表达α-gal表位的卵巢癌干细胞疫苗及其制备方法

摘要

本发明涉及表达α-gal表位的卵巢癌干细胞疫苗及其制备方法。具体地，提供了一种能够表达α-gal表位的慢病毒表达载体、包含该表达载体的卵巢癌细胞株及其制备方法、表达α-gal表位的卵巢癌干细胞疫苗，以及上述表达载体、卵巢癌细胞株和卵巢癌干细胞疫苗的用途。本发明应用慢病毒载体向卵巢癌细胞SKOV3中引入外源基因猪的α(1,3)GT，可使SKOV3细胞表达α(1,3)GT，并且感染后的细胞传代10代以上或是冻存复苏后仍可稳定表达，因而其在卵巢癌干细胞疫苗的制备方面具备广阔的应用前景。

说明书

【技术领域】

本发明涉及疫苗技术领域，具体地说，是表达α-gal表位的卵巢癌干细胞疫苗及其制备方法。

【背景技术】

卵巢癌是妇科肿瘤中主要的死亡疾病之一，其中以上皮性卵巢癌最为多见，虽然卵巢癌一经确诊之后可以手术结合放化疗治疗，而且在最初的治疗阶段超过70%的病人是对治疗有敏感反应的，但是卵巢癌的5年生存率仍低于30%。其中一个最重要的原因是多数卵巢癌患者，尤其是上皮性卵巢癌患者在接受再次化疗治疗的过程中很容易对顺铂、泰素等常用的卵巢癌化疗药物产生耐受，从而导致肿瘤的复发。近几年，出现了一个新的理论来解释肿瘤的这种耐药和复发转移，那就是肿瘤干细胞（cancer stem-like cell，CSC）理论，也称为肿瘤起始细胞（cancer initiating cell，CIC）理论。根据肿瘤干细胞理论，肿瘤细胞中存在着很小一部分的细胞，这部分细胞具有干细胞的特性，能够自我更新和分化，生命周期多数处于休眠期，而且类似于ABCG2药物泵这样的耐药基因表达上调，因此这部分细胞对于化疗药物不敏感，正是它们介导了化疗过程中肿瘤细胞耐药和复发的生物学行为。现在，研究者们已经从多种类型的肿瘤中发现肿瘤干细胞的存在并且将这些细胞分离出来进行研究。肿瘤干细胞通常呈球团样生长，高表达干细胞基因，更耐药更易成瘤，因此，肿瘤干细胞的靶向性治疗是克服肿瘤耐药、复发和转移的关键。

肿瘤的免疫治疗是近年来受到关注的新疗法之一。理论上，肿瘤细胞会过表达一些肿瘤相关性抗原（tumor-associated antigens，TAAs）或肿瘤特异性抗原（tumor-specific antigens，TSAs），这些抗原在正常细胞中是低表达的或者不表达的，机体的免疫监视系统能够发现这些异常的抗原并将其清除。但是，肿瘤细胞的免疫逃逸机制相对复杂，尽管肿瘤细胞可以过表达肿瘤相关抗原，具有一定的免疫原性，但通常情况下肿瘤相关抗原的免疫原性很弱，不足以引起抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）的识别。于是，研究者们给机体输入具有肿瘤抗原性的免疫制剂，希望以此来刺激免疫系统产生抗肿瘤效应，我们将此称之为肿瘤疫苗治疗。最简单的肿瘤疫苗治疗就是将灭活的肿瘤细胞注射患者，但由于肿瘤相关抗原性弱的原因得不到很好的疗效；为进一步提高疗效，研究者在体外将某个肿瘤相关抗原的多肽结构直接利用脉冲技术将其与树突状细胞（dendritic cells，DCs）融合，再将经过处理的树突状细胞免疫肿瘤患者，该种疫苗的疗效较前者增加。但是在许多肿瘤，如胰腺癌、肾癌、卵巢癌等高复发率的肿瘤中，还并没有鉴定出特异性的肿瘤相关抗原。从人体内获得大量的树突状细胞在体外培养处理后再回输到人体内也需要克服细胞来源不充足和专业技术的难题，而且研究证明单纯地使用一种抗原来激发机体的抗肿瘤效应是完全不够的。

