一种从笋壳中提取木寡糖并分离获得木寡糖单体的方法

摘要

本发明涉及从笋壳中提取木寡糖并分离获得木寡糖单体的方法，步骤如下：a）笋壳碱降解后微波消解，加入木聚糖酶酶解得上清液；b）活性碳柱用50%-70%乙醇以2-3ml/min的流速平衡3个柱体积，再用去离子水以2-3ml/min平衡3个柱体积，该活性炭柱Φ=3.5cm，H=45cm，内装层析用活性碳85g；c）将木寡糖上清液上样，先用去离子水以2-3ml/min的流速洗脱1－3个柱体积，再以0.1%－37%的乙醇以同一流速线性洗脱7-10个柱体积，流速为2－3ml/min，并对乙醇洗脱部分进行收集。本发明的木聚糖提取率高，能从木二至五糖含量较低的木寡糖水溶液分离到高纯度单体，易操作，重复性好。

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物化学技术领域，具体地说，是一种从笋壳中提取木寡糖并 分离获得木寡糖单体的方法。

【背景技术】

竹笋是我国的传统的绿色蔬菜之一，在我国自古就被当成“菜中珍品”。 随着笋用林和笋竹两用林丰产技术的推广，我国鲜笋产量逐年递增。竹笋壳又 称竹箨（bambusa spp），是竹笋加工当中的大宗废弃物。笋壳富含纤维素（主 要成分是多戊糖），含量约为35.08%，这与目前生产低聚木糖的主要原料玉米 芯中半纤维素的含量相当，因此笋壳是提取低聚木糖的较好资源。

低聚木糖又称木寡糖，是由2-7个木糖分子以β-1,4糖苷键结合而成的功 能性聚合糖。与通常人们所用的大豆低聚糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖等相比 具有独特的优势，它可以选择性地促进肠道双歧杆菌的增殖活性，其双歧因子 功能是其它聚合糖类的10-20倍。

木二糖的制备可采用水解木聚糖或半纤维素，再经过分离纯化获得。水解 方法有酸水解、高温裂解、酶水解等。酶法水解的木二糖得率高，水解进程容 易控制。但大多数木聚糖酶水解木聚糖的效果不是很理想，主要因为水解产物 中木二糖的比例低，后续分离困难。采用凝胶色谱柱法分离低聚木糖或制备少 量高纯度的单一木二糖已有一些报道。凝胶层析柱所用柱料为聚丙烯酰胺凝胶 Bio-Gel P-4和P-2等，价格昂贵，且该技术处理量小、产品浓度低、操作要求 高。中国期刊《食品科学》，2008,Vol.29,No.10，刊出的论文“利用固定化耐 高温木聚糖酶生产木二糖”，将重组海栖热袍菌(Thermotoga maritima)极耐热木 聚糖酶B固定于镍螯合环氧载体Eupergit C250L(固定化XynB)上，水解玉米 芯汽爆液连续生产低聚木糖，特别是木二糖。固定化XynB操作稳定性很高， 批次水解15次仍保持92%的初始水解活性。90℃下连续水解168h后保持83.6% 的初始水解活性，连续操作半衰期为577.6h(24d)。HPLC分析表明，连续水解 液中主要含有49.8%木二糖和22.6%木糖。活性碳层析柱可吸附木二糖，利用 乙醇梯度洗脱木二糖的收率为84.7%，纯度为97.2%。其中，该论文使用活性 碳柱层析分离水解液制备木二糖的具体方法是：将活性碳柱(Φ=3.5cm， H=45cm，内装层析用活性碳85g)用去离子水以流速为105ml/h平衡12h后备 用。取连续水解试验收集的前2L样品，浓缩至500ml左右上样。将含总糖为 16g的浓缩液以流速110ml/h上样，结束后开始洗脱(速度110ml/h)，1L去离子 水水洗后，再用0～15%乙醇溶液(总体积8L)线性洗脱，洗脱液用自动部分收 集器收集(1瓶/h)，线性洗脱后采用50%乙醇溶液1L洗脱并收集；测定所收集 的每瓶糖液的总糖含量，并TLC检测糖组成；最后合并含单一木二糖组分的 收集液于55℃真空浓缩至过饱和糖浆状态，加入稍许木二糖晶种，室温静置等 待结晶。但是该论文中使用活性碳柱层析的是木二糖含量高达49.8%的水解液， 但是很多制备方法并不能制备出木二糖含量如此高的水解液。因此对于木二糖 含量较低的样品，还没有快速、经济、高效的分离方法。同样地，目前也未见 其它木寡糖单体的快速、经济、高效的分离方法。

