豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物及其筛选方法、鉴定亲缘关系的方法

摘要

本发明公开了一种豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物及其筛选方法、鉴定亲缘关系的方法，属于作物分子生物学技术领域。所述豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物。所述鉴定豇豆叶绿体微卫星分子标记引物多态性的方法包括：提取不同品种豇豆的基因组DNA；将设计的引物和基因组DNA混合并进行PCR扩增、电泳分离；获得豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物。所述鉴定豇豆亲缘关系的方法包括：提取豇豆的基因组DNA；采用豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物进行PCR扩增、电泳分离，统计结果；对结果进行亲缘关系分析。所述多态性引物能够反映豇豆细胞质基因组的遗传信息，可用于豇豆的种质资源分类、亲缘关系鉴定、遗传多样性分析等研究。

说明书

技术领域

本发明涉及作物分子生物学技术领域，特别涉及一种豇豆叶绿体微卫星分 子标记的多态性引物及其筛选方法、鉴定亲缘关系的方法。

背景技术

种质资源又称遗传资源，种质资源的准确区分与鉴定是进行良种选育和遗 传改良的基础。

在豇豆种质资源的鉴定过程中，均采用豇豆的细胞核DNA的SSR（Simple  Sequence Repeat，简单重复序列）分子标记法鉴定不同品种之间在分子水平上的 差异，SSR又叫微卫星DNA，指的是基因组中由1-6个核苷酸组成的基本单位 重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp 以下。研究表明，微卫星DNA在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常 常是随机分布于核DNA中。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：

对于现有技术中基因型的鉴定方法仅针对于豇豆的细胞核DNA，由于植物 细胞中除细胞核遗传外，还具有细胞质遗传，而现有技术中并未记载有针对豇 豆的细胞核DNA外的其他物质用于鉴定豇豆的种质资源，因此，仅采用细胞核 DNA鉴定豇豆的种质资源并不全面。

发明内容

为了解决现有技术中鉴定豇豆的种质资源不全面的问题，本发明实施例提 供了一种豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物及其筛选方法、鉴定亲缘关 系的方法。所述技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物，包 括：

cpSSR3正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；

cpSSR3反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；

cpSSR9正向引物如序列表中SEQ ID NO.3所示；

cpSSR9反向引物如序列表中SEQ ID NO.4所示；

cpSSR10正向引物如序列表中SEQ ID NO.5所示；

cpSSR10反向引物如序列表中SEQ ID NO.6所示；

cpSSR12正向引物如序列表中SEQ ID NO.7所示；

cpSSR12反向引物如序列表中SEQ ID NO.8所示；

cpSSR14正向引物如序列表中SEQ ID NO.9所示；

cpSSR14反向引物如序列表中SEQ ID NO.10所示。

另一方面，本发明提供了一种上述多态性引物的筛选方法，所述方法包括：

提取不同品种豇豆的基因组DNA；

将设计的如序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.30所示的引物和所述基因组 DNA混合并进行PCR扩增，得到扩增产物；

将所述扩增产物与上样缓冲液等体积混合，并将混合液在95℃，变性5min 后，冰浴3min，得到变性的混合液，再将所述变性的混合液采用变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳分离，将分离后的扩增产物经过固定、银染、显色处理后记录结果；

根据所述扩增产物的不同迁移距离确定每个所述品种豇豆的基因型，获得 如序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10所示的所述豇豆叶绿体微卫星分子标记 的多态性引物。

进一步地，所述PCR扩增体系包括：1×PCR buffer，20ng作为DNA模板 的所述基因组DNA，4nmol dNTP，30nmol MgCl₂，0.5U Taq DNA聚合酶，10 pmol所述豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物，所述PCR扩增体系的总体 积为20μL。

