对于谷氨酸显示高活性的新型氨基转移酶、编码该酶的基因和它们的利用法

摘要

本发明提供一种用于从酮化合物廉价且高效地制造作为医药品或农药等的中间体有用的光学活性氨基化合物的方法。对作为氨基供体的谷氨酸显示相比于对作为氨基供体的L-丙氨酸更高的活性，且以93%以上的高的光学纯度生成(S)1-苄基-3-吡咯烷酮的新型具有氨基转移酶活性的多肽、编码该多肽的基因、高表达该基因的转化体。

说明书

技术领域

本发明涉及能够通过氨基转移反应将酮化合物高效地转换为光学活性 氨基化合物的酶和使用该酶的光学活性氨基化合物的制造方法。所得到的光 学活性氨基化合物能够作为医药品或农药等的中间体利用。

背景技术

关于使用了氨基转移酶的光学活性胺的制造方法，到目前为止对于α- 氨基酸的制造方法有很多报道，但关于α-氨基酸以外的光学活性胺化合物的 制造方法的报告例则很少。近年来，发现了生成α-氨基酸以外的光学活性胺 的氨基转移酶，期待利用作为一般的光学活性胺的有效的制造方法。

但是，到目前为止已知的生成α-氨基酸以外的光学活性胺的氨基转移酶 存在很多问题(非专利文献1)。

例如，虽然使用α-氨基酸作为氨基供体，用酶法除去副生成的α-酮酸有 用，但发挥作为氨基供体作用的α-氨基酸实质上昂贵且限定于溶解度低的丙 氨酸。

另外，在α-氨基酸以外的光学活性氨基化合物之中，尚未发现特别是以 93%e.e.以上的高光学纯度生成作为医药品中间体有用的(S)-1-苄基-3-氨基 吡咯烷的氨基转移酶(专利文献1、2，非专利文献2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2007-185133号公报

专利文献2：WO2006/126498号公报

非专利文献

非专利文献1：Trends in Biotechnology28,324-332(2010)

非专利文献2：Adv.Synth.Catal.350,807-812(2008)

发明内容

发明要解决的问题

本发明的课题在于提供用于从酮化合物高效地制造作为医药品或农药 等的中间体有用的光学活性氨基化合物的方法。

解决问题的方法

本发明的发明人等进行了以各种土壤分离菌为对象的筛选，结果发现了 如下的微生物：该微生物具有氨基转移催化活性，以93%e.e.以上的高的光 学纯度生成(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷，且作为氨基供体对于廉价且溶解度高 的谷氨酸显示高活性。另外，成功地从该微生物中分离纯化出具有该活性的 多肽。另外，以基因重组的方法获取编码该多肽的基因，明确了其碱基序列。 此外，通过对使用该基因产生该酶的转化体进行育种，确立了能够制作更高 活性的该转化体、能够在工业上制造光学活性的氨基化合物的方法。

即，本发明为具有下述理化学性质(1)至(6)的多肽：

(1)作用：催化如下的氨基转移反应，该反应为在氨基供体的存在下与 1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93%e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯 烷。

(2)底物特异性：

(a)氨基供体：对于(S)-1-苯乙胺显示活性，相比于L-丙氨酸对L-谷氨酸 显示更高的活性，且对于β-丙氨酸、4-氨基丁酸实质上不显示活性。

(b)氨基受体：相比于丙酮酸对2-氧代戊二酸显示更高的活性。

(3)最适pH：7.0～8.0；

(4)最适温度：30～50℃；

(5)热稳定性：在pH8.0、30～50℃处理30分钟时，保持处理前全部活性 的70%以上的残留活性。

(6)分子量：在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，约为48kDa。

另外，本发明为如下的多肽，该多肽包括与序列表的序列编号1表示的 氨基酸序列具有50%以上的序列同一性的氨基酸序列，具有在氨基供体的存 在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93%e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨 基吡咯烷的活性。

或者本发明为如下的多肽，该多肽包括与序列表的序列编号1显示的氨 基酸序列具有50%以上的序列同一性的氨基酸序列，作为氨基供体对于 (S)-1-苯乙胺显示活性，相比于L-丙氨酸对L-谷氨酸显示更高的活性，且对 于β-丙氨酸、4-氨基丁酸实质上不显示活性，作为氨基受体相比于丙酮酸对 2-氧代戊二酸显示更高的活性。

或者为如下的多肽，该多肽具有在序列表的序列编号1所示的氨基酸序 列中缺失、取代、插入或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列，且具有在 氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93%e.e.以上的 (S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的活性。

或者为如下的多肽，该多肽具有序列表的序列编号1所示的氨基酸序列 中缺失、取代、插入或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列，且作为氨基 供体对于(S)-1-苯乙胺显示活性，相比于L-丙氨酸对L-谷氨酸显示更高的活 性，且对于β-丙氨酸、4-氨基丁酸实质上不显示活性，作为氨基受体相比于 丙酮酸对2-氧代戊二酸显示更高活性。

另外，本发明还为编码上述多肽的DNA、含有该DNA的载体、以及由 该载体转化得到的转化体。

另外，本发明为一种光学活性氨基化合物的制造方法，其包括：在氨基 供体的存在下，使上述多肽或上述转化体的培养物与酮化合物作用。

另外为一种光学活性氨基化合物的制造方法，其包括：在氨基受体的存 在下，使上述多肽或上述转化体的培养物与氨基化合物的对映体混合物作 用。

本说明书包含作为本申请的优选权基础的日本特许出愿2010-216546号 所记载的全部内容。

发明的效果

通过分离对于廉价且溶解度高的谷氨酸显示高活性，以高的光学纯度生 成光学活性氨基化合物的多肽，以及获得该多肽生产能力高的转化体，能够 廉价且高效地制造目标光学活性氨基化合物。

具体实施方式

以下，详细地说明本发明。此外，本说明书中记述的DNA的分离、载 体的制备、转化等基因操作只要没有特别说明，就能够通过“Molecular  Cloning2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、Current  Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and  Wiley-Interscience)”等教科书中记载的方法进行。另外，酶活性的单位只要 没有特别说明，就将1分钟得到1μmol的产物的酶量设为1U。

1.本发明多肽的理化学的各项性质

本发明多肽为具有以下理化学性质的多肽

(1)作用：催化如下氨基转移反应，该反应为在氨基供体的存在下与1- 苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93%e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷。

(2)底物特异性：

(a)氨基供体：对于(S)-1-苯乙胺显示活性，相比于L-丙氨酸对L-谷氨酸 显示更高的活性，且对于β-丙氨酸、4-氨基丁酸实质上不显示活性。

(b)氨基受体：相比于丙酮酸对2-氧代戊二酸显示更高的活性。

(3)最适pH：7.0～8.0；

(4)最适温度：30～50℃；

(5)热稳定性：在pH8.0、30～50℃处理30分钟时，保持处理前全部活性 的70%以上的残留活性。

(6)分子量：在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，约为48kDa。

(底物特异性的测定方法-1：对于(S)-1-苯乙胺的活性)

本发明多肽对于(S)-1-苯乙胺显示活性。其中，显示活性的意思是指： 用以下的方法测定氨基转移活性时，1分钟生成的苯乙酮的量相对于粗纯化 多肽液1ml为0.01μmol以上，优选为0.1μmol以上，更优选为1μmol以上。

上述氨基转移酶活性能够通过以下的方法测定(称为“活性测定法A”)。

在酶液0.2mL中添加具有下述组成的底物溶液0.8mL，在30℃使其反 应60分钟后，添加6当量盐酸(規定塩酸)50μL使反应停止。通过下述条件 利用高效液相色谱分析该反应液，对生成的苯乙酮进行定量(以下，称为“活 性测定法A”)。

“活性测定法A”

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱的测定条件]

色谱柱：Cosmosil5C8-MS(Nacalai Tesque株式会社制)

洗脱液：蒸馏水2000mL/乙腈500mL/甲醇500ml/KH₂PO₄6.1g/H₃PO₄2.5g

流速：1mL/分钟

检测：254nm

柱温：30℃

(底物特异性的测定方法-2：对于ω-氨基酸的活性)

在将β-丙氨酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、±2,4-二氨基丁 酸、L-鸟氨酸、L-赖氨酸和腐胺(プレットシン)作为氨基供体时，本发明多 肽实质上不显示活性。其中，实质上不显示活性的意思是指，通过以下的方 法测定了氨基转移活性时，使用了上述氨基化合物作为氨基供体时的活性为 使用了(S)-1-苯乙胺时的1/100以下、优选为1/1000以下、更优选为1/10000 以下。