综上可知，从笋壳中提取木寡糖并高效分离获得木寡糖单体，将有助于竹 笋加工的废弃物的再利用，减少环境污染和增加产值，同时有助于木寡糖的进 一步开发利用。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种从笋壳中提取木寡糖并 分离获得木寡糖单体的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种从笋壳中提取木寡糖并分离获得木寡糖单体的方法，所述的方法包括 以下步骤：

a）木寡糖的提取：称取笋壳加NaOH溶液浸泡后烘干至恒重，称取烘干 后样品至消解罐中，加入蒸馏水后于消解炉中降解，微波功率为600-800W， 消解时间为6-10min，最后用蒸馏水定容，取其上清液即为粗木聚糖溶液，然 后在此粗木聚糖溶液中加入木聚糖酶，加酶量为10-60IU/g木聚糖，酶解6-10h， 取上清液；

b）活性炭柱的处理：将活性碳柱用50%-70%的乙醇以2-3ml/min的流速 平衡3个柱体积，再用去离子水以2-3ml/min的流速平衡3个柱体积，所述的 活性炭柱Φ=3.5cm，H=45cm，内装层析用活性碳85g；

c）单体的分离：将步骤a）酶解后的木寡糖上清液上样于活性炭柱，先用 去离子水以2-3ml/min的流速洗脱1－3个柱体积，再以0.1%－37%的乙醇以 同一流速线性洗脱7-10个柱体积，流速为2－3ml/min，并对乙醇洗脱部分进 行收集。

优选地，所述的活性炭是Cleanert PestiCarb NH2-石墨化碳。

作为本发明的一个实施例，所述的木寡糖是木二糖，步骤b）所述的乙醇 体积浓度是0.1%－10%。

作为本发明的一个实施例，所述的木寡糖是木三糖，步骤b）所述的乙醇 体积浓度是15%－25%。

作为本发明的一个实施例，所述的木寡糖是木四糖，步骤b）所述的乙醇 体积浓度是27%－35%。

作为本发明的一个实施例，所述的木寡糖是木五糖，步骤b）所述的乙醇 体积浓度是36%－37%。

优选地，所述的方法包括以下步骤：

a）木寡糖的提取：称取笋壳加NaOH溶液浸泡后烘干至恒重，称取烘干 后样品至消解罐中，加入蒸馏水后于消解炉中降解，微波功率为700W，消解 时间为8min，最后用蒸馏水定容，取其上清液即为粗木聚糖溶液，然后在此 粗木聚糖溶液中加入木聚糖酶，加酶量为35IU/g木聚糖，酶解8h，取上清液；

b）活性炭柱的处理：将活性碳柱用60%的乙醇以2.5ml/min的流速平衡3 个柱体积，再用去离子水以2.5ml/min的流速平衡3个柱体积，所述的活性炭 柱Φ=3.5cm，H=45cm，内装层析用活性碳85g；

c）单体的分离：将步骤a）酶解后的木寡糖上清液上样于活性炭柱，先用 去离子水以2.5ml/min的流速洗脱2个柱体积，再以0.1%－37%的乙醇以同一 流速线性洗脱8个柱体积，流速为2.5ml/min，并对乙醇洗脱部分进行收集。

本发明优点在于：

1、采用微波-酶法从笋壳中提取木寡糖，且微波前使用碱降解，大大提高 了提取率，同时该方法便于后期木寡糖的分离纯化，有效利用了竹笋加工的废 弃物，绿色环保；

2、本发明利用活性碳柱（尤其是Cleanert PestiCarb NH2-石墨化碳）对木 二至五糖含量较低的木寡糖水溶液进行分离，且活性碳柱使用50%-70%的乙醇 和去离子水进行平衡，能有效分离得到木二至五糖，具体优点体现在：（1）液 相图谱均呈现单峰，峰型对称，纯度均在95%以上；（2）活性炭柱子易于保存， 对流量、压力无特殊限制，吸附量大；（3）活性炭柱子可重复利用，成本低； （4）以水跟乙醇为洗脱液，无需二次除盐；（5）分离时间大大缩短，操作简 单快捷；（6）方法重复性好。