研究发现，抗原提呈细胞能否有效地摄取抗原并提呈抗原是肿瘤疫苗成功的关键，而抗原提呈细胞摄取抗原又依赖于抗体Fc段与抗原提呈细胞表面的Fcγ受体的结合（刑力, 郭礼和. (2001) 利用人的天然抗体抗肿瘤.中国肿瘤生物治疗杂志.8,67-69.）。Galili 等（Galili U, LaTemple DC. (1997) Natural anti-Gal antibody as a universal augmenter of autologous tumor vaccine immunogenicity. Immunol Today. 18, 81-5.）发现在非灵长类哺乳动物及新世纪猴的细胞上大量存在一种糖类表位Gal α(1,3) Gal（gal epitope），它是由这些动物体内的一种半乳糖基转移酶lβ1,4GlcNAc3-α-D-galactosyltransferase [α(1,3)GT] 催化生成。而人和旧世纪猴在进化的过程中编码α(1,3)GT的基因失活了，所以在我们人体内没有α(1,3)GT这种酶，进而人体内也不存在gal表位；像ABO血型抗体一样，人在出生时就自然地带上了抗gal表位的抗体anti-gal。这种抗体形成了非灵长类动物如猪的器官向人类移植的主要障碍（Cooper DKC. (1998) Xenoantigens and xenoantibodies. Xenotransplantation. 5,6-17.），一旦抗gal抗体与供体器官血管上皮表达的gal表位结合，抗体的Fc段即可引发补体激活进而引起超急性的免疫排斥反应。在体外用α(1,3)GT基因转染人体肿瘤细胞后，肿瘤细胞中含有糖链的蛋白（其中含肿瘤相关抗原）就能生成gal抗原表位，然后将肿瘤细胞灭活后作为疫苗注射入体内，在体内的天然抗体anti-gal就能与其结合形成抗原抗体复合物，通过anti-gal的Fc段可发挥免疫细胞的调理作用使细胞破碎死亡进一步释放肿瘤抗原，同时通过APC细胞表面的Fc受体与anti-gal Fc的结合增强了APC细胞对肿瘤抗原的吞噬及加工，进而向T淋巴细胞提呈抗原，并激活其免疫活性。然而目前还没有使得卵巢癌细胞稳定表达α(1,3)GT的相关报道。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种表达载体。

本发明的再一的目的是，提供一种卵巢癌细胞株。

本发明的另一的目的是，提供上述卵巢癌细胞株的制备方法。

本发明的第四个目的是，提供一种表达α-gal表位的卵巢癌干细胞疫苗。

本发明的第五个目的是，提供如上所述的表达载体、如上所述的卵巢癌细胞株以及如上所述的表达α-gal表位的卵巢癌干细胞疫苗的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种表达载体，所述的表达载体是pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒，所述的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒的多克隆位点内连接有如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种卵巢癌细胞株，所述的卵巢癌细胞株转染有如上所述的表达载体。优选地，所述的卵巢癌细胞株是SKOV3细胞。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：如上所述的卵巢癌细胞株的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：

a）用三质粒包装系统转染293T细胞获得病毒液，所述的三质粒包装系统为包壳质粒VSVG、辅助包装质粒pCMV dR8.91和如上所述的表达载体；

b）用步骤a）的病毒液转染卵巢癌细胞株。

优选地，步骤b）中所述的病毒液的感染复数为40。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：一种表达α-gal表位的卵巢癌干细胞疫苗，所述的表达α-gal表位的卵巢癌干细胞疫苗含有如上任一所述的卵巢癌细胞株。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：如上所述的表达载体、如上所述的卵巢癌细胞株以及如上所述的表达α-gal表位的卵巢癌干细胞疫苗在制备预防卵巢肿瘤的药物中的应用。

本发明优点在于：本发明将卵巢癌干细胞和gal表位的表达相结合，应用慢病毒载体向卵巢癌细胞SKOV3中引入外源基因猪的α(1,3)GT，使SKOV3细胞能表达α(1,3)GT，然后在无血清悬浮的培养条件下富集表达gal表位的卵巢癌肿瘤干细胞，实验证实，病毒液感染SKOV3细胞后在mRNA水平可检测到α1,3GT的表达，蛋白水平可检测到gal表位的表达，并且将感染后的细胞传代10代以上未见GFP蛋白的表达降低，-80℃冻存6个月后复苏也未见GFP蛋白的表达降低，表明其表达α1,3GT十分稳定，在卵巢癌干细胞疫苗的制备方面具备广阔的应用前景，取得了预料不到的技术效果。