使用了上述的氨基供体时的氨基转移酶活性能够通过以下的方法测定。

在酶液100μL中以最终浓度为下述底物溶液组成的方式添加各试剂，制 备400μL反应液。在30℃使其反应60分钟后，加入3当量盐酸20μL使反 应停止。然后，在所得到的反应液20μL中，分别加入0.2M碳酸钠水溶液 80μL、3.3mg/mL丹酰氯(ダブシルクロリド)的丙酮溶液200μL，在70℃使 其反应10分钟。在该反应液50μL中加入乙酸20μL进行搅拌，通过下述条 件利用高效液相色谱分析，对丹酰化(ダブシル化)的谷氨酸定量。其中，在 本测定方法中，调整使用的酶的活性使生成谷氨酸量为2.8mM以下。

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱的测定条件]

色谱柱：YMC-Pack Pro C18RS(YMC公司制)

洗脱液：乙腈/45mM乙酸缓冲液(pH4.1)＝35/65(体积比)

流速：0.9mL/分钟

检测：254nm

柱温：30℃

(底物特异性的测定方法-3：对于2-氧代戊二酸和丙酮酸的活性)

代替2-氧代戊二酸，本发明多肽以丙酮酸作为氨基受体也显示活性，相 比于丙酮酸，以2-氧代戊二酸作为氨基受体显示更高的活性。相比于丙酮酸， 以2-氧代戊二酸作为氨基受体显示更高的活性是指在上述的“活性测定法 A”中，代替2-氧代戊二酸以丙酮酸作为氨基受体测定时的氨基转移活性显 示以2-氧代戊二酸作为氨基受体测定得到的活性的1/2以下、优选显示1/5 以下的活性。

(底物特异性的测定方法-4：对于L-丙氨酸和L-谷氨酸的活性)

本发明多肽相比于L-丙氨酸以L-谷氨酸作为氨基供体显示更高的活性。 相比于L-丙氨酸以L-谷氨酸作为氨基供体显示更高的活性是指：用以下的 方法测定氨基转移活性时，以L-谷氨酸作为氨基供体测定时的氨基转移活性 显示以L-丙氨酸作为氨基供体测定得到的活性的2倍以上、优选为5倍以上、 更优选为10倍以上的活性。

使用了上述的氨基供体时的氨基转移酶活性能够通过以下的方法测定。

在酶液200μL以最终浓度为下述底物溶液组成的方式添加各试剂，制备 400μL反应液。在30℃使其反应90分钟后，加入6当量盐酸15μL使反应 停止。然后，通过下述条件利用高效液相色谱分析所生成得到的反应液。

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱的分析条件]

色谱柱：Finepak SIL C18-T(日本分光株式会社制)

洗脱液：蒸馏水945mL/乙腈555mL/KH₂PO₄7.5g/SDS2.16g(利用 H₃PO₄调制为pH3.6)

流速：1mL/分钟

检测：254nm

柱温：40℃

(对1-苄基-3-吡咯烷酮的立体选择性的测定方法)

本发明多肽显示催化如下氨基转移反应的活性，该反应为在氨基供体的 存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93%e.e.以上、优选95%e.e. 以上、更优选97%e.e.以上、最优选98%e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷。

使用了上述的氨基供体时的氨基转移酶活性能够通过以下的方法测定。

在酶液200μL以最终浓度为下述底物溶液组成的方式添加各试剂，制备 400μL反应液。在30℃使其反应90分钟反应后，加入6当量盐酸15μL使 反应停止。接着，通过下述条件利用高效液相色谱分析生成得到的反应液。

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱的分析条件]

<定量分析>

色谱柱：Finepak SIL C18-T(日本分光株式会社制)

洗脱液：蒸馏水945mL/乙腈555mL/KH₂PO₄7.5g/SDS2.16g(利用 H₃PO₄调制为pH3.6)

流速：1mL/分钟

检测：254nm

柱温：40℃

<光学纯度分析>

用适量的碳酸钠使反应液为碱性后，用二硝基苯甲酰氯衍生物化，然后， 利用以下的条件进行分析。

色谱柱：Chiralcel IA(Daicel化学工业株式会社制)

洗脱液：己烷/乙醇/二乙胺/乙腈＝800/200/1/5(体积比)

流速：0.8mL/分钟

检测：254nm

柱温：30℃

(最适pH)

氨基转移反应的最适pH能够通过用上述的“活性测定法A”中记载的 方法在pH4.0～10的范围测定氨基转移活性来确定。其中，在上述测定方法 中，根据进行测定的pH，底物溶液的缓冲液使用下述缓冲液。最适pH是指 在上述测定中显示最高活性值的pH。

pH4.0～6.0：0.1M乙酸钠缓冲液

pH6.0～8.5：0.1M磷酸钾缓冲液

pH8.0～9.0：0.1M Tris-盐酸缓冲液

pH9.0～10：0.1M碳酸钠缓冲液

(最适温度)

氨基转移反应的最适温度定义为用上述的“活性测定法A”中记载的方 法在30～70℃的范围测定氨基转移活性时显示最大活性值的温度。

(热稳定性)

多肽的热稳定性为在0.5mM吡哆醛磷酸、0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0) 中，分别在温度30～70℃处理30分钟后，用上述的“活性测定法A”记载 的方法测定氨基转移活性，将热处理前的活性设为100%时，具有热处理后 70%以上的残留活性的范围。

(分子量)

多肽的分子量是通过在使用了10%聚丙烯酰胺凝胶的十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，利用与标准蛋白质的迁移率的比较而算出的。

2.本发明多肽的分离

本发明实施方式的多肽只要是显示上述性质的多肽，则任何多肽都包含 在本发明实施方式的多肽中，例如能够从节杆菌属(Arthrobacter)微生物获 得。作为本发明实施方式的多肽的来源的微生物，优选列举本领域技术人员 能够容易从公众保藏机构(例如NBRC等)得到的节杆菌属菌种(Arthrobacter  sp.)，更优选列举节杆菌属菌种(Arthrobacter sp.)KNK04-25。该节杆菌属菌种 (Arthrobacter sp.)KNK04-25于2010年6月11日以保藏号NITE P-954保藏 于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(〒292-0818 日本千叶县木更津市Kazusa镰足2-5-8)，其后于2011年9月12日以保藏号 NITE BP-954由NITE P-954移管。

(培养基成分)

作为用于培养具有本发明多肽的微生物的培养基，只要该微生物增殖， 就能够使用包含通常的碳源、氮源、无机盐类、有机营养素等的液体营养培 养基。

此外，在培养上述微生物时，作为本多肽的诱导物质，能够在培养基中 添加丙基胺、1-丁基胺、2-丁基胺、2-戊基胺、异丙基胺、异丁基胺、7-甲 氧基-2-氨基1,2,3,4-四氢化萘、1-苯乙胺、1-苄基-3-氨基吡咯烷等氨基化合 物来进行培养。上述诱导物质既可以单独或者也可以混合2种类以上使用。 上述诱导物质的添加量没有特别限制，但从菌的生长抑制等观点考虑，优选 为在通常培养基组成中1重量%以下。另外，对上述诱导物质的添加时刻没 有特别限制，可以在培养开始时或者也可以在培养过程中的任何时刻。另外， 为了提高上述诱导物质的效果，有时减少上述诱导物质以外的通常的碳源、 氮源、无机盐类、有机营养素是有效的。

(多肽的纯化)

可以根据本领域技术人员所公知的蛋白质纯化法进行从生产本发明实 施方式的多肽的微生物中纯化该多肽。例如，通过从该微生物的培养液中离 心分离，或者通过过滤收集菌体，将所得到的菌体利用超声波破碎机或使用 玻璃珠等物理方法破碎，然后用离心分离除去菌体残余物，制备无细胞提取 液，通过将该无细胞提取液供给至分级沉淀、离子交换色谱、疏水性色谱、 凝胶过滤色谱、反相色谱、超滤等能够分离多肽。

3.本发明多肽的氨基酸序列

作为本发明多肽能够列举以下的多肽(a)～(g)。

(a)包括序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的多肽；

(b)包括在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或 添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有在氨基供体的存在下与1- 苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93%e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷 的活性的多肽；

(c)包括在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或 添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且作为氨基供体对于(S)-1-苯乙胺 显示活性，相比于L-丙氨酸对L-谷氨酸显示更高的活性，且对于β-丙氨酸、 4-氨基丁酸实质上不显示活性，作为氨基受体相比于丙酮酸对2-氧代戊二酸 具有更高的活性的多肽；

(d)包括在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或 添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且最适pH为7.0～8.0，最适温度为 30～50℃，在30～50℃处理30分钟时保持处理前的70%以上的残留活性，分 子量在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中约为48kDa的多肽；

(e)包括与序列表的序列编号1中记载的氨基酸序列具有50%以上的序 列同一性的氨基酸序列、且具有在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮 作用生成光学纯度93%e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的活性的多肽；

