红花查尔酮异构酶CHI基因及应用

摘要

本发明公开了红花查尔酮异构酶CHI基因，是以红花花瓣的RNA反转录的cDNA为模板，进行3’、5’race克隆，分别得到红花CHI基因的3’、5’端序列，通过拼接得到红花CHI序列，全长基因为1161bp，开放阅读框长度为654bp，命名为ct-CHI，将其在ncbi上进行序列比对分析，发现该基因与青木香CHI基因的同源性达到82%，经实验表明，超表达ct-CHI基因能够促进黄酮的合成，ct-CHI基因被抑制后能够降低黄酮含量，在培育高含量黄酮化合物转基因植物方面具有广阔的前景。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及红花查尔酮异构酶CHI基因及应用。

背景技术

    红花（Carthamus tinctorius L.）为一年生草本植物，属菊科植物的干燥管状花。红花具有活血通经，去瘀疗伤，宣毒透疹等功效，其主要有效成分为红花黄色素和红花红色素。红花黄色素为红花中多种水溶性查尔酮成分的混合物，不但是很有价值的食用色素，而且具有活血通络、消炎镇痛等功效，在血管性疾病、高血压、糖尿病并发症等发面亦有重要作用。查尔酮异构酶（Chalcone isomerase，CHI；EC5.5.1.6）是植物黄酮化合物合成途径中的关键酶之一，在黄酮化合物合成中将查尔酮异构化产生槲皮素。目前，国内外关于查尔酮异构酶的研究报道较多，主要集中在葫芦巴、青木香属、苜蓿、水稻、柑橘、桑树、金茶花、水仙、花生等多种作物中。但在红花中关于查尔酮异构酶基因的克隆及表达分析还未见报道。

发明内容

本发明的目的是为提高植物中黄酮化合物含量，提供一种红花查尔酮异构酶CHI基因。

红花查尔酮异构酶CHI基因，其碱基序列如序列表SEQ ID No.1或2所示；

一种表达载体，它插入了包括序列表SEQ ID No.2所示基因；

所述的表达载体，为pCAMBIA1304-bar，它是用bar基因序列替换了pCAMBIA1304中的潮霉素抗性基因的。

红花查尔酮异构酶CHI基因在培育高含量黄酮化合物转基因植物的应用。

本发明提供了红花查尔酮异构酶CHI基因，是以红花花瓣的RNA反转录的cDNA为模板，进行3’、5’race克隆，分别得到红花CHI基因的3’ 、5’端序列，通过拼接得到红花CHI序列，全长基因为1161bp，开放阅读框长度为654bp， 命名为ct-CHI，将其在ncbi上进行序列比对分析，发现该基因与青木香CHI基因的同源性达到82%，经实验表明，超表达ct-CHI基因能够促进黄酮的合成， ct-CHI基因被抑制后能够降低黄酮含量，在培育高含量黄酮化合物转基因植物方面具有广阔的前景。