【附图说明】

附图1A、图1B、图1C分别是pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP、辅助包装质粒pCMV dR8.91、包壳质粒VSVG的质粒图谱。

附图2是构建的表达质粒pCDH-α-1,3GT酶切后电泳结果。

附图3是显微镜及流式检测感染了不同稀释度的慢病毒72小时后293T细胞GFP的表达情况。

附图4是不同MOI值下SKOV3细胞的GFP表达情况。

附图5是慢病毒感染后SKOV3细胞表达α1,3GT mRNA的情况。

附图6是流式检测感染了α1,3GT慢病毒的SKOV3细胞膜上gal表位的表达。

附图7是SKOV3细胞在非贴壁无血清培养条件下可形成球团样细胞。

附图8是SKOV3悬浮细胞和SKOV3贴壁细胞中Oct4和Nanog的表达差异。

附图9是SKOV3悬浮细胞和SKOV3-gal悬浮细胞中Oct4和Nanog的表达。

附图10是SKOV3和SKOV3-gal细胞的生长曲线。

附图11是SKOV3细胞和SKOV3-gal细胞与人血清孵育后的相对细胞存活率。

附图12是将从正常人外周血中分离得到的单核淋巴细胞和SKOV3-gal肿瘤细胞共培养，24小时后的流式细胞凋亡检测结果。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、材料与方法

1、α-1,3GT表达载体的构建

根据Yu等（Yu, L.Y., Miao, H.S., and Guo, L.H (2005) Effect of RNA Interference on Gal Alpha 1,3 Gal expression in PIEC Cells. DNA AND CELL BIOLOGY. 4, 235-243.）发表的文章得到扩增α-1,3GT CDS全长的引物序列，结合表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒（购自System Bioseiences公司，图谱见图1A）多克隆位点，最终选取XbaI（TCTAGA）和BamHI（GGATCC）酶切位点作为α-1,3GT CDS序列的插入位点，分别在上游引物和下游引物的5’端加上这两个酶切位点序列，引物（见表1）交给上海生工生物有限公司合成。引物合成后按照高保真PCR酶KOD-Plus-Neo（Toyobo 日本）说明书扩增DNA序列，然后分别对目的基因α-1,3GT和表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒进行酶切及琼脂糖凝胶回收。最后连接目的基因α-1,3GT（SEQ ID NO.11，共1191bp）和载体质粒，得到表达质粒pCDH-α-1,3GT。

表1 引物序列

2、磷酸钙法转染质粒进行pCDH-α-1,3GT慢病毒的包装

我们采用三质粒包装系统（包壳质粒VSVG、辅助包装质粒pCMV dR8.91、表达质粒pCDH-α-1,3GT）进行包装，其中辅助包装质粒pCMV dR8.91、包壳质粒VSVG购自System Bioseiences公司，载体图谱分别如图1B和图1C所示。质粒转染前一天将293T细胞进行消化铺板，转染前给293T细胞换上新鲜的培养液（500 mL DMEM培液（购自美国Hyclone公司产品）+50 mL FBS+5mL青链霉素双抗（终浓度1%）+5 mL丙酮酸钠）（终浓度1%），其中青链霉素双抗和丙酮酸钠均购自美国Sigma-Aldrich公司，上述培养液中还加入氯喹，使其终浓度为25 μM，然后放入37℃培养箱培养1小时。同时制备磷酸钙-DNA复合物，在15 mL离心管中依次加入下列试剂：30 μg pCDH-α-1,3GT，20 μg  pCMV dR8.91，10 μg VSVG，加ddH₂O 至总体积为1350 μL，ddH₂O 加入之后用电子移液枪持续吹打溶液，用另一移液器逐滴加入2.5 M CaCl₂ 150 μL直至滴完，继续吹打溶液，再逐滴加入2×HBS 1500 μL 直至滴完，以确保形成尽可能细小的沉淀。将上述复合物加入培养皿，十字交叉混匀，置于37℃、5%CO₂培养箱培养。293T细胞转染24小时之后，将原先的培养液换成慢病毒生成培养液（500 mL Ultraculture培液(美国Lonza公司)+5 mL青链霉素双抗(终浓度1%)+5 mL丙酮酸钠(终浓度1%)+5 mL丁酸钠(终浓度1%，美国Sigma-Aldrich公司)），继续培养24小时后收集培养液，并向培养皿中加入新鲜的慢病毒生成培养液，收集的培养液2000 rpm离心5分钟后取上清置于干净的50 mL离心管中，4℃保存。24小时后再次收集培养液同上离心保存。将两次收集的病毒液合并并用0.45 μm滤器过滤，进一步去除细胞碎片。取20%蔗糖溶液铺于超速离心管管底部，将收集并过滤的病毒液小心地加入离心管，28000 rpm、4℃离心2小时。离心结束，去除上清，用滤纸吸干离心管壁上的残液，加入预冷的PBS重悬慢病毒，置冰上30分钟至1小时，将重悬的慢病毒液移入干净的1.5 mL离心管，放入程序性冻存盒置于-80℃冻存。