(f)包括与序列表的序列编号1中记载的氨基酸序列具有50%以上的序列 同一性的氨基酸序列、且作为氨基供体对于(S)-1-苯乙胺显示活性，相比于 L-丙氨酸对L-谷氨酸显示更高活性，且对于β-丙氨酸、4-氨基丁酸实质上不 显示活性，作为氨基受体相比于丙酮酸对2-氧代戊二酸具有更高活性的多 肽；

(g)包括与序列表的序列编号1中记载的氨基酸序列具有50%以上的序 列同一性的氨基酸序列、且最适pH为7.0～8.0，最适温度为30～50℃，在 30～50℃处理30分钟时保持处理前的70%以上的残留活性，分子量在十二烷 基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中约为48kDa的多肽。

作为本发明多肽的氨基酸序列，能够列举由序列表的序列编号2所示的 碱基序列编码的、序列表的序列编号1所示的氨基酸序列。

包括序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加 了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的多肽能够根据Current Protocols in  Molecular Biology(John Wiley and Sons,Inc.,1989)等中记载的公知的方法制 备，只要具有上述理化学的各项性质，就包含在上述的多肽中。

在序列表的序列编号1所示的氨基酸序列中，对于氨基酸缺失、取代、 插入或添加的位置没有特别限制，优选避开高度保守区域。其中，高度保守 区域表示对于来源不同的多种酶(多肽)，将氨基酸序列最优地对齐比较时多 个序列之间氨基酸一致的位置。高度保守区域能够通过使用GENETYX等工 具比较序列编号1所示的氨基酸序列与上述来自其他微生物的氨基转移酶 (多肽)的氨基酸序列来确认。

作为由缺失、取代、插入或添加所改变的氨基酸序列，既可以仅包含1 种类型(例如取代)的改变，也可以包含2种以上的改变(例如、取代和插入)。 另外，在取代时，进行取代的氨基酸优选为与取代前的氨基酸具有类似性质 的氨基酸(同族氨基酸)。其中，在以下列举的各组的同一组内的氨基酸为同 族氨基酸。

(第1组：中性非极性氨基酸)Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Pro、 Phe

(第2组：中性极性氨基酸)Ser、Thr、Gln、Asn、Trp、Tyr

(第3组：酸性氨基酸)Glu、Asp

(第4组：碱性氨基酸)His、Lys、Arg。

上述的记载中“多个氨基酸”的意思是指例如60个氨基酸，优选20个 氨基酸，更优选15个氨基酸，更加优选10个氨基酸，更加优选5个、4个、 3个或2个以下氨基酸。

与序列表的序列编号1所示的氨基酸序列的序列同一性优选为50%以 上，但更优选为70%以上，更加优选为80%以上，更加优选为85%以上， 更加优选为90%以上，最优选为95%以上。

氨基酸序列的序列同一性由以下的值表示，该值是通过比较序列表的序 列编号1所示的氨基酸序列与待评价的氨基酸序列，将两个序列中氨基酸一 致的位置的数目除以进行比较的总氨基酸数，再乘以100得到的。

只要具有在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度 93%e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的活性，就能够在序列编号1中记载 的氨基酸序列中结合添加的氨基酸序列。例如，能够添加组氨酸标签或HA 标签这样的标签序列。或者也能够制成与其他蛋白质的融合蛋白。另外，只 要具有氨基转移的上述活性，也可以为肽片段。

4.编码本发明多肽的DNA的克隆

本发明的DNA为编码上述多肽的DNA，只要为在根据后述的方法所导 入的宿主细胞内能够表达上述多肽的DNA任何都可以，也可以包含任意的 非翻译区域。本发明的DNA只要是本领域的技术人员就能够根据序列表的 序列编号2利用化学合成法容易地获得。作为其他方法，只要能够获得所纯 化的上述多肽即可，如为本领域技术人员则能够通过公知的方法，从作为该 多肽来源的微生物中获得上述DNA。

以下，作为获得本发明实施方式的DNA的方法，虽然记载了使用了上 述节杆菌属菌种(Arthrobacter sp.)KNK04-25的例子，但本发明不限定于此。

首先，将从该微生物的无细胞提取液纯化的上述多肽通过适当的内肽酶 消化，通过反相HPLC将所切断的片段纯化后，例如通过“PPSQ-33A型全 自动蛋白质一级结构分析机(岛津制作所株式会社制)”等确定氨基酸序列的 一部分或全部。基于这样操作得到的氨基酸序列信息，合成用于扩增编码该 多肽的DNA的一部分的PCR(Polymerase Chain Reaction)引物。接着，通过 通常的DNA分离法，例如Visser等方法(Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,415 (2000))，制备作为该多肽来源的微生物的染色体DNA。以该染色体DNA作 为模板，使用先前所述的PCR引物进行PCR，扩增编码该多肽的DNA的一 部分，确定该碱基序列。碱基序列的确定，例如能够使用“ABI3100型DNA Sequencer(Applied Biosystems公司制)”等进行。

只要知道编码该多肽的DNA的一部分的碱基序列，就能够例如通过反 向PCR法(Nucl.Acids Res.,16,8186(1988))确定其全体的序列。

作为这样操作得到的多肽的DNA，例如，能够列举包含序列表的序列 编号2所示的碱基序列的DNA。

以下，说明序列表的序列编号2所示的碱基序列。

5.编码本发明多肽的DNA的碱基序列

作为编码本发明多肽的DNA，能够列举例如以下的DNA(A)～(C)。

(A)包括序列表的序列编号2中记载的碱基序列的DNA；

(B)在严谨的条件下，和包括与序列表的序列编号2中记载的碱基序列 互补的碱基序列的DNA杂交的DNA；

(C)包括在序列表的序列编号2中记载的碱基序列中，缺失、取代、插 入或添加了1个或多个碱基的碱基序列的DNA。

其中，“在严谨的条件下，和包括与序列表的序列编号2中记载的碱基 序列互补的碱基序列的DNA杂交的DNA”是指：以包括与序列表的序列编 号2所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA作为探针，在严谨的条件下通 过使用菌落-杂交法、噬菌斑-杂交法或者Southern杂交法等得到的DNA。

杂交能够根据“Molecular Cloning,A laboratory manual,second edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)”等中记载的方法进行。其中，在 严谨的条件下进行杂交的DNA能够列举通过例如使用固定化了来自菌落或 者噬菌斑的DNA的过滤器，在0.7～1.0M的NaCl存在下，在65℃进行杂交 后，使用2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成包括150mM氯 化钠、15mM柠檬酸钠)，在65℃的条件下清洗过滤器而获得的DNA。优选 为能够通过在65℃用0.5倍浓度的SSC溶液清洗、更优选在65℃用0.2倍 浓度的SSC溶液清洗、更加优选在65℃用0.1倍浓度的SSC溶液清洗而获 得的DNA。

如上记载了杂交条件，但这些条件没有特别限制。作为影响杂交的严谨 性的要素，可以列举温度或盐浓度等多个要素，只要是本领域技术人员，就 能够通过适当选择这些要素而实现最适的严谨性。

作为能够在上述的条件下杂交的DNA，能够列举与序列编号2所示的 DNA序列同一性为70%以上、优选为75%以上、更优选为80%以上、更加 优选为85%以上、最优选为90%以上的DNA，只要所编码的多肽具有上述 的氨基转移活性，就包含于上述DNA中。

其中，DNA的序列同一性(%)是由将所对比的2条DNA最优地对齐， 将核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)在两个序列中一致的位置的数目除以 比较的碱基总数，然后在该结果上乘以100而得到的数值所表示的。

DNA的序列同一性，例如使用以下的序列分析用工具算出得到：GCG  Wisconsin Package(Program Manual for The Wisconsin Package,Version8, 1994年9月，Genetics Computer Group,575Science Drive Medison,Wisconsin, USA53711；Rice,P.(1996)Program Manual for EGCG Package,Peter Rice, The Sanger Centre,Hinxton Hall,Cambridge,CB101RQ,England)、以及the  ExPASy World Wide Web分子生物学用服务器(Geneva University Hospital  and University of Geneva,Geneva,Switzerland)。

其中，序列表的序列编号2中记载的碱基序列中缺失、取代、插入或添 加了1个或多个碱基的DNA能够根据“Current Protocols in Molecular  Biology(John Wiley and Sons,Inc.,1989)”等记载的公知的方法制备。

在序列表的序列编号2所示的碱基序列中，碱基缺失、取代、插入或添 加的位置没有特别限制，优选避开高度保守区域，不产生移码。其中，高度 保守区域表示对于来源不同的多个多肽，将碱基序列最优对齐比较时，多个 序列之间碱基一致位置。高度保守区域能够通过使用GENETYX等工具比较 序列编号2所示的碱基序列和来自公知微生物的氨基转移酶基因的碱基序 列来确认。