附图说明

图1为红花花瓣RNA提取电泳结果图；

图2为CHI基因中间片段验证电泳图，其中，A:RT-PCR结果；B：菌液PCR；C：酶切图谱；

图3为 CHI基因中间片段验证电泳图，其中，A:CHI基因3'端PCR产物， B：CHI基因5'端PCR产物， C：CHI基因全长验证电泳图；

图4为红花CHI基因植物表达载体的构建图；

图5为红花CHI基因菌液PCR鉴定；

图6 为红花CHI基因酶切鉴定图；

图7为超表达 ct-CHI基因的转基因植株的黄酮含量对比；

图8为 RNAi干扰表达ct-CHI基因的转基因植株的黄酮含量对比。

具体实施方式

实施例1红花花瓣RNA提取

将红花“塔城红花”（购买于新疆塔城）种子播在装好砂的营养钵中，放在智能人工气候室中适当的条件下培养，采集红花花瓣。

1) 镊子、研钵、研棒和药匙用锡箔纸包好，放在180℃烘箱里干热灭菌4h，备用；

2) 1.5mL离心管、移液器吸头用0.1％DEPC水处理过夜，然后120℃高压灭菌20min，放置到60℃烘箱中干燥，备用；

3) 取红花花瓣约100mg，加入液氮迅速研磨至细粉，分装到两个1.5mLEP管中，各加入1mL RNAiso Plus后混合均匀，室温静置5min；

4) 4℃，12000rpm离心5min，取上清液转移到新的1.5mL离心管中；

5) 加入1/5 RNAiso Plus体积量的氯仿，振荡，混匀，室温静置5min；

6) 4℃，12000rpm离心15min，取上清液转移到新的1.5mL离心管中；

7) 加入与上清液等体积的异丙醇，室温静置10min，4℃，12000rpm离心10min；

8) 弃上清取沉淀，向沉淀中加入1mL 75%乙醇清洗沉淀，4℃，12000rpm离心5min，此步骤重复一次；

9) 弃上清保留沉淀，室温晾干；

10) RNA-Free水回溶RNA，提取的RNA保存于-80℃备用。

11) 红花总RNA样品浓度用NanoDrop2000超微量分光光度计(购自Thermo公司)测定。

12) 用2% 的琼脂糖凝胶电泳检测RNA 纯度，电泳结束后用核酸染料染色，在紫外凝胶成像系统上拍照，红花花瓣总RNA提取见图1，由图1可以看到28S和18S清晰的两条带，且28S条带的亮度约为18S的2倍。说明RNA提取完整，无降解，可以满足后续试验需要。

实施例2第一条链cDNA的合成  

取-80℃保存的RNA，通过nanogrop检测RNA的浓度，提取的RNA浓度均在1000ng/ul左右。按照反转录试剂盒的操作说明进行cDNA的反转录，反转录反应体系见表1和表2，反转录后的cDNA保存于-20℃冰箱中备用。

在PCR仪上进行一下反应：65℃，5min ，迅速至于冰上急冷。

反转录反应条件：42℃  55min 、70℃  10min， 置于冰上冷却，得到cDNA用于后续反应，在-20℃冻存以留备用。

实施例3  CHI基因中间片段的克隆   

根据本实验室红花454测序结果中挑选的候选基因，设计特异性引物（表3），验证中间片段。根据验证的CHI基因的中间片段，设计引物（表3）进行全长基因克隆。 根据红花花瓣454测序结果拼接比对，获得了CHI基因的中间片段序列，通过RT-PCR扩增出209bp的中间片段（图2A），RT-PCR反应体系见表4。经过胶回收连接到克隆载体pEASY-T1（北京全式金生物技术有限公司）上，进一步通过菌液PCR（图2B）和EcoR I 、HandIII酶切鉴定（图2C），测序结果正确。

实施例4  CHI基因全长cDNA的克隆

      根据CHI基因209bp的中间片段，设计一对引物SfCHI2F：GGAATCTGCATCGGTATAGGTC和SfCHI2R:GATGGACTCCGTCCACTTCTAC，以红花花瓣的RNA反转录的cDNA(上述2)为模板，进行3’race的PCR克隆，得到红花CHI基因的3’端序列。另设计一对引物SfCHI3F：CGTTAAGTGGAAGGGCAAAA和SfCHI3R：TCGCAACGCACATTTTAGAC，以红花花瓣的RNA反转录的cDNA(上述2)为模板，进行5’race克隆，得到红花CHI基因的5’端序列。通过拼接得到红花CHI的全长序列，重新设计全长引物，F:CGGAAGTGCAATTACCATG，R:CTCGTGAAACTCCTGTTTTCT，以上述2为模板，进行PCR扩增，从而获得红花CHI基因全长cDNA（图3）, 命名为ct-CHI。将其在ncbi上进行序列比对分析，发现该基因与青木香CHI基因的同源性达到82%，说明该基因确为红花CHI基因。

实施例5   红花CHI基因全长cDNA序列分析

     测得的序列利用DNAMAN 软件进行成核苷酸序列编辑和氨基酸序列的推导，在NCBI 网站上进行BLAST 搜索同源性序列，利用clustalW1.83软件构建系统发育树，ProtParam 软件（http://web.expasy.org/）分析编码蛋白的氨基酸序列的组成、相对分子质量、等电点等理化性质。序列分析表明，红花全长基因为1161bp，其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示，红花CHI基因的开放阅读框长度为654bp，其碱基序列如序列表SEQ ID No.2所示，编码217个氨基酸，5’非翻译区长度为250bp，3’非翻译区长度为257bp，序列里含有典型的加尾信号序列AATAA和Poly（A）。根据在线分析软件（http://web.expasy.org/），推导的蛋白质理论分子量约为23.14 kD，等电点（pI）为5.67。总的带负电荷的残基(Asp + Glu)为23，总的带正电荷的残基(Arg + Lys)为20。