进一步地，所述PCR扩增程序为：

94℃，预变性5min；

94℃，变性30s，50～59℃，退火30s，72℃，延伸40s，35个循环；

72℃，延伸5min。

进一步地，所述变性聚丙烯酰胺凝胶的质量分数为8%。

进一步地，所述上样缓冲液包括：质量分数为98%的甲酰胺、浓度为10 mmol·L^-1的EDTA、质量分数为0.025%的溴酚蓝和质量分数为0.025%的二甲苯 青蓝。

进一步地，在采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离时，取所述变性的混合液 2.5μL进行点样。

进一步地，所述电泳条件为：恒功率55W预电泳40min，然后恒功率50W 电泳1.5h。

又一方面，本发明实施例提供一种利用上述的多态性引物鉴定豇豆亲缘关 系的方法，所述方法包括：

提取所述不同品种豇豆的基因组DNA；

将所述豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物和所述基因组DNA混合并 进行PCR扩增，得到扩增产物；

将所述扩增产物经采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，在同一电泳迁移位 置上，若有DNA扩增条带记为“1”，若无DNA扩增条带记为“0”，统计结果；

对所述结果进行亲缘关系分析。

进一步地，所述亲缘关系分析的方法为：利用ntsys2.2软件中的SimQual 程序，计算DICE遗传相似性系数矩阵，然后通过非加权组平均法，构建遗传关 系聚类树图。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：由于叶绿体是植物细胞 质中特有的细胞器，故而叶绿体基因组的序列变异有助于植物细胞质基因型的 区分开，针对豇豆叶绿体基因组上的DNA序列筛选出来的叶绿体微卫星分子标 记，该叶绿体微卫星分子标记具有细胞核基因组微卫星分子标记的共显性、高 度变异和多态性等特点，此外，豇豆的叶绿体为母性遗传，母性遗传使叶绿体 的DNA具有单亲遗传模式、且不易发生重组的特点，同时使得叶绿体微卫星分 子标记具有结构简单、多拷贝以及分子量小等特点，同时，叶绿体微卫星分子 标记主要位于叶绿体基因组的非编码区，而叶绿体DNA的非编码区序列在种内 或种群间也存在遗传变异，使得该豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物能 够全面地反映豇豆的遗传信息，使得本发明提供的鉴定豇豆遗传多样性的方法 能够准确、全面地反应豇豆的遗传多样性，同时，也能够使得发明提供的鉴定 豇豆亲缘关系的方法能够更全面。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例一提供的5对豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引 物在10份豇豆和3份菜豆样品中扩增产物的遗传多样性电泳图谱；

图2是图1的局部放大图；

图3是图1的局部放大图；

图4是图1的局部放大图；

图5是图1的局部放大图；

图6是图1的局部放大图；

图7是本发明实施例二提供的聚类树图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明 实施方式作进一步地详细描述。

实施例一

本发明实施例提供一种豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物。

1、叶绿体微卫星分子标记的多态性引物筛选

从GenBank公共数据库中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载豇豆（V. unguiculata）叶绿体基因组全序列（NC_018051），对豇豆叶绿体基因组全序列 进行分析，筛选叶绿体微卫星分子序列。单碱基微卫星采用软件Tandem Repeats  Finder4.04查找（Benson G.Tandem repeats finder:a program to analyze DNA  sequences[J].Nucleic Acids Research,1999,27(2):573-580.）；多碱基微卫星分子 采用SSRhunter1.3软件进行分析（李强，万建民.SSRHunter，一个本地化的SSR 位点搜索软件的开发[J].遗传，2005，27(5):808-810.），搜索条件设置为：单碱 基微卫星分子的最小重复次数为10，二碱基和三碱基的完全重复微卫星分子最 小重复数分别为5和4，四碱基及四碱基以上微卫星分子的最小重复次数均为3， 在每个微卫星分子位点的上下游侧翼序列各为150bp。