作为通过缺失、取代、插入或添加所改变的碱基序列，既可以仅包含1 种类型(例如取代)的改变，也可以包含2种类以上的改变(例如、取代和插入)。

上述记载的多个碱基的意思是指例如150个、优选100个、更优选50 个、更加优选20个、10个、5个、4个、3个或2个以下的碱基。

6.载体

作为用于将本发明实施方式的DNA导入宿主微生物内，使其在其所导 入的宿主微生物内表达的载体DNA，只要是能够在适当的宿主微生物内表 达该DNA编码的多肽的载体即可。作为这样的载体DNA，例如，可以列举 质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体等。另外，也可以使用与其他宿主菌株之 间能够交换基因的穿梭载体。

这样的载体能够优选使用包含可操作连接的启动子(lacUV5启动子、trp 启动子、trc启动子、tac启动子、lpp启动子、tufB启动子、recA启动子、 pL启动子等)控制因子，包含与本发明DNA可操作连接的表达单元的载体。 例如可以列举pUC18(东洋纺织株式会社制)、pUC19(东洋纺织株式会社制)、 pUCNT(国际公开第WO94/03613号公报)等。

控制因子是指功能性启动子和具有任意的相关的转录要素(例如增强 子、CCAAT盒、TATA盒、SPI位点等)的碱基序列。

另外，可操作连接是指调节基因表达的启动子、增强子等各种调节因子 和基因在宿主细胞中以能够操作的状态连接。控制因子的类型和种类可以根 据宿主而改变是本领域技术人员所公知的事项。

关于在各种生物中能够利用的载体、启动子等，在“微生物学基础讲座 8基因工学(共立出版、1987)”等中有详细记述。

7.宿主和转化体

用于使本发明实施方式的DNA表达的宿主生物，只要是能够由含有编 码各多肽的DNA的表达载体转化、表达导入了DNA的多肽的生物，就没 有特别限制。作为能够利用的微生物，例如可以列举埃希氏菌属 (Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌 属(Serratia)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、链球 菌属(Streptococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)等开发有宿主载体系统的细 菌，红球菌属(Rhodococcus)和链霉菌属(Streptomyces)等开发有宿主载体系统 的放线菌，酿酒酵母菌属(Saccharomyces)、克吕沃尔氏酵母菌属 (Kluyveromyces)、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)、接合酵母菌属 (Zygosaccharomyces)、耶氏酵母菌属(Yarrowia)、丝孢酵母菌属 (Trichosporon)、拮抗酵母菌属(Rhodosporidium)、毕赤酵母菌属(Pichia)、和 假丝酵母菌属(Candida)等开发有宿主载体系统的酵母，脉孢菌属 (Neurospora)、曲霉菌属(Aspergillus)、头孢菌属(Cephalosporium)、和木霉菌 属(Trichoderma)等开发有宿主载体系统的霉菌等。另外，除微生物之外，在 植物、动物中也开发有各种宿主-载体系统，特别是开发使用了蚕的昆虫 (Nature315,592-594(1985))或菜籽、玉米、马铃薯等植物中使异源蛋白质大 量表达的系统，能够合适地利用。这些之中，从导入和表达效率考虑优选细 菌，特别优选大肠杆菌。

含有本发明DNA的多肽表达载体，能够通过公知的方法导入至宿主微 生物。例如，作为宿主微生物使用大肠杆菌时，能够通过使用市售的E.coli  HB101感受态细胞(Takara Bio株式会社制)将该载体导入宿主细胞。

8.光学活性氨基化合物的制造方法

接着，说明使用本发明实施方式的多肽或具有该多肽生产能力的微生物 制造光学活性氨基化合物的方法。

作为具有本发明实施方式的多肽生产能力的微生物，例如，可以列举上 述节杆菌属菌种(Arthrobacter sp.)KNK04-25和导入了包含实施方式的DNA 的载体的转化体。

作为本发明的光学活性氨基化合物的制造方法，可以列举从氨基供体使 氨基转移至与作为目的的氨基化合物骨架相同的酮化合物，获取生成的光学 活性氨基化合物的方法(以下，称为制造方法I)；以及在氨基化合物的对映 体混合物中，使一方对映体的氨基选择性地转移至氨基受体，获取残存的对 映体(光学活性氨基化合物)的方法(以下，称为制造方法II)。

首先，说明制造方法I。

(制造方法I)

制造方法I为在氨基供体的存在下，使本发明多肽或具有本发明多肽生 产能力的转化体的培养物与酮化合物作用来制造光学活性氨基化合物的方 法。

本制造方法，例如为通过在氨基供体的存在下，使上述多肽或者具有该 多肽生产能力的微生物的培养物与通式(1)所示的酮化合物作用来制造通式 (2)所示的光学活性氨基化合物的方法。

[化学式1]

[化学式2]

在上述式(1)和(2)中，R¹和R²表示任选被取代的烷基、任选被取代的芳 烷基或任选被取代的芳基，R¹和R²两者任选互相结合形成环。其中，R¹和 R²结构不同。

R¹和R²优选为碳原子数1至20的任选被取代的烷基、任选被取代的芳 烷基或任选被取代的芳基，更优选为碳原子数1至10的任选被取代的烷基、 任选被取代的芳烷基或任选被取代的芳基。

作为芳基，可以列举苯基、萘基、吡啶基、噻吩基、二唑基、咪唑基、 噻唑基、呋喃基、吡咯基、苯氧基、萘氧基、吡啶基氧基、噻吩基氧基、二唑基氧基、咪唑基氧基、噻唑基氧基、呋喃基氧基、吡咯基氧基等。作为 烷基，可以列举甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、仲丁基、 叔丁基、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基 羰基、乙烯基、烯丙基、环戊基、环己基、环庚基等。作为芳烷基，可以列 举苄基等。

这些基团还可以被进一步被取代，作为其取代基，可以列举卤素原子、 氮原子、硫原子、羟基、硝基、氰基、甲氧基、乙氧基、羧基、羧甲基、羧 乙基或亚甲二氧基等。另外，环的形成也可以经由取代基。

作为上述酮化合物的具体的化合物，例如，可以列举1-四氢萘酮、2- 四氢萘酮、5-甲氧基-2-四氢萘酮、6-甲氧基-2-四氢萘酮、7-甲氧基-2-四氢萘 酮、8-甲氧基-2-四氢萘酮、1-苄基-3-吡咯烷酮、1-Boc-3-吡咯烷酮、1-Cbz-3- 吡咯烷酮、1-苄基-3-哌啶酮、1-Boc-3-哌啶酮、1-Cbz-3-哌啶酮、苯乙酮、3,4- 二甲氧基苯基丙酮等。

(氨基供体)

作为氨基供体，只要是本发明多肽作用的胺化合物能够使用任何胺化合 物。作为具体例，可以列举1-苯乙胺、2-丁基胺、2-戊基胺、2-庚基胺、3- 庚基胺、正乙基胺、正丙基胺、正丁基胺、正戊基胺、异丙基胺、异丁基胺、 甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、3-氨基-1-苯基丁烷、苯甲胺、β-苯乙胺、环己胺 和它们的光学活性体。其中，1-苯乙胺特别廉价且，在溶解度高的方面优选 谷氨酸。

(多肽的形态)

在制造方法I中，在氨基供体的存在下，使上述本发明多肽或具有该多 肽生成能力的微生物的培养物与上述酮化合物作用。

其中，“培养物”是指含有菌体的培养液、培养菌体或其处理物。其中， “其处理物”是指例如为无细胞提取液、冷冻干燥菌体、丙酮干燥菌体或这 些菌体的磨碎物等。另外，这些多肽和培养物也能够以通过公知的方法固定 化了的多肽或固定化菌体的形态使用。固定化能够用对于本领域技术人员公 知的方法(例如交联法、物理吸附法、包埋法等)进行。

(反应平衡、由产物抑制的消除带来的反应性的改善)

使用氨基转移反应的氨基化反应一般为可逆反应，因此一般在平衡点表 观上反应停止。通过组合消除这些反应平衡的公知的方法能够改善使用了本 发明多肽的反应。

例如，有效的方法为如WO2007/139055A所记载，使用丙氨酸作为氨基 供体，使乳酸脱氢酶和辅酶再生用的葡萄糖脱氢酶共同作用于副生成的丙酮 酸，由此转换为不与氨基转移酶发生作用的乳酸，从而消除反应平衡。同样 地使用丙氨酸作为氨基供体，用丙酮酸脱羧酶将副生成的丙酮酸除去的方法 (WO2007/093372A1)、使用丙氨酸脱氢酶的方法(US2009/0117627A1,Evonik  Degussa GmbH)、用过氧化氢除去的方法(US2008/0213845A1)、使用乙酰丁 酸合成酶的方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.72(11),3030-3033(2008))等也 是有效的。