3、慢病毒感染贴壁SKOV3细胞

用10倍梯度稀释的方法进行慢病毒感染293T细胞后流式测定慢病毒滴度。进行慢病毒滴度测定后于感染前一天，将贴壁培养的SKOV3细胞用胰酶消化成单个细胞悬液并计数，取10⁵个细胞/孔接种于12孔培养皿。感染当天根据所测得的慢病毒滴度计算出不同MOI值所需的慢病毒液体积，吸取所需的慢病毒量加入含SKOV3细胞和培养液的培养孔中，十字交叉晃匀，置于37℃、5%CO₂培养箱培养72小时后显微镜下观察SKOV3细胞GFP蛋白的表达情况，根据GFP的表达情况，确定SKOV3细胞感染慢病毒的最佳MOI值。同时以流式技术检测感染慢病毒后的SKOV3细胞表达α-gal表位的情况。

4、感染慢病毒的贴壁SKOV3细胞的悬浮培养

首先处理培养皿，将用95%乙醇溶液溶解稀释的终浓度为12 mg/mL的Poly-HEMA溶液（购自美国Sigma-Aldrich公司）加入培养皿中，37℃培养箱中孵育4小时，4小时后将多余的Poly-HEMA溶液吸净，再将培养皿放入37℃培养箱烘3天使皿底的Poly-HEMA完全烘干并牢固附着于皿底。3天之后取出培养皿用含双抗的PBS漂洗2-3次，紫外灭菌30分钟后即可使用。贴壁的SKOV3细胞经胰酶消化成单个细胞后用PBS洗1次，将细胞用ES培养液（购自美国Chemicon公司，具体含无血清DMEM/F12培养液、Knockout血清、左旋谷酰胺、非必需氨基酸、2-β-巯基乙醇、碱性成纤维细胞生长因子、人白血病抑制因子、青链霉素双抗）重悬后轻柔地加入已经处理好的培养皿，勿将皿底的Poly-HEMA层破坏，补充足量的ES培养液，于37℃、5%CO₂的培养箱培养。一般培养三天后可形成较疏松的球团细胞。

5、α1,3GT的表达对SKOV3细胞增殖的影响及SKOV3-gal细胞免疫机制研究

（1）将正常人的血清按不同的稀释度加入培养皿中，和细胞在37℃孵育1小时后以MTT法检测人血清对细胞的毒性作用，计算细胞存活率。

（2）将从正常人外周血中分离得到的单核淋巴细胞和肿瘤细胞共培养，24小时后以流式技术检测细胞凋亡。实验分为四组：A2：SKOV3细胞+单核淋巴细胞；A3：SKOV3细胞+血清+单核淋巴细胞；B2：SKOV3-gal细胞+单核淋巴细胞；B3：SKOV3-gal细胞+血清+单核淋巴细胞。

二、结果

1、α-1,3GT表达载体的成功构建

将目的基因α-1,3GT和载体质粒连接后的产物转化感受态的大肠杆菌，进行摇菌与质粒抽提，将抽得质粒进行XbaI和BamHI酶切验证，可见1-4号菌抽提所得质粒（未酶切和酶切后一一对应）经酶切后均出现了符合目的基因片段大小的片段（1191 bp）（见图2），说明目的基因已被成功连接到载体质粒中。

2、慢病毒的成功包装

通过三质粒包装系统在293T细胞中将重组质粒pCDH-α1,3GT包装成慢病毒。将纯化浓缩的慢病毒液感染293T细胞，72小时后可在显微镜下见GFP蛋白的表达（见图3），同时通过流式技术检测GFP的阳性表达率，从而计算出所得慢病毒液的病毒滴度。

