分泌抗香蕉束顶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

摘要

本发明公开了一种分泌抗香蕉束顶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用纯化的香蕉束顶病毒（BBTV）的病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗BBTV单抗的杂交瘤细胞株22E3，其保藏号为CGMCCNo.8780。22E3单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗香蕉束顶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。 

背景技术

香蕉束顶病的病原为香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus，BBTV）。1889年该病首先在斐济被发现，之后在澳大利亚、印度、巴基斯坦、印度尼西亚、中国大陆和台湾、加蓬、太平洋诸岛屿，埃及、刚果、菲律宾、越南等其他国家和地区陆续报道。20世纪，香蕉束顶病成为香蕉上的重要的毁灭性病害之一，该病威胁着亚洲、非洲和南太平洋地区共约占世界1/4香蕉产区的生产。在中国，早在1900年就有关于BBTV的记载，到了20世纪50年代和90年代，香蕉束顶病在福建、广东、广西、云南和海南等主要香蕉产区流行，造成重大经济损失，严重影响了当时香蕉生产业的发展。虽然通过挖除病株防治蚜虫以及栽培脱毒蕉苗等人工手段可很大程度上防治香蕉束顶病，但对管理不当或无人管理的蕉园，该病仍具有很大的危害。香蕉束顶病毒属矮缩病毒科、香蕉束顶病毒属，病毒粒体位18-20nm的等径粒体。国内外研究表明，BBTV不能通过汁液摩擦或土壤传播，植株根部自然交接和菟丝子也均不能传播，仅由香蕉交脉蚜以持久方式传播。BBTV的短距离传播靠香蕉交脉蚜传染，而远距离传播则靠带病的繁殖材料。目前已报道的寄主有8种，均属芭蕉科，包括香蕉、大蕉、粉芭蕉、蕉麻、长梗蕉、尖苞片蕉、班克氏芭蕉、象腿蕉。香蕉束顶病在香蕉整个生长季节均可发生。苗期染病植株主要呈矮缩状，新抽叶片变小变窄，束状丛生，叶脉上首先出现深绿色点线状的“青筋”；中苗期染病植株新抽嫩叶初呈黄白色，后逐渐变暗至暗色条纹，并向主脉扩展；孕穗后期染病，新抽嫩叶失绿、易脆，抽穗停滞；初穗期染病，病株呈花叶状，穗轴不再下弯，香蕉停止生长；抽穗后期染病，香蕉同样停滞生长，病株根系生长不良或烂根，假茎基部微紫红色，解剖假茎可见褐色条纹，外层鞘皮随叶子干枯变褐或枯焦，少数晚期受害的则果形变细、果味变淡，失去商品价值。为了掌握香蕉束顶病毒发病状况，强化我国香蕉束顶病早期监测和预警，科学指导防控，急需建立检测芭蕉科中BBTV的高通量的检测方法，而目前没有这种高通量的检测方法，仅用低效率的电镜观察、PCR方法、核酸电泳等方法进行小样本检测。本发明以提纯的香蕉束顶病毒为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌抗BBTV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞22E3，以制备的单抗为核心可建立检测BBTV的高通量的血清学方法及其试剂盒，从而为我国香蕉束顶病早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗香蕉束顶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。 

分泌抗香蕉束顶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株22E3，它能分泌抗香蕉束顶病毒的特异性单克隆抗体, 杂交瘤细胞株22E3保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8780。 

抗香蕉束顶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与香蕉束顶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应。 

抗香蕉束顶病毒的单克隆抗体仅与香蕉束顶病毒有特异性免疫反应，而与香蕉线条病毒、香蕉苞片嵌纹病毒、柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、黄瓜花叶病毒均不发生免疫反应。 

抗香蕉束顶病毒单克隆抗体在抗香蕉束顶病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。 

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1）提供的杂交瘤细胞株22E3分泌抗香蕉束顶病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测香蕉束顶病毒；2）利用本发明所制备的单克隆抗体检测香蕉束顶病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3）利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于香蕉中香蕉束顶病毒的检测。 

附图说明

图1是dot-ELISA方法检测香蕉中BBTV的灵敏度分析； 

图2 是dot-ELISA方法检测芭蕉科田间样品中BBTV的结果；

生物保藏

杂交瘤细胞株22E3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日期为：2014年1月22日，保藏号为CGMCC No.8780。 