或者，使用谷氨酸作为氨基供体，使扁桃酸脱氢酶或羟基异己酸脱氢酶 和辅酶再生用的葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶共同作用于副生成的2-氧代戊 二酸，由此转换为不与氨基转移酶作用的2-羟基戊二酸，消除反应平衡的方 法是有效的。同样地，使用谷氨酸作为氨基供体，使谷氨酸脱氢酶和辅酶再 生用葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶共同作用于副生成的2-氧代戊二酸，由此转 换为谷氨酸，消除反应平衡的方法是有效的。

另外，不仅反应平衡，这些方法对于由从氨基供体副生成的酮化合物造 成的产物抑制的消除也是有效的手段。

(底物浓度)

作为反应中使用的底物的浓度，酮化合物在反应液组成中为0.1～80重 量%，优选为1～50重量%，另外，氨基供体在手性胺时，优选相对于酮化合 物，以80～1200摩尔%、优选为100～600摩尔%的浓度的方式使用。此外， 作为上述氨基供体为外消旋体的氨基化合物时，也能够使一种立体构型(一 方の立体)为上述的浓度的方式使用。

(反应pH)

使本发明多肽作用时的pH，从多肽的最适pH的观点考虑，下限优选为 pH6.0以上，更优选为pH7.0以上，上限优选为pH9.0以下，更优选为pH8.0 以下。使多个多肽(酶)共同作用时优选选择使用的全部酶稳定且高活性地作 用的pH。

(反应温度)

使本发明多肽作用时的温度，从多肽的最适温度和热稳定性的观点考 虑，优选为25℃以上，更优选为30℃以上，优选为60℃以下，更优选为50℃ 以下。使多个多肽(酶)共同作用时优选选择使用的全部酶稳定且高活性地作 用的反应温度。

(溶剂)

反应溶剂，通常使用离子交换水、缓冲液等水性介质，但在含有有机溶 剂的体系中也能够进行反应。作为有机溶剂，例如，能够适合使用甲醇、乙 醇、丙醇、异丙醇、丁醇等醇类溶剂，戊烷、己烷等脂肪族烃类溶剂，苯、 甲苯等芳香族烃类溶剂，二氯甲烷、氯仿等卤化烃类溶剂，二乙醚、二异丙 醚等醚类溶剂，乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯类溶剂，丙酮、甲乙酮等酮类溶剂， 其他、乙腈等。

(二相系)

根据需要，也能够以在水中的溶解度以上加入上述的有机溶剂在二相系 中进行反应。通过使有机溶剂在反应体系中共存，提高选择率、转换率、收 率等的情况较多。

(反应时间)

反应，通常为1小时～1周，优选为1～72小时，优选选择以上述这样的 时间反应结束的反应条件。

(提取纯化)

通过上述的反应，生成光学活性氨基化合物。生成的光学活性氨基化合 物能够通过提取、蒸馏、重结晶、柱分离等公知的方法从反应混合液中分离。

例如，将pH调节为酸性后，通过二乙醚、二异丙醚等醚类溶剂，乙酸 乙酯、乙酸丁酯等酯类溶剂，己烷、辛烷、苯等烃类溶剂，二氯甲烷等卤化 烃类溶剂等一般的溶剂，能够将生成的光学活性氨基化合物保持残留在水 相，选择性地除去未反应的底物和由氨基转移反应生成的与氨基供体对应的 酮化合物。生成的光学活性氨基化合物和未反应的氨基供体，例如，将pH 调节为碱性，能够同样地用一般的有机溶剂提取。生成的光学活性氨基化合 物和未反应的氨基供体，例如能够通过蒸馏分离。

接着，说明本发明的制造方法II。

(制造方法II)

本制造方法为在氨基受体的存在下，使本发明多肽或具有本发明多肽生 产能力的转化体的培养物与氨基化合物的对映体混合物作用的光学活性氨 基化合物的制造方法。

本制造方法，例如，通过在氨基受体的存在下，使上述多肽或具有该多 肽产生能力的微生物的培养物与通式(3)所示的氨基化合物的对映体混合物 作用，能够得到通式(4)所示的光学活性氨基化合物。

通式(3)：

通式(4)：

上述式(3)和(4)中的R¹、R²与上述式(1)和(2)中的R¹、R²相同。

作为上述光学活性氨基化合物的具体的化合物，例如，可以列举1-氨基 1,2,3,4-四氢化萘、2-氨基1,2,3,4-四氢化萘、5-甲氧基-2-氨基1,2,3,4-四氢化 萘、6-甲氧基-2-氨基1,2,3,4-四氢化萘、7-甲氧基-2-氨基1,2,3,4-四氢化萘、 8-甲氧基-2-氨基1,2,3,4-四氢化萘、1-苄基-3-氨基吡咯烷、1-Boc-3-氨基吡咯 烷、1-Cbz-3-氨基吡咯烷、1-苄基-3-氨基哌啶、1-Boc-3-氨基哌啶、1-Cbz-3- 氨基哌啶、1-苯乙胺、3,4-二甲氧基苯异丙胺等。

(氨基受体)

在本方法中，使用酮化合物作为氨基受体。作为该酮化合物，只要是具 有作为氨基受体的活性则任何酮化合物都可以，但优选为2-氧代戊二酸或乙 醛酸。

在制造方法II中，在上述氨基受体的存在下，使上述本发明多肽或具有 该多肽的生成能力的转化体的培养物与氨基化合物的对映体混合物作用。

其中，氨基化合物的对映体混合物表示对映体和其镜像体的混合物。通 常，外消旋体廉价且易于获得，优选使用外消旋体。但是，不限于外消旋体， 例如，能够优选进行使用对映体比其镜像体略微过剩包含的混合物，通过制 造方法II，提高其光学纯度的方法。

此外，培养物的意思与上述的制造方法I的情况相同。

另外，氨基化合物的浓度，在反应液组成中为0.1～80重量%，优选为 1～50重量%。氨基受体的浓度，相对于氨基化合物，以30～100摩尔%使用， 优选以50～60摩尔%使用。反应pH、反应温度、反应溶剂能够使用与制造 方法I相同的条件。

通过上述的反应，生成光学活性氨基化合物。生成的光学活性氨基化合 物能够用与制造方法I相同的方法从反应混合液中分离。

实施例

以下，通过实施例更加详细的说明本发明，但本发明不受这些实施例任 何限定。

(实施例1)来自节杆菌属菌种(Arthrobacter sp.)KNK04-25的具有氨基转 移活性的多肽的获得、纯化

从土壤中分离以(S)-1-苯乙胺作为氨基供体对1-苄基-3-吡咯烷酮进行氨 基化的微生物即节杆菌属菌种(Arthrobacter sp.)KNK04-25(NITE BP-954)。进 行了具有催化上述反应的氨基转移活性的多肽的纯化、其结构基因的克隆、 和含有结构基因的重组载体的构建。以下，将本多肽记为TAT。

(氨基转移活性测定方法)

在酶液0.2mL中添加具有下述组成的底物溶液0.8mL，在30℃使其反 应60分钟后，添加6当量盐酸50μL添加使反应停止。通过下述条件利用高 效液相色谱分析该反应液，对生成的苯乙酮进行定量。在本反应条件中，将 1分钟生成1μmol的苯乙酮的活性定义为1U。

[底物溶液组成]

[利用高效液相色谱的测定条件]

色谱柱：Cosmosil5C8-MS(Nacalai Tesque株式会社制)

洗脱液：蒸馏水2000mL/乙腈500mL/甲醇500ml/KH₂PO₄6.1g/H₃PO₄2.5g

流速：1mL/分钟

检测：254nm

柱温：30℃

将上述节杆菌属菌种(Arthrobacter sp.)KNK04-25在大试验管接种于 5mL的2YT培养基(组成：16g/L胰蛋白胨(Becton Dickinson公司制)、10g/L 酵母浸膏(Becton Dickinson公司制)、5g/L NaCl(pH7.0))，在30℃培养1天， 得到预培养液。

然后，在5升容积小罐(mini jar)中的3.0L的N培养基(组成：5g/L多聚 蛋白胨(日本制药株式会社制)、3g/L D-葡萄糖、2g/L NaCl、0.2g/L酵母浸 膏(Becton Dickinson公司制)、6滴Adekanol LG-109(日本油脂制)、0.5g/L (S)-1-苯乙胺(pH7.0))中，接种所得到的预培养液，在通气量0.3vvm、搅拌转 速350rpm、30℃培养了27小时。

接着，通过离心分离从培养液收集菌体，悬浊于含有0.5mM二硫苏糖 醇、0.5mM吡哆醛磷酸、0.1mM苯基甲基磺酰氟的10mM磷酸缓冲液 (pH7.0)。利用超声波破碎破碎所得到的悬浊液。然后，利用离心分离除去该 破碎物中的固形物，制备无细胞提取液。