【附图说明】

附图1是木二糖的TLC检测结果。

附图2是木二到五糖的TLC检测结果。

附图3是木二糖质谱图谱。

附图4是木三糖质谱图谱。

附图5是木四糖质谱图谱。

附图6是木五糖质谱图谱。

附图7是木二糖高效液相图谱。

附图8是木三糖高效液相图谱。

附图9是木四糖高效液相图谱。

附图10是木五糖高效液相图谱。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、方法

1、木寡糖的提取

称取笋壳加10倍体积6mol/L NaOH溶液，在60℃条件下浸泡12h，用清 水清洗至pH值8.0左右，在60℃烘箱中烘干至恒重。精确称取烘干后样品2g 至消解罐中，加入50ml蒸馏水，加盖密封后于消解炉中降解，微波功率为 700W，消解时间为8min，待冷却后取出，最后用蒸馏水定容至100ml，取其 上清液即为粗木聚糖溶液，测定其中的木聚糖含量。然后在此粗木聚糖溶液中 加入木聚糖酶，加酶量为35IU/g木聚糖，在50℃恒温振荡箱中酶解8h，取上 清液保存。再使用DNS法测定酶解后上清液中糖含量，同时测定各木寡糖含 量。

2、流动相的配置

蒸馏水和无水乙醇分别过0.22um的水膜和聚偏氟乙烯有机膜，低频产生 脱气。

3、活性炭柱的处理

将活性碳柱（Φ=3.5cm，H=45cm，内装层析用活性碳85g，活性炭是Cleanert  PestiCarb NH2-石墨化碳）用体积分数60%的乙醇以2.5ml/min的流速平衡3 个柱体积，再用去离子水以2.5ml/min的流速平衡3个柱体积。

4、单体的分离

4.1木二糖的分离

将步骤1中酶解后的木寡糖上清液上样于活性炭柱，先用去离子水以 2.5ml/min的流速洗脱2个柱体积，再以5%的乙醇以同一流速线性洗脱8个柱 体积，流速为2.5ml/min，其中乙醇洗脱部分用自动收集器收集。

4.2木三糖的分离

将步骤1中酶解后的木寡糖上清液上样于活性炭柱，先用去离子水以 2.5ml/min的流速洗脱2个柱体积，再以20%的乙醇以同一流速线性洗脱8个 柱体积，流速为2.5ml/min，其中乙醇洗脱部分用自动收集器收集。

4.3木四糖的分离

将步骤1中酶解后的木寡糖上清液上样于活性炭柱，先用去离子水以 2.5ml/min的流速洗脱2个柱体积，再以31%的乙醇以同一流速线性洗脱8个 柱体积，流速为2.5ml/min，其中乙醇洗脱部分用自动收集器收集。

4.4木五糖的分离

将步骤1中酶解后的木寡糖上清液上样于活性炭柱，先用去离子水以 2.5ml/min的流速洗脱2个柱体积，再以36.5%的乙醇以同一流速线性洗脱8 个柱体积，流速为2.5ml/min，其中乙醇洗脱部分用自动收集器收集。

5、分离结果的检测

将洗脱液分管收集，然后用TLC板进行检测，确定2－5糖的具体分布及 纯度，其中TLC板展开剂为正丁醇:甲酸:水＝4:6:1（体积比）。然后根据TLC 板进行单组分合管。

6、纯度测定

将合并的各个单组分进行浓缩除乙醇处理，冻干得固体单体，然后进行 HPLC及MS检测。

HPLC：检测仪器：日本岛津液相色谱仪；色谱柱：Click Xion(250mm× 4.6mm,10μm)；流动相：A水，B乙腈；洗脱条件：0～40min，75%B到50%B； 检测器：蒸发光散射检测器；检测器温度：50℃；柱温：30℃；流速：1.0mL/min； 进样量：20μL。

MS：检测仪器：美国Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL质谱仪；检测条 件：正离子检测模式，喷雾电压(Spray voltage)3.0kV，透镜电压(Tube lens)80V， 毛细管温度(Capillary temp)275℃，毛细管电压(Capillary voltage)43V，鞘流气 体流速(Sheath gas flow rate)8arb，注射泵直接进样，样品流速10μL/min。

二、结果

1、木寡糖的提取

微波消解后得到粗木聚糖溶液，测定得其中木聚糖含量为106.5g/L。经 DNS法测定，酶解后上清液中糖含量高达25%，同时测定各木寡糖含量，得 木二糖占糖总量42.3%，木三糖占糖总量33.35%，木四糖占糖总量16.4%，木 五糖占糖总量5.36%。