实施例6 红花CHI基因编码区序列的获得

     根据红花CHI基因的编码区设计一对引物，AATAGGATCCATGGCTCCGCCGCCGTCCACCA和AATAGAATTCCTAATTCATGAGATCGGCCAAT，引入2个酶切位点BamH I和EcoR I，提取红花花瓣总RNA，反转录成cDNA为模板，进行PCR 扩增，得到红花CHI基因的编码区序列，以此为目的基因，进行表达载体的构建。

实施例7红花CHI基因植物表达载体的构建超表达载体构建如下

（1）首先，化学合成两端含BamH I和EcoR I酶切位点的bar基因序列，其碱基序列如序列表SEQ ID No.3所示，然后将合成的序列插入pCAMBIA1304（购自pcambia公司）载体中，替换潮霉素抗性基因；用BamH I和EcoR I分步酶切质粒，Taq酶补平末端后，用T4连接酶连接平末端。获得含有bar抗性标记的植物表达载体，命名为pCAMBIA1304-bar。将该载体和连接有ct-CHI序列的pEASY-T1载体（北京全式金生物技术有限公司） 用BamH I和EcoR I双酶切 3h，100 μL 酶切体系，表达载体图谱见图4。

（2）将酶切产物经凝胶电泳，回收pBASTA的大片段和 pEASY-T1的小片段酶切产物。

（3）将所回收的ct-CHI小片段与pBASTA片段用 T4 DNA Ligase 酶，反应体系如下，16℃连接过夜；

（4）将连接子转化至大肠杆菌 E. coli DH5α 感受态细胞中；

（5）用含有卡那霉素（50mg/L 的）抗性平板筛选转化子，挑单克隆摇菌后菌液PCR鉴定（图5）和质粒酶切鉴定（图6），均有目的条带，说明表达载体构建成功，命名为pBASTA-ctCHI。

实施例8  RNAi干扰表达载体构建

    利用干扰载体pHellsgate4和一对内切酶BamH I和EcoR I，将ct-CHI基因的编码区序列插入到干扰载体内含子的两侧形成回文序列，再通过酶切连接的方法将该段序列与 pBI 121表达载体连接，经过酶切电泳检测后发现，ct-CHI基因的干扰序列已经与表达载体成功连接。

实施例9 农杆菌感受态细胞的制备及转化

感受态的制备如下：

1) 取出在-80℃保存的农杆菌 EHA105 感受态细胞，接种到5ml 新鲜的LB液体培养液中，180~ 250r/min，28℃过夜培养；

2) 取2ml过夜培养液接种到50ml新鲜的LB液体培养液中，28℃，250r/min摇菌至OD₆₀₀=0.5~1.0；

3) 冰上静置15min，4℃，5000r/min，离心 5min；

4) 弃上清，用1ml 20mMCaCl₂溶液重悬菌体，4℃，5000 r/min 离心5min；

5) 弃上清，用1ml 20mMCaCl₂溶液再次重悬菌体，分装至1.5ml冰预冷EP管中，每管体积为0.1ml，然后再在液氮中冷藏5min，置于-80℃超低温冰箱保存。

利用冻融法将目的基因转化进农杆菌中，过程如下：

1) 加入1μl pBASTA-ctCHI质粒DNA于农杆菌EHA105的感受态中，液氮中冷藏5min；

2) 迅速将其置于37℃水浴中，热击5min；

3) 加入1ml新鲜LB培养液至离心管中于28℃摇床上摇菌2~4小时；

4) 取50μl-100μl转化菌液涂于含50μg/ml kan+100μg/ml Rif +50μg/ml Str的固体LB平板上，于28℃恒温箱中培养2~3天，筛选转化子；

5) 挑取单克隆菌接种于农杆菌液体培养基中，28℃培养至OD₆₀₀≈0.5，取1μl菌液用于PCR检测，方法同上；

6) 余下菌液用甘油按4:1(V:V)充分混匀后于液氮中速冻，然后-80℃保存备用。

实施例10 红花CHI基因的转化及黄酮含量测定

    将构建好的超表达和RNAi载体转化烟草叶片，分别对转化后进行PCR检测的8株转基因株系进行黄酮含量测定，结果表明，超表达ct-CHI基因的转基因烟草的黄酮含量均比非转基因烟草有所提高（图7），表明超表达ct-CHI基因能够促进黄酮的合成。在转化干扰载体的烟草中，黄酮含量均低于对照的非转基因植物（图8），说明ct-CHI基因被抑制后能够降低黄酮含量。

 

<110> 吉林农业大学

 

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