将所得到的无细胞提取液在60℃保持30分钟，然后利用离心分离除去 生成的沉淀。在其上清中添加硫酸铵达到40%饱和，使其溶解，接着利用离 心分离除去生成的沉淀。在其上清中添加硫酸铵达到70%饱和，使其溶解， 接着利用离心分离回收所生成的沉淀。

使该沉淀溶解在含有0.5mM二硫苏糖醇、0.5mM吡哆醛磷酸、0.1mM 苯基甲基磺酰氟的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，再对该缓冲液进行透析。 将其供给用相同缓冲液平衡化的TOYOPEARL DEAE-650M(东曹株式会社 制)柱(90mL)，使活性组分吸附。用相同缓冲液将柱清洗后，用氯化钠的线 性梯度(从0.1M到0.5M)使活性组分洗脱。

收集所洗脱的活性组分，在其中溶解硫酸铵使其终浓度为1.5M，供给 至用含有1.5M硫酸铵、0.5mM二硫苏糖醇、0.5mM吡哆醛磷酸、0.1mM苯 基甲基磺酰氟的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)预先平衡化的TOYOPEARL  Butyl-650S(东曹株式会社制)柱(20mL)，使活性组分吸附。用相同缓冲液将 柱清洗后，用硫酸铵的线性梯度(从1.0M到0.4M)使活性组分洗脱。收集活 性组分，使用PD-10柱(GE Healthcare Japan株式会社制)，对含有0.5mM二 硫苏糖醇、0.5mM吡哆醛磷酸、0.1mM苯基甲基磺酰氟的10mM磷酸缓冲 液(pH7.0)进行缓冲液交换，得到电泳上大致单一的纯化酶标准品。

(实施例2)TAT基因的克隆

(PCR引物的制作)

通过PPSQ-33A型全自动蛋白质一级结构分析机(岛津制作所株式会社 制)确定实施例1中得到的纯化TAT的N末端氨基酸序列。另外，使上述中 得到的纯化TAT在8M尿素存在下变性后，用来自无色杆菌的赖氨酰基内 肽酶(和光纯药工业株式会社制)消化，用与N末端氨基酸序列同样的方法确 定所得到的肽片段的氨基酸序列。考虑从该氨基酸序列预测的碱基序列，合 成用于通过PCR扩增TAT基因的一部分的引物1(序列表的序列编号3)和引 物2(序列表的序列编号4)。

(通过PCR进行TAT基因的扩增)

从上述节杆菌属菌种(Arthrobacter sp.)KNK04-25的培养液中，按照 Ausubel等的方法(Current Protocols in Molecular Biology,1987)中记载的方法 提取染色体DNA。以所得到的染色体DNA为模板，使用上述合成的引物1 和2进行PCR。其结果，获得可以认为是基因的一部分的约450bp的DNA 片段。PCR中，作为DNA聚合酶使用TaKaRa Ex Taq(Takara Bio株式会社 制)进行，反应条件按照其操作说明书。

对于该DNA片段，使用ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing  Ready Reaction Kit(Applied Biosystems公司制)和ABI3100DNA Sequencer(Applied Biosystems公司制)确定其碱基序列。其碱基序列如序列表 的序列编号5所示。

(通过inverse-PCR法进行的TAT基因的全长序列的确定)

使用限制酶AatII、ApaLI或PstI完全消化上述得到的节杆菌属菌种 KNK04-25的染色体DNA，使用T4DNA连接酶(Takara Bio株式会社制)使 所得到的消化物分别分子内环化。将其用作模板，基于在上述明确的TAT 基因的部分碱基序列信息，通过inverse-PCR法(Nucl.Acids Res.,16,8186 (1988))确定染色体DNA上的TAT基因的全碱基序列。PCR使用TaKaRa LA  Taq HS(Takara Bio株式会社制)进行，反应条件按照其操作说明书。确定得 到的碱基序列如序列表的序列编号2所示。另外，编码该碱基序列的氨基酸 序列如序列表的序列编号1所示。

(实施例3)含有TAT基因的重组质粒的制作

基于实施例2中确定的碱基序列，合成在TAT基因的起始密码子部分 添加了NdeI部位的引物3(序列表的序列编号6)和在紧接着TAT基因的终始 密码子的后面添加了EcoRI部位的引物4(序列表的序列编号7)。以实施例2 中得到的节杆菌属菌种KNK04-25的染色体DNA作为模板，使用这些引物 进行PCR，获得在TAT基因的起始密码子部分添加了NdeI部位且在紧接着 终始密码子后添加了EcoRI部位的双链DNA。PCR使用PrimeSTAR  HS(Takara Bio株式会社制)进行，反应条件按照其操作说明书。用NdeI和 EcoRI消化该DNA，插入在质粒pUCNT(WO94/03613)的lac启动子的下游 的NdeI识别部位和EcoRI识别部位之间，得到重组载体pNTTAT。

(实施例4)重组大肠杆菌的制作

使用实施例3中得到的重组质粒pNTTAT，转化大肠杆菌E.coli  HB101(Takara Bio株式会社制)，得到重组大肠杆菌E.coli HB101(pNTTAT)。 作为比较例，使用上述质粒pUCNT，转化大肠杆菌E.coli HB101(Takara Bio 株式会社制)，得到重组大肠杆菌E.coli HB101(pUCNT)。

(实施例5)使用了重组大肠杆菌的TAT基因的表达

将实施例4中得到的转化体E.coli HB101(pNTTAT)和作为比较例的E. coli HB101(pUCNT)在含有200μg/ml的氨苄青霉素的2YT培养基(组成： 16g/L胰蛋白胨(Becton Dickinson公司制)、10g/L酵母浸膏(Becton  Dickinson公司制)、5g/L NaCl(pH7.0))中培养，集菌后，在100mM磷酸缓 冲液(pH7.0)中悬浊，超声波破碎后，通过离心分离除去菌体残渣，得到无细 胞提取液。

通过以实施例1所示的(S)-1-苯乙胺和2-氧代戊二酸作为底物的活性测 定法测定该无细胞提取液的转氨酶活性。其结果，在E.coli HB101(pNTTAT) 的无细胞提取液中，观察到了5.0U/ml的活性。在E.coli HB101(pUCNT)的 无细胞提取液中未观察到活性。

(实施例6)TAT的理化学性质1

使用实施例5中得到的无细胞提取液，对于TAT相对于1-苄基-3-吡咯 烷酮的活性和生成(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的光学纯度进行研究。

(相对于1-苄基-3-吡咯烷酮的活性和生成(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的光 学纯度测定方法)

研究催化与光学活性(S)-1-苯乙胺和1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成苯乙酮 和(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的氨基转移反应的活性。在实施例5中得到的无 细胞提取液中，以最终浓度达到下述底物溶液组成的方式添加各试剂。在 30℃使其反应2小时后，用下述条件的HPLC分析反应液。

其结果，以转换率100%生成(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷，其光学纯度为 100%e.e.。

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱的测定条件]

<定量分析>

色谱柱：Finepak SIL C18-T(日本分光株式会社制)

洗脱液：蒸馏水945mL/乙腈555mL/KH₂PO₄7.5g/SDS2.16g(用H₃PO₄调制为pH3.6)

流速：1mL/分钟

检测：254nm

柱温：40℃

<光学纯度分析>

将反应液用适量的碳酸钠调制为碱性后，用二硝基苯甲酰氯进行衍生物 化，然后用以下的条件进行分析。

色谱柱：Chiralpak IA(Daicel化学工业株式会社制)

洗脱液：己烷/乙醇/二乙胺/乙腈＝800/200/1/5(体积比)

流速：0.8mL/分钟

检测：254nm

柱温：30℃

(实施例7)TAT的理化学性质2

使用实施例5中得到的无细胞提取液，对于TAT的氨基转移活性，通 过以实施例1所示的(S)-1-苯乙胺和2-氧代戊二酸作为底物的活性测定法进 行测定。

(1)最适pH：

在pH4.0～10的范围、与上述同样操作测定氨基转移活性，研究TAT的 最适pH(其中，对应测定的pH缓冲液使用下述的缓冲液)。其结果，在pH7 的反应活性最高，将pH7.0设为100时的相对活性显示70以上的值的pH为 pH7.0和pH8.0。

[缓冲液]

pH4.0、5.0的情况：0.1M乙酸钠缓冲液

pH6.0、7.0的情况：0.1M磷酸钾缓冲液

pH8.0的情况：0.1M Tris-盐酸缓冲液

pH9.0、10的情况：0.1M碳酸钠缓冲液

(2)最适温度：

在温度30、40、50、60、70℃的范围，与上述的活性测定方法同样地 测定氨基转移活性，研究TAT的最适温度。其结果，在40℃的反应活性最 高，将40℃设为100时的相对活性显示70以上的值的温度为30、40、50℃。

