲液 Second Strand Synthesis(dNTP-Free)Reaction Buffer，NEB公司） 25μl、10mM“dNTP”5μl、E.coli DNA连接酶1μl、E.coli DNA聚合酶4μl， E.coli RNase H1μl（以上酶均购于NEB），混匀后置于舒适型恒温混匀器中 （Thermomixer comfort，Eppendorf）16℃反应2小时。反应结束后用加热至75℃ 的洗涤缓冲液C洗涤磁珠2次，每次200μl，以终止反应。然后用洗涤缓冲液D 洗涤磁珠3次，每次200μl，以除去洗涤缓冲液C中的SDS等成分，以避免它们 对后续反应的影响。

6.双链cDNA的断裂：

用洗涤缓冲液2洗涤磁珠2次，每次100μl，然后用双链DNA断裂酶（NEB dsDNA Fragmentase）将双链cDNA断裂成200-400bp大小的片段，方法参 考酶的说明书。用洗涤缓冲液3洗涤3次，每次100μl，留在磁珠上的片段即为我 们的目的片段。

7.移除Poly A结构：

用洗涤缓冲液4洗涤磁珠2次，每次100μl，然后用Gsu I酶（Fermentas）酶 切，切除Poly A序列，同时将目的片段从磁珠上释放。酶切体系参考酶的说明书。 使用酚氯仿抽提结合乙醇沉淀的方法纯化酶切释放的文库片段。

8.末端修饰1：

采用末端修饰试剂盒（Fast DNA End Repair Kit，Thermo Scientific）使目的片 段两端形成平末端且5'端加上磷酸化基团，用于Illumina测序接头的连接。

9.末端修饰2：

用Taq DNA聚合酶（Fermentas）在末端修饰后的目的片段3'端添加一个碱基 A，用于Illumina测序接头的连接。此步与第8步可以合为一步做到，以减少步骤 繁杂引起的损失，目前已经有试剂盒Ultra End Repair/dA-Tailing  Module）可以完成。

10.连接测序接头：

将末端修饰后的目的片段与Illumina P5/P7接头（可在Illumina网站查询序列 信息，自行在商业公司合成）连接，连接酶选用T4DNA连接酶（Fermentas），体 系参考说明书。

11.文库回收：

用2.5%的琼脂糖凝胶电泳分离过量接头，同时进行文库片段大小筛选，割胶 回收200-500bp范围内的文库。采用High-Fidelity DNA聚合酶（NEB）扩增 回收的文库，通过8%的聚丙烯酰胺电泳纯化回收后即可用于Illumina2×100双向 测序。聚丙烯酰胺电泳回收纯化时可根据Marker指示再次筛选片段大小 （200-500bp），对文库片段大小的精确控制有利于提高测序质量。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员 无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领 域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的 实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。