2、叶绿体的微卫星分子标记的引物设计

基于上述所获得的叶绿体微卫星分子序列，利用在线引物设计软件 Primer3.0（http://frodo.wi.mit.edu/）分析微卫星分子的侧翼序列并进行引物设计。 其主要参数设置为：引物长度18～22bp，以20bp为最佳；引物退火温度在 50～60℃之间，以55℃为最佳，上游和下游的引物退火温度之差在5℃以内；鸟 嘌呤和胞嘧啶所占的比率（GC含量）为40%～70%，最适含量为50%；预期PCR 产物长度为100～400bp。该引物由上海生工生物工程有限公司合成，设计出如 序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.30所示的引物，在这30条引物中筛选出豇 豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物。

本发明提供的豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物具体参见表1：

表1为豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物信息

其中：F表示正向；R表示反向。

采用该豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物鉴定豇豆遗传多样性时， 采用了包括10份豇豆材料和3份菜豆材料，具体参见表2。

表2为供试的豇豆与菜豆样品信息

PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）扩增

PCR扩增体系包括：1×PCR buffer，20ng作为DNA模板的基因组DNA，4 nmol dNTP，30nmol MgCl₂，10pmol设计的如序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID  NO.30所示的引物（各条引物均等量加入），0.5U Taq DNA聚合酶（北京天根生 化科技有限公司），该PCR扩增体系的总体积为20μL。在Mastercycler gradient 型PCR仪（德国，Eppendorf公司）上进行PCR扩增。

PCR扩增程序为：94℃，预变性5min；然后进行35个循环，每个循环包 括94℃，变性30s，50～59℃，退火30s，72℃，延伸40s；最后72℃，延伸5 min。

电泳分离

采用浓度为8%的变性聚丙烯酰胺凝胶（Acrylamide：Bis=19：1，丙烯酰胺 与亚甲基双丙烯酰胺的体积比为19：1）检测扩增产物。PCR扩增产物与上样缓 冲液等体积混合均匀，其中，上样缓冲液包括：质量分数为98%的甲酰胺、浓 度为10mmol·L^-1的EDTA、质量分数为0.025%的溴酚蓝和质量分数为0.025% 的二甲苯青蓝，将PCR扩增产物与上样缓冲液的混合液在95℃，变性5min后， 立即冰浴3min，得到变性的混合液，该变性的混合液使得扩增产物中的DNA 变性解离为单链，以满足变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的要求，取该变性后的混合 液2.5μL进行点样并进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，且电泳条件为：恒功率55W 预电泳40min，然后恒功率50W电泳1.5h，电泳完毕，将凝胶经过浓度为10% 的冰醋酸溶液（冰醋酸溶液的溶剂为离子水）固定10min；然后用银染液（每 1000mL银染液含质量分数为0.1%的硝酸银和0.407g甲醛），摇床转速40rpm， 避光振荡染色30min；用显色液（每1000mL显色液含15g氢氧化钠、600μL浓 度为10mg/mL的硫代硫酸钠和0.559g甲醛），摇床转速100rpm，振荡显影5min； 显色完毕用去离子水清洗1-2次，最后用数码相机拍照记录。

统计每一个样品扩增的DNA条带数及其多态性，在同一电泳迁移位置上， 有DNA扩增条带记为“1”，无条带记为“0”；并参照DNA marker片段大小，读 取所扩增产物的DNA片段大小。

结合表1和图1可知，通过对13份豇豆样品进行PCR扩增，发现其中5 对叶绿体微卫星分子标记的引物具有多态性，如序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID  NO.10所示的豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物，其结果参见图1，且 PCR扩增产物的片段位于420～900bp之间，参见表1，根据PCR扩增产物的不 同迁移距离从而鉴定每个豇豆样品的基因型，并筛选出多态性条带，从而获得 豇豆叶绿体微卫星分子遗传变异的多态性图谱，参见图1。