(3)热稳定性：

将酶液在0.5mM吡哆醛磷酸、0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)中，在温度30、 40、50、60、70℃处理30分钟后，以上述的活性测定方法测定氨基转移活 性，研究TAT的热稳定性。其结果，将处理前设为100时的相对活性显示 70以上的值的温度为30、40、50℃。

(实施例8)TAT的理化学性质3

使用实施例5中得到的无细胞提取液，研究TAT的分子量。

使用10%聚丙烯酰胺凝胶(ATTO公司制)，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯 酰胺凝胶电泳法。作为标准蛋白质使用Perfect Protein Markers(Novagen公司 制)，与该标准蛋白质的迁移率比较，算出TAT的分子量约为48kDa。

(实施例9)TAT的理化学性质4：氨基供体特异性

使用实施例5中得到的无细胞提取液，研究TAT相对于氨基供体的底 物特异性。

在酶液100μL中以最终浓度为下述底物溶液组成的方式添加各试剂，以 0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)将反应液的体积配制为400μL。在30℃使其反应 60分钟后，加入3当量盐酸20μL使反应停止。然后，在所得到的反应液20μL 中分别加入0.2M碳酸钠水溶液80μL、3.3mg/mL丹酰氯的丙酮溶液200μL， 在70℃使其反应10分钟。在该反应液50μL中加入乙酸20μL并进行搅拌， 通过下述条件利用高效液相色谱分析，对丹酰化的谷氨酸进行定量。其中， 在本测定方法中，将使用的酶的活性调整为生成谷氨酸量为2.8mM以下。

其结果为将使用苯甲胺作为氨基供体时的活性设为100时的相对活性 并表示在表1中。如表1所示，对于苯甲胺、±2-丁基胺、正丁基胺显示了 活性。

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱的测定条件]

色谱柱：Cosmosil5C8-MS(Nacalai Tesque株式会社制)

洗脱液：蒸馏水2000mL/乙腈500mL/甲醇500ml/KH₂PO₄6.1g/H₃PO₄2.5g

流速：1mL/分钟

检测：254nm

柱温：30℃

[表1]

氨基供体 相对活性(%) 苯甲胺 100 ±2-丁基胺 7 正丁基胺 4

(实施例10)TAT的理化学性质5：氨基供体特异性2

使用实施例5中得到的无细胞提取液，对于TAT研究相对于代表性的ω- 氨基酸转氨酶的底物的反应性。

在酶液100μL中以最终浓度为下述底物溶液组成的方式添加各试剂，用 0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)将反应液的体积配制为400μL。在30℃使其反应 60分钟后，加入3当量盐酸20μL使反应停止。然后，在所得到的反应液20μL 中分别加入0.2M碳酸钠水溶液80μL、3.3mg/mL丹酰氯的丙酮溶液200μL， 在70℃使其反应10分钟。在该反应液50μL中加入乙酸20μL并搅拌，通过 下述条件利用高效液相色谱分析，对丹酰化的谷氨酸进行定量。其中，在本 测定方法中，调整使用的酶的活性使得生成谷氨酸量为2.8mM以下。

其结果为将使用(S)-1-苯乙胺作为氨基供体时的活性设为100时的相对 活性并表示在表2中。如表2所示，本多肽对于β-丙氨酸、4-氨基丁酸、5- 氨基戊酸、6-氨基己酸、±2,4-二氨基丁酸、L-鸟氨酸、L-赖氨酸和腐胺不显 示活性。

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱的测定条件]

色谱柱：YMC-Pack Pro C18RS(YMC公司制)

洗脱液：乙腈/45mM乙酸缓冲液(pH4.1)＝35/65(体积比)

流速：0.9mL/分钟

检测：254nm

柱温：30℃

[表2]

氨基供体 相对活性(%) (S)-α-苯乙胺 100 β-丙氨酸 0 4-氨基丁酸 0 5-氨基戊酸 0 6-氨基己酸 0 ±2,4-二氨基丁酸·HCl 0 L-鸟氨酸·HCl 0 L-赖氨酸·HCl 0 腐胺·2HCl 0

(实施例11)TAT的理化学性质6：氨基供体特异性3

使用实施例5中得到的无细胞提取液，研究TAT相对于氨基供体的底 物特异性。在酶液200μL中以最终浓度为下述底物溶液组成的方式添加各试 剂，用0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)将反应液的体积配制为400μL。在30℃使 其反应90分钟反应后，加入6当量盐酸15μL使反应停止。然后，通过下述 条件利用高效液相色谱分析生成得到反应液。

其结果为将使用L-丙氨酸作为氨基供体时的活性设为100时的相对活 性并表示于表3。如表3所示，相比于L-丙氨酸对L-谷氨酸显示更高的活性。

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱的定量分析条件]

<定量分析>

色谱柱：Finepak SIL C18-T(日本分光株式会社制)

洗脱液：蒸馏水945mL/乙腈555mL/KH₂PO₄7.5g/SDS2.16g(用H₃PO₄调制为pH3.6)

流速：1mL/分钟

检测：254nm

柱温：40℃

<光学纯度分析>

将反应液用适量的碳酸钠设为碱性后，用二硝基苯甲酰氯进行衍生物 化，然后用以下的条件分析。

色谱柱：Chiralcel IA(Daicel化学工业株式会社制)

洗脱液：己烷/乙醇/二乙胺/乙腈＝800/200/1/5(体积比)

流速：0.8mL/分钟

检测：254nm

柱温：30℃

[表3]

氨基供体 相对活性(%) L-谷氨酸 1650 L-丙氨酸 100

(实施例12)TAT的理化学性质7：氨基受体特异性

使用实施例5中得到的无细胞提取液，研究TAT相对于氨基受体的底 物特异性。

在酶液100μL以最终浓度为下述底物溶液组成的方式添加各试剂，用 0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)将反应液的体积配制为400μL。在30℃使其反应 60分钟后，添加6当量盐酸50μL使反应停止。通过下述条件利用高效液相 色谱分析该反应液，对生成的苯乙酮进行定量。

其结果为将使用2-氧代戊二酸作为氨基受体时的活性设为100时的相对 活性并表示在表4中。如表4所示，对于2-氧代戊二酸显示高的活性，对于 乙醛酸、丙酮酸也显示活性。

[底物溶液组成]

[通过高效液相色谱的测定条件]

色谱柱：Cosmosil5C8-MS(Nacalai Tesque株式会社制)

洗脱液：蒸馏水2000mL/乙腈500mL/甲醇500ml/KH₂PO₄6.1g/H₃PO₄2.5g

流速：1mL/分钟

检测：254nm

柱温：30℃

[表4]

氨基受体 相对活性(%) 2-氧代戊二酸 100 乙醛酸 40 丙酮酸 10 苯基丙酮酸 8 草酰乙酸 4 2-氧代丁酸 5 2-氧代正戊酸 3 丙酮 0 2-丁酮 0 2-戊酮 1 3-戊酮 1 2-己酮 4 2-庚酮 3 3-庚酮 5 苄基苯基酮 0 丁醛 6 苯甲醛 70 7-甲氧基-2-四氢萘酮 0 α-氰基苯乙酮 0 2-乙酰基吡啶 60 1-苄基-3-吡咯烷酮 20 3-氧代戊腈 0 3-氧代戊酸甲酯 4 3-氧代己酸甲酯 4 乙酰乙酸乙酯 2 4-羟基丁烷-2-酮 0 奎宁环酮 0 1-四氢萘酮 1 2-四氢萘酮 1

(实施例13)来自副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)JCM1181的D-羟基异己酸脱氢酶基因(RLC)的克隆

从副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)JCM1181，将作为α-酮酸还原酶之一的D-羟基异己酸脱氢酶(以下 简称为RLC)的基因用以下的方法克隆。该副干酪乳杆菌副干酪亚种 (Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)JCM1181株本领域技术人员能够从 独立行政法人理化学研究所生物资源中心(〒351-0198埼玉县和光市广泽 2-1)获得。该RLC为本发明的“α-酮酸还原酶(β)”的一个实施例。

(PCR引物的制作)

以基因数据库中注册的已知的D-羟基异己酸脱氢酶的基因序列信息 (Genebank M26929)为参考，合成在RLC基因的起始密码子部分添加了NdeI 部位的引物5(序列表的序列编号8)和在紧接着RLC基因的终始密码子的后 面添加了KpnI部位的引物6(序列表的序列编号9)。另外，为了破坏在RLC 基因内部中存在的NdeI部位，合成将第165位的A取代为G的引物7(序列 表的序列编号10)和8(序列表的序列编号11)。

(通过PCR进行RLC基因的扩增)