2、TLC检测

TLC检测结果如图1和2所示。从图2可以看出，木二到木五糖均为单一 斑点，说明分离效果好。

3、HPLC及MS检测

将制备得到的木二到木五糖固体做HPLC及MS检测，质谱图谱如图3-6 所示，与文献报道吻合，证实所得到的分离物确为木二到木五糖。木二到木五 糖得液相图谱如图7-10所示，从液相图谱可以看出，呈现单峰，且峰型对称， 说明其纯度已达到很高水平，计算得出木二到木五糖纯度都在95％以上，分别 为99.4%、99.2%、98.8%、98.2%。

实施例2

一、方法

1、木寡糖的提取

称取笋壳加10倍体积6mol/L NaOH溶液，在60℃条件下浸泡12h，用清 水清洗至pH值8.0左右，在60℃烘箱中烘干至恒重。精确称取烘干后样品2g 至消解罐中，加入50ml蒸馏水，加盖密封后于消解炉中降解，微波功率为 600W，消解时间为10min，待冷却后取出，最后用蒸馏水定容至100ml，取其 上清液即为粗木聚糖溶液，测定其中的木聚糖含量。然后在此粗木聚糖溶液中 加入木聚糖酶，加酶量为60IU/g木聚糖，在50℃恒温振荡箱中酶解6h，取上 清液保存。再使用DNS法测定酶解后上清液中糖含量，同时测定各木寡糖含 量。

2、流动相的配置

蒸馏水和无水乙醇分别过0.22um的水膜和聚偏氟乙烯有机膜，低频产生 脱气。

3、活性炭柱的处理

将活性碳柱（Φ=3.5cm，H=45cm，内装层析用活性碳85g，活性炭是Cleanert  PestiCarb NH2-石墨化碳）用体积分数70%的乙醇以2ml/min的流速平衡3个 柱体积，再用去离子水以3ml/min的流速平衡3个柱体积。

4、单体的分离

4.1木二糖的分离

将步骤1中酶解后的木寡糖上清液上样于活性炭柱，先用去离子水以 2ml/min的流速洗脱3个柱体积，再以0.1%的乙醇以同一流速线性洗脱10个 柱体积，流速为2ml/min，其中乙醇洗脱部分用自动收集器收集。

4.2木三糖的分离

将步骤1中酶解后的木寡糖上清液上样于活性炭柱，先用去离子水以 2ml/min的流速洗脱3个柱体积，再以15%的乙醇以同一流速线性洗脱10个柱 体积，流速为2ml/min，其中乙醇洗脱部分用自动收集器收集。

4.3木四糖的分离

将步骤1中酶解后的木寡糖上清液上样于活性炭柱，先用去离子水以 2ml/min的流速洗脱3个柱体积，再以27%的乙醇以同一流速线性洗脱10个柱 体积，流速为2ml/min，其中乙醇洗脱部分用自动收集器收集。

4.4木五糖的分离

将步骤1中酶解后的木寡糖上清液上样于活性炭柱，先用去离子水以 2ml/min的流速洗脱3个柱体积，再以36%的乙醇以同一流速线性洗脱10个柱 体积，流速为2ml/min，其中乙醇洗脱部分用自动收集器收集。

5、分离结果的检测

具体操作同实施例1。

6、纯度测定

具体操作同实施例1。

二、结果

1、木寡糖的提取

微波消解后得到粗木聚糖溶液，测定得其中木聚糖含量为200.3g/L。经 DNS法测定，酶解后上清液中糖含量高达24.6%，同时测定各木寡糖含量，得 木二糖占糖总量41.2%，木三糖占糖总量32.06%，木四糖占糖总量17.8%，木 五糖占糖总量5.32%。

2、TLC检测

从TLC检测结果可以看出，木二到木五糖均为单一斑点，说明分离效果 好。

3、HPLC及MS检测

将制备得到的木二到木五糖固体做HPLC及MS检测，质谱图谱与文献报 道吻合，证实所得到的分离物确为木二到木五糖。从木二到木五糖的液相图谱 可以看出，呈现单峰，且峰型对称，说明其纯度已达到很高水平，计算得出木 二到木五糖纯度都在95％以上，分别为98.5%、98.2%、98.0%、97.5%。