具体实施方式

分泌抗香蕉束顶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株22E3保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8780，它能分泌抗香蕉束顶病毒的单克隆抗体。 

抗香蕉束顶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与香蕉束顶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应。 

抗香蕉束顶病毒的单克隆抗体仅与香蕉束顶病毒有特异性免疫反应，而与香蕉线条病毒、香蕉苞片嵌纹病毒、柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、黄瓜花叶病毒均不发生免疫反应。 

抗香蕉束顶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。 

本发明提供的杂交瘤细胞株22E3能大量分泌抗香蕉束顶病毒单抗，且其分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立的检测BBTV的高通量的血清学方法及其检测试剂盒可成功应用于田间BBTV的检测，从而为我国香蕉束顶病早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。 

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。 

一、杂交瘤细胞的获得及其单克隆抗体的制备 

1.免疫原及检测抗原的制备

8）              新鲜的中脉及假茎用刀片削成 5 mm厚的小片，称重后放于-70℃预冷的咖啡捣碎器中，缓慢加入液氮淹没组织，待液氮挥发后高速研磨组织成粉末。将组织粉末按1：2（W/V）比例加入提取缓冲液（0.2M磷酸钾，pH7.4，含0.5%亚硫酸钠），在4℃下搅拌30min，双层纱布挤出汁液。残渣加入提取缓冲液及石英砂重新研磨过滤。二次挤出液合并后，加入10%体积的氯仿-正丁醇（v/v，1：1），4℃下搅拌1小时，8000g离心10分钟。上清120 000g离心2小时，弃上清。沉淀用0.07M磷酸钾缓冲液（PB，pH7.2）悬浮（20ml/100g组织），在4℃下搅拌2天，静置2天。悬浮液经8000g离心10分钟澄清后，铺于20%蔗糖垫上，50000rpm离心90min；吸取蔗糖垫层，沉淀用0.07MPB悬浮；蔗糖垫层和沉淀悬浮液分别50000rpm离心90min，沉淀用PB悬浮获得病毒粒子；经电镜观察发现大量高纯度的18-20 nm球形病毒粒子。以提出的香蕉束顶病毒作为免疫原和检测抗原。

2.免疫动物 

用BBTV提纯病毒免疫四周龄体重18-20g BALB/C 雌性小鼠：1mg/ml免疫原BBTV与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合 

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按8：1的比例，在无血清的RPMI-1640（Gibco）培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50 % PEG（Sigma，分子量1500）作为融合剂，在37℃下水浴下加入1ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5 % CO2的细胞培养箱中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆 

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-30%时，以BBTV提纯病毒为包被抗原用常规间接ELISA方法筛选分泌单抗的阳性孔，共获112多个阳性孔。选择5个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗BBTV的特异性单抗的杂交瘤细胞株22E3。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5. 单克隆抗体的特异性检测 

用感染香蕉线条病毒、香蕉苞片嵌纹病毒、柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、黄瓜花叶病毒的病叶汁包被ELISA板，以相应的健叶提取液作阴性对照，以感染香蕉束顶病毒的病叶汁液为阳性对照，用ACP-ELISA法测定单抗的特异性反应。ACP-ELISA方法具体为：上述病毒感染的病叶用液氮研磨成粉末，按1: 30（w/v, g /mL）加入ELISA包被液研磨后100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2小时，使其吸附于ELISA聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1-10％的脱脂奶粉或1-3％ BSA或3-6％牛血清封闭30-60min；加入适当稀释的单抗100ul/孔，37℃ 1-2 小时；PBST洗涤三次后加入10000倍稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记羊抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃ 1-2小时，PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD₄₀₅的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，22E3单抗对BBTV有特异性反应，而与香蕉线条病毒、香蕉苞片嵌纹病毒、柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、黄瓜花叶病毒和健康植物均无特异性反应。

6.单克隆抗体腹水制备及纯化 

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。

7.单克隆抗体的类型及亚类鉴定和腹水效价测定 

将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG₁、 IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果为22E3单抗亚类为IgG1、kappa链。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果为上述单抗腹水效价达到10^－7。