如图1所示，图1中黑色小方框表示电泳DNA条带的位置，样品编号1～13 同表1中序号1～13。图1中单向箭头所示的字母表示DNA marker的大小。A～G 采用50bp DNA ladder（DNA ladder是由若干已知片段大小的条带组成，作为参 照标准，用于判断所检测样本的DNA片段的大小），分别对应1000bp、900bp、 800bp、700bp、600bp、500bp、400bp；H～I采用20bp DNA ladder，分别对应 500bp、400bp。图5中M1、M2均为图1中DNA marker泳道，分别对应50bp  DNA ladder和20bp DNA ladder。

本发明提供的豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物，由于叶绿体是植 物特有的细胞器，故而叶绿体基因组的序列变异有助于植物细胞质基因型的区 分开，针对豇豆叶绿体基因组上的DNA序列筛选出来的叶绿体微卫星分子标记， 该叶绿体微卫星分子标记具有细胞核基因组微卫星分子标记的共显性、高度变 异和多态性等特点，同时，豇豆的叶绿体为母性遗传，使其具有叶绿体DNA的 单亲遗传模式，不易发生重组的特点，使得叶绿体微卫星分子标记具有结构简 单、多拷贝以及分子量小等特点，同时，叶绿体微卫星分子标记主要位于叶绿 体基因组的非编码区，而叶绿体DNA的非编码区序列在种内或种群间也存在遗 传变异，使得该豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物能够全面地反映豇豆 的遗传信息，可用于豇豆的种质资源分类、亲缘关系鉴定、遗传多样性分析、 遗传结构分析、分子指纹图谱构建和系统发生学等研究。同时，由于叶绿体微 卫星分子标记具有结构简单、多拷贝以及分子量小等特点，进而使得本发明提 供的采用该豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物鉴定豇豆遗传多样性的方 法能够更进一步全面、客观反映物种细胞质和细胞核内的豇豆的遗传多样性。

实施例二

本发明实施例提供一种利用实施例一提供的豇豆叶绿体微卫星分子标记的 多态性引物鉴定豇豆亲缘关系的方法，具体如下：

样品：在本发明实施例一提供的供试的13份样品，包括10份豇豆材料和3 份菜豆材料（3份菜豆分别为实施例一的表2中代号J9、J13、B20），并提取13 份样品的基因组DNA，以检测豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物在菜豆 中的通用性。

首先，根据电泳检测的实施例一提供的豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态 性引物和样品的基因组DNA混合进行扩增，得到扩增产物，将该扩增产物经采 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，在同一电泳迁移位置上，若有DNA扩增条带 记为“1”，若无DNA扩增条带记为“0”，统计结果并将结果汇总到excel表格中 构成0/1矩阵；再利用ntsys2.2软件（Rohlf,F.J.2009.NTSYSpc:numerical taxonomy  system.ver.2.21c.Exeter Software:Setauket:New York.）中的SimQual程序，计算DICE （DICE即为Dice Coefficient，出自文献Dice，L.R.1945.Measurement of the  amount of ecological association between species.Ecology,26:297-302.）遗传相似 性系数矩阵，然后通SAHN程序中的UPGMA（Unweighted Pair-group Method  with Arithmetic means，非加权组平均法），构建遗传关系聚类树图，参见图7。

结果表明，（1）5对豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物在3份菜豆样 品中进行扩增，并获得了多态性条带，说明这5对豇豆叶绿体微卫星分子标记 的多态性引物在菜豆中具有良好的通用性，可以用于菜豆叶绿体基因组的相关 研究。

（2）参见图6，基于UPGMA的聚类树图表明，供试的10份豇豆和3份菜 豆材料之间的亲缘关系存在差别，而且这种差别与其地理来源无明显的相关性， 但是菜豆和豇豆材料能较好区分开来。在DICE遗传相似性系数0.12处，13份 样品可大致聚类为两大类群：类群I和类群II。供试的3份菜豆材料（J9、J13、 B20）都聚类到类群I中，其中，B20聚类到类群I-a，J9和J13聚类到类群I-b。 由于豇豆和菜豆分布属于豇豆属和菜豆属，其叶绿体基因组存在差别，因此， 本发明实施例一中筛选出的5对豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物能检 测到豇豆和菜豆叶绿体基因组的差别，对两种进行有效区分。