实施例3

一、方法

1、木寡糖的提取

称取笋壳加10倍体积6mol/L NaOH溶液，在60℃条件下浸泡12h，用清 水清洗至pH值8.0左右，在60℃烘箱中烘干至恒重。精确称取烘干后样品2g 至消解罐中，加入50ml蒸馏水，加盖密封后于消解炉中降解，微波功率为 800W，消解时间为6min，待冷却后取出，最后用蒸馏水定容至100ml，取其 上清液即为粗木聚糖溶液，测定其中的木聚糖含量。然后在此粗木聚糖溶液中 加入木聚糖酶，加酶量为10IU/g木聚糖，在50℃恒温振荡箱中酶解10h，取 上清液保存。再使用DNS法测定酶解后上清液中糖含量，同时测定各木寡糖 含量。

2、流动相的配置

蒸馏水和无水乙醇分别过0.22um的水膜和聚偏氟乙烯有机膜，低频产生 脱气。

3、活性炭柱的处理

将活性碳柱（Φ=3.5cm，H=45cm，内装层析用活性碳85g，活性炭，是 Cleanert PestiCarb NH2-石墨化碳）用体积分数50%的乙醇以3ml/min的流速平 衡3个柱体积，再用去离子水以2ml/min的流速平衡3个柱体积。

4、单体的分离

4.1木二糖的分离

将步骤1中酶解后的木寡糖上清液上样于活性炭柱，先用去离子水以 3ml/min的流速洗脱1个柱体积，再以10%的乙醇以同一流速线性洗脱7个柱 体积，流速为3ml/min，其中乙醇洗脱部分用自动收集器收集。

4.2木三糖的分离

将步骤1中酶解后的木寡糖上清液上样于活性炭柱，先用去离子水以 3ml/min的流速洗脱1个柱体积，再以25%的乙醇以同一流速线性洗脱7个柱 体积，流速为3ml/min，其中乙醇洗脱部分用自动收集器收集。

4.3木四糖的分离

将步骤1中酶解后的木寡糖上清液上样于活性炭柱，先用去离子水以 3ml/min的流速洗脱1个柱体积，再以35%的乙醇以同一流速线性洗脱7个柱 体积，流速为3ml/min，其中乙醇洗脱部分用自动收集器收集。

4.4木五糖的分离

将步骤1中酶解后的木寡糖上清液上样于活性炭柱，先用去离子水以 3ml/min的流速洗脱1个柱体积，再以37%的乙醇以同一流速线性洗脱7个柱 体积，流速为3ml/min，其中乙醇洗脱部分用自动收集器收集。

5、分离结果的检测

具体操作同实施例1。

6、纯度测定

具体操作同实施例1。

二、结果

1、木寡糖的提取

微波消解后得到粗木聚糖溶液，测定得其中木聚糖含量为20.9g/L。经DNS 法测定，酶解后上清液中糖含量高达24.77%，同时测定各木寡糖含量，得木 二糖占糖总量43.1%，木三糖占糖总量34.25%，木四糖占糖总量15.82%，木 五糖占糖总量5.20%。

2、TLC检测

从TLC检测结果可以看出，木二到木五糖均为单一斑点，说明分离效果 好。

3、HPLC及MS检测

将制备得到的木二到木五糖固体做HPLC及MS检测，质谱图谱与文献报 道吻合，证实所得到的分离物确为木二到木五糖。从木二到木五糖的液相图谱 可以看出，呈现单峰，且峰型对称，说明其纯度已达到很高水平，计算得出木 二到木五糖纯度都在95％以上，分别为98.3%、98.1%、97.2%、97.0%。

实施例4

实施例1-3的实验各重复5次，计算木二至五糖纯度，计算变异系数，结 果见表1。由表1可以看出重复实验的变异系数均较小，表明该方法重复性较 好。

表1重复性实验变异系数

变异系数（%） 木二糖 木三糖 木四糖 木五糖 实施例1 1.35 1.36 1.32 1.29 实施例2 1.40 1.82 1.61 1.92 实施例3 1.79 1.62 2.10 2.04

对比例1

一、方法

具体操作同实施例1，不同之处仅在于其活性炭柱的处理这一步骤，具体 如下：将活性碳柱（Φ=3.5cm，H=45cm，内装层析用活性碳85g，活性炭是 Cleanert PestiCarb NH2-石墨化碳）用体积分数75%的乙醇以2.5ml/min的流速 平衡3个柱体积，再用去离子水以2.5ml/min的流速平衡3个柱体积。

二、结果

通过木二到木五糖的液相图谱，计算得出木二到木五糖纯度分别为82.5%、 80.1%、82.8%、80.6%，显著低于实施例1。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些 改进和补充也应视为本发明的保护范围。