从上述副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)JCM1181的培养液中，按照Ausubel等的方法(Current Protocols in  Molecular Biology,1987)中记载的方法提取染色体DNA。以所得到的染色体 DNA作为模板，使用上述合成的引物5和7进行PCR。其结果，获得可以 认为是基因的一部分的约200bp的DNA片段。另外，使用引物6和8进行 PCR。其结果，获得可以认为是基因的一部分的约1800bp的DNA片段。然 后，将上述PCR片段的2种按照QIAquick PCR purification Kit(QIAGEN公 司)的操作说明书纯化，并进行混合实施PCR。其结果，在全长基因中添加 限制酶部位，获得可以认为是破坏了NdeI部位的约2000bp的DNA片段。 PCR使用TaKaRa PrimeSTAR(Takara Bio株式会社制)作为DNA聚合物，反 应条件按照其操作说明书进行。

对于该DNA片段，使用ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing  Ready Reaction Kit(Applied Biosystems公司制)和ABI3100DNA  Sequencer(Applied Biosystems公司制)确定其碱基序列。将其碱基序列如序列 表的序列编号12所示。

(实施例14)含有RLC基因的重组质粒的制作

将实施例13中得到的PCR片段作为模板，使用上述引物5(序列表的序 列编号8)和引物6(序列表的序列编号9)进行PCR，获得在RLC基因的起始 密码子部分添加NdeI部位、在紧接着终始密码子的后面添加KpnI部位、且 破坏了RLC基因内部的NdeI部位的双链DNA。PCR使用PrimeSTAR(Takara  Bio株式会社制)进行，反应条件按照其操作说明书。将该DNA用NdeI和 KpnI消化，插入到质粒pUCNT(WO94/03613)的lac启动子的下游的NdeI识 别部位和KpnI识别部位之间，得到了重组载体pNTLC。

(实施例15)表达RLC的重组大肠杆菌的制作

使用实施例14中制得的重组质粒pNTLC，转化大肠杆菌E.coli  HB101(Takara Bio株式会社制)，得到重组大肠杆菌E.coli HB101(pNTLC)。

将上述的转化体E.coli HB101(pNTLC)用含有200μg/ml的氨苄青霉素 的2YT培养基(组成：16g/L胰蛋白胨(Becton Dickinson公司制)、10g/L酵 母浸膏(Becton Dickinson公司制)、5g/L NaCl(pH7.0))培养，集菌后，悬浊于 100mM磷酸缓冲液(pH7.0)，超声波破碎后，通过离心分离除去菌体残渣， 得到无细胞提取液。

在100mM磷酸缓冲液(pH6.5)中以2-氧代戊二酸终浓度为20mM、辅酶 NADH终浓度为0.25mM的方式制备的溶液中添加该无细胞提取液，从在 30℃反应1分钟时的该反应液在波长340nm处的吸光度的减少速度算出。 将在本反应条件下，以1分钟将1μmol的NADH氧化为NAD+的活性定义 为1U。

其结果，在E.coli HB101(pNTLC)的无细胞提取液中，观察到了30U/ml 的活性。

(实施例16)利用制造方法I的光学活性1-苄基-3-氨基吡咯烷的制造

研究催化将L-谷氨酸和1-苄基-3-吡咯烷酮作为底物生成(S)-1-苄基-3- 氨基吡咯烷的氨基转移反应的活性。

反应(1)

以最终浓度为TAT5U/mL的方式制备实施例5中得到的TAT多肽无细 胞提取液，在该酶液中以最终浓度为下述底物溶液组成1的方式添加各试 剂。在30℃使其反应2小时后，用下述条件的HPLC分析反应液。

反应(2)

将实施例5中得到的TAT多肽无细胞提取液、实施例15中得到的RLC 酶无细胞提取液和市售葡萄糖脱氢酶(天野Enzyme株式会社制)以最终浓度 为TAT5U/mL、RLC2U/mL、市售葡萄糖脱氢酶8U/mL的方式混合，在该 酶液中以最终浓度为下述底物溶液组成2的方式添加各试剂。在30℃使其 反应2小时后，用下述条件的HPLC分析反应液。

其结果为将反应(1)中生成的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷量设为100时的相 对生成量并表示在表5中。如表5所示，使RLC酶和谷氨酸脱氢酶共同作 用于TAT多肽时(反应(2))，显示反应(1)的约2倍的生成量。

[底物溶液组成1]

[底物溶液组成2]

[通过高效液相色谱的测定条件]

<定量分析>

色谱柱：Finepak SIL C18-T(日本分光株式会社制)

洗脱液：蒸馏水945mL/乙腈555mL/KH₂PO₄7.5g/SDS2.16g(用H₃PO₄调制为pH3.6)

流速：1mL/分钟

检测：254nm

柱温：40℃

[表5]

反应 相对生成量(%) 反应(1) 100 反应(2) 230

(实施例17)利用制造方法I的光学活性1-苄基-3-氨基吡咯烷的制造2

将实施例4中得到的E.coli HB101(pNTTAT)株用含有200μg/ml的氨苄 青霉素的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6%、酵母浸膏1.0%、NaCl0.5%、pH7.0) 培养，进行集菌。另外，将实施例15中得到的E.coli HB101(pNTLC)株用 含有200μg/ml的氨苄青霉素的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6%、酵母浸膏1.0%、 NaCl0.5%、pH7.0)培养，进行集菌。

在加入有作为底物的1-苄基-3-吡咯烷酮150mg、L-谷氨酸钠1.6g、D- 葡萄糖150mg、NADH6mg的烧瓶中，混合上述菌体悬浊液和市售葡萄糖脱 氢酶(天野Enzyme株式会社制)使得最终浓度为TAT5U/mL、RLC2U/mL、 市售葡萄糖脱氢酶8U/mL，加入吡哆醛磷酸2mg、1M磷酸钾缓冲液 (pH7.5)1.5mL，加入去离子水使总体积为30mL。将其在30℃边用氢氧化钠 调节为pH7.5边搅拌24小时使其反应。反应结束后，利用下述条件通过HPLC 分析反应液。

其结果，以转换率36%生成了1-苄基-3-氨基吡咯烷。其立体配置为(S) 体，光学纯度为99%e.e.。

[通过高效液相色谱的定量分析条件]

<定量分析>

色谱柱：Finepak SIL C18-T(日本分光株式会社制)

洗脱液：蒸馏水945mL/乙腈555mL/KH₂PO₄7.5g/SDS2.16g(用H₃PO₄调制为pH3.6)

流速：1mL/分钟

检测：254nm

柱温：40℃

<光学纯度分析>

用适量的碳酸钠使反应液为碱性后，用二硝基苯甲酰氯进行衍生物化， 然后用以下的条件分析。

色谱柱：Chiralcel IA(Daicel化学工业株式会社制)

洗脱液：己烷/乙醇/二乙胺/乙腈＝800/200/1/5(体积比)

流速：0.8mL/分钟

检测：254nm

柱温：30℃

(实施例18)利用制造方法I的光学活性1-苄基-3-氨基吡咯烷的制造3

将实施例4中得到的E.coli HB101(pTTAT)用含有200μg/ml的氨苄青霉 素的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6%、酵母浸膏1.0%、NaCl0.5%、pH7.0)培养， 进行集菌。

在加入有作为底物的1-苄基-3-吡咯烷酮150mg、L-谷氨酸钠1.6g、磷酸 二铵110mg、D-葡萄糖150mg、NADH6mg的烧瓶中，混合上述菌体悬浊 液使得最终浓度为TAT5U/mL、市售谷氨酸脱氢酶(mpbio社)2U/mL、市售 葡萄糖脱氢酶(天野Enzyme株式会社制)3U/mL，加入吡哆醛磷酸2mg、1M 磷酸钾缓冲液(pH7.5)1.5mL，加入去离子水使总体积为30mL。将其在30℃ 边用氢氧化钠调节为pH7.5边搅拌24小时使其反应。反应结束后，利用下 述条件通过HPLC分析反应液。

其结果，以转换率35%生成了1-苄基-3-氨基吡咯烷。其立体配置为(S) 体，光学纯度为99%e.e.。

[通过高效液相色谱的定量分析条件]

<定量分析>

色谱柱：Finepak SIL C18-T(日本分光株式会社制)

洗脱液：蒸馏水945mL/乙腈555mL/KH₂PO₄7.5g/SDS2.16g(用H₃PO₄调制为pH3.6)

流速：1mL/分钟

检测：254nm

柱温：40℃

<光学纯度分析>

用适量的碳酸钠使反应液为碱性后，用二硝基苯甲酰氯进行衍生物化， 然后用以下的条件分析。

色谱柱：Chiralcel IA(Daicel化学工业株式会社制)

洗脱液：己烷/乙醇/二乙胺/乙腈＝800/200/1/5(体积比)

流速：0.8mL/分钟

检测：254nm

柱温：30℃

在本说明书中引用的全部发行物、专利和专利申请均直接作为参考编入 本说明书。

PCT/RO/134表