二、病毒免疫学检测方法及其试剂盒 

1.以单抗为核心建立抗原包被ELISA（ACP-ELISA）方法检测病毒

 ACP-ELISA方法的操作步骤

（1）用0.05M碳酸盐缓冲液（pH9.6）按1: 30（w/v, g /mL）倍稀释的病叶汁液100ul/孔加入ELISA板，以BBTV病叶为阳性对照，健叶为阴性对照，37℃ 2h，或4℃过夜；

（2）PBST洗涤后用5%脱脂奶粉封闭30min；

（3）单抗腹水5000倍稀释后100ul/孔，37℃ 1h；

（4）PBST洗涤后加入10000倍稀释的碱性磷酸脂酶（AP）标记的羊抗鼠IgG二抗（Sigma），100ul/孔，37℃，1h；

（5）用PBST洗涤后加入硝基磷酸盐底物100ul/孔，室温30min；

（6）用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色的孔为阳性， 或用2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用酶联免疫检测仪测OD405，以P/N> 2.1作为阳性判断标准。

 ACP-ELISA方法检测灵敏度检测 

单抗腹水工作浓度为5000倍稀释，对病叶从1：10至5120作倍比稀释分别以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述ACP-ELISA方法检测。结果表明ACP-ELISA方法对1：2560倍稀释的病叶汁液检测仍呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1：2560，表明ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。

2. dot-ELISA方法的建立及田间检测应用 

2.1 dot-ELISA检测芭蕉科植物中BBTV方法的建立

将芭蕉科叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10-30（w/v, g /mL）加入0.01 mol/L PBS（pH7.4）后研磨；病汁液 5000 rpm离心3 min; 取3 μl上清点到硝酸纤维素膜（NC）上，同时设置健康和感病香蕉叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min； NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60 min；用PBST洗膜3-4次，每次3 min； NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60 min; PBST洗膜4-5次，每次3 min; 66 μL NBT和33 μL BCIP底物(Promega)加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

用方阵试验确定检测芭蕉科病叶的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明22E3单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:4000和1:7000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测BBTV的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当香蕉叶片稀释到1:320倍（w/v, g/mL）时，以22E3单抗建立的dot-ELISA 检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:320倍稀释（图1）。 

2.2 dot-ELISA方法在田间样品检测中的应用 

用建立的dot-ELISA方法对2013年采自东莞和广州等地田间疑似发病芭蕉科样品进行检测，结果发现，54个检测样品中有32个样品产生紫色的阳性斑点，部分样品的检测结果如图2，阳性样品进一步用PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到BBTV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染BBTV。说明该dot- ELISA方法能准确、可靠地用于芭蕉科样品中香蕉束顶病毒的检测。

3香蕉束顶病毒dot-ELISA检测试剂盒 

1）试剂盒主要成分：

BBTV 单克隆抗体1管                                  0.2 ml

AP标记羊抗鼠IgG二抗  1管                            0.1 ml

NBT/BCIP底物 各1瓶                           分别为2 ml和1ml

阳性对照（含BBTV叶片汁液）   1管                     2 ml                                      

阴性对照（健康香蕉叶片汁液）   1管                    2 ml   

抗体稀释液 （10X） 1瓶                                80ml

以上试剂均保存于4℃下

硝酸纤维素膜(NC)10张                                 

2）检测香蕉样品的操作步骤：

a.将芭蕉科样品叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10～30（w/v, g /mL）加入0.01 mol/L PBS（pH7.4）后研磨；

b.病汁液 5000 rpm离心3 min;

c. 取3 μl上清点到NC上，同时设置健康和感病香蕉叶汁分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20 min; 

d. NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；

e. NC膜放入1:2000倍稀释的单抗中室温孵育30-60 min；

f. 用PBST洗膜3-4次，每次3 min； NC膜放入1:3000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60 min; 

g. PBST洗膜4-5次，每次3 min; 66 μL NBT和33 μL BCIP底物加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果；

h. 待阳性对照显色明显（紫色），而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

）保存及有效期 于2～8℃避光保存，有效期12个月。 

）缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH7.4）：

NaCl                                              8 g

KCl                                               0.2 g

KH₂PO₄                                            0.2 g

Na₂HPO₄12H₂O                                    3g

叠氮化钠                                       0.2 g

加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000 ml

ELISA洗涤液（0.01 mol/L PBST）：

1000 ml 0.01mol/L PBS中加0.5 ml Tween-20

ELISA封闭液：

0.01 mol/L PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5%（W/V）。