此外，在所检测的10份豇豆样本之间，有7份样本聚类到类群II中，其余 3份样本聚类到类群I。如图7所示，根据DICE遗传相似性系数，表明供试的 10份豇豆材料之间的亲缘关系由近到远依次是： H17>A189>A98>B15>B37>B7/B18/A80/A115，其中B7、B18、A80、A115无法 区分，表明这四者之间的叶绿体基因组同源性较高，可能有共同的祖先作为母 本。

本发明利用豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物进行豇豆亲缘关系的 鉴定，并利用叶绿体微卫星分子标记具有细胞核基因组微卫星分子标记的共显 性、高度变异和多态性等特点，且豇豆的叶绿体为母性遗传，具有叶绿体DNA 的单亲遗传模式、不易发生重组的特点，使得叶绿体微卫星分子标记具有结构 简单、多拷贝以及分子量小等特点，进而使得本发明提供的鉴定豇豆亲缘关系 的方法能够全面地反应豇豆的亲缘关系，也可将叶绿体微卫星分子标记与细胞 核DNA分子标记综合运用，能够更进一步全面、准确、客观反映物种细胞质和 细胞核内的亲缘关系。

实施例三

本发明实施例提供一种利用实施例一提供的5对豇豆叶绿体微卫星分子标 记的多态性引物进行豇豆遗传多样性分析，用于揭示供试豇豆样品的遗传多样 性现状，基于5对豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物和10份豇豆样品检 测到的多样性信息，利用Popgene1.32软件进行遗传多样性分析，其中：

计算主要遗传多样性参数观察杂合度（observed heterozygosity，Ho）；

期望杂合度（expected heterozygosity，He）；

等位基因数（number of alleles，Na）；

有效等位基因数（=Effective number of alleles，Ne）；

香农系数（Shannon's Information index，I）。

多态性信息含量（polymorphism information index,PIC）计算参照公式 （Botstein D,White RL,Skolnick M,Davis RW.Construction of a genetic linkage  map in man using restriction fragment length polymorphism.The American Journal  of Human Genetics,1980,32(2):31331.）：

$\mathrm{PIC}=1-\left(\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}{P}_i^2\right)-\left(\underset{i=1}{\overset{n-1}{\Sigma }}\underset{j=i+1}{\overset{n}{\Sigma }}\right)2P_i^2{P}_j^2$

表3为10份豇豆样品的遗传多样性分析

结果表明，检测到的等位基因数为2-4个/位点，平均等位基因数为3个/位 点；而平均有效等位基因数为2.124，变化范围为1.220～3.333之间；观察杂合 度变异范围0.000～1.000，平均观察杂合度为0.404；期望杂合度0.190～0.737， 平均期望杂合度为0.469；平均香农系数为0.789，变化范围为0.325～1.280；平 均PIC值为0.402，变化范围0.164～0.645。

根据上述参数的平均值可揭示出供试的10份豇豆样品具有中等水平的遗传 多样性。

本发明利用豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物进行豇豆遗传多样性 分析，并利用叶绿体微卫星分子标记具有细胞核基因组微卫星分子标记的共显 性、高度变异和多态性等特点，且豇豆的叶绿体为母性遗传，母性遗传使叶绿 体的DNA具有的单亲遗传模式、且不易发生重组的特点，同时使得叶绿体微卫 星分子标记具有结构简单、多拷贝以及分子量小等特点，使得发明提供的豇豆 遗传多样性分析方法更全面，也可将叶绿体微卫星分子标记与细胞核DNA分子 标记综合运用，能够更进一步全面、客观地反映物种细胞质和细胞核内的遗传 变异现状。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的 精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。