3、SKOV3细胞成功地感染α1,3GT慢病毒

设定不同的病毒感染MOI值（一个细胞感染的病毒颗粒数）后，取所需量的病毒液感染SKOV3细胞72小时后，在显微镜下可见GFP蛋白的表达（见图4），根据不同MOI值下GFP的表达情况确定了SKOV3细胞的最佳感染值为40。取MOI值40下感染的细胞进行总mRNA抽提行qRT-PCR检测，可见慢病毒感染SKOV3细胞的α1,3GT mRNA表达较未感染细胞上升了250多倍 （**表示p<0.01）（见图5）。通过生物素化植物凝集素和亲和素化PE-Cy5对α-gal进行标记以流式技术检测感染慢病毒后的SKOV3细胞表达α-gal表位的情况，发现gal表位的表达阳性率达到了99%以上（见图6）。

将感染慢病毒后的细胞继续培养，传代10代以上仍有稳定的GFP蛋白表达，将细胞进行冻存，6个月后重新复苏该细胞，镜下仍可见稳定的GFP蛋白的表达。

结合以上结果，可以证实采用慢病毒感染的方式可将目的基因α1,3GT引入并整合到SKOV3细胞基因组，并且在mRNA和蛋白水平均能有效地进行转录和翻译，且在MOI值40下的感染效率达到了99%以上，该引入的基因不会因为宿主细胞的增殖和传代而丢失。可以认为感染后所得到的SKOV3细胞株为较纯的能稳定表达gal表位的SKOV3-gal细胞株。

4、肿瘤干细胞的成功富集

SKOV3细胞在经过Poly-HEMA处理的培养液中用无血清的ES培养基培养后可形成球团样细胞（见图7）。悬浮培养1周后将细胞进行总RNA抽提后行realtime-PCR（见表1）检测其干性基因的表达（见图8）。如图所示，悬浮细胞和贴壁细胞相比，两个干性基因Oct4和Nanog分别提高了2.3倍和3.9倍，且均具有统计学差异（*p<0.05）。同时SKOV3和SKOV3-gal细胞经悬浮培养7天后，将这两种悬浮细胞的Oct4和Nanog的表达进行比较（见图9），如图所示，两种悬浮细胞中α1,3GT的表达量SKOV3-gal细胞明显高于SKOV3细胞（**p<0.01），但是两者的干性基因Oct4和Nanog的表达量并没有统计学上的差异。此外，以MTT法检测SKOV3细胞和SKOV3-gal细胞的增殖是否有差异，96孔板铺板后连续检测6天，绘制生长曲线（见图10），数据经统计学分析并无差异，提示α1,3GT的表达不会改变细胞的增殖状态。

5、SKOV3-gal细胞能被人外周血单核淋巴细胞通过ADCC（抗体依赖的细胞介导的细胞毒）作用杀伤

（1）人体内天然的存在抗gal表位的抗体，抗体与细胞膜上的gal表位结合后，抗体的Fc段激活补体系统，最终在细胞膜上形成攻膜复合物，导致细胞的凋亡。我们将正常人的血清按不同的稀释度加入培养皿中，和细胞在37℃孵育1小时后以MTT法检测人血清对细胞的毒性作用，计算细胞存活率（见图11）。如图所示，将血清与SKOV3-gal细胞共同孵育后并未对细胞产生明显的杀伤作用（p>0.05）。

（2）抗原抗体复合物形成后，不仅可以通过激活补体系统来杀伤抗原细胞，还能通过抗体Fc段介导的细胞毒作用达到杀伤的目的。我们将从正常人外周血中分离得到的单核淋巴细胞和肿瘤细胞共培养，24小时后以流式技术检测细胞凋亡（见图12）。如图所示：A2：SKOV3细胞+单核淋巴细胞；A3：SKOV3细胞+血清+单核淋巴细胞；B2：SKOV3-gal细胞+单核淋巴细胞；B3：SKOV3-gal细胞+血清+单核淋巴细胞。B3组的细胞凋亡率明显大于B2组，也大于A3组（**p＜0.01）。

综合上述结果，α1,3GT的表达不会影响SKOV3细胞的增殖，表达gal表位的SKOV3细胞不是通过补体系统而是通过ADCC作用被杀伤。

综合上述结果，我们首次成功获得表达α-gal表位的卵巢癌干细胞，且gal表位的生成对肿瘤干细胞干性基因的表达以及细胞的增殖状态均没有影响；SKOV3-gal细胞能被人外周血单核淋巴细胞通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用杀伤。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。