基于硝基还原检测细胞内硫化氢的荧光探针及其应用

摘要

本发明涉及用于检测硫化氢（H

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测硫化氢（H₂S）的荧光探针，具体地说是一种基于硝基还原检测细胞内硫化氢的荧光探针及其应用。 

背景技术

几个世纪以来，硫化氢（H₂S）在对环境毒性和毒害影响方面已经引起了很多的注意。当人体暴露于外源性硫化氢之中时，此气体可以通过肺部被迅速地吸收从而进入血液循环系统，然后在人体中产生毒害作用。现在普遍认为硫化物以氰化物类似的方式抑制氧化酶而产生生理毒性。然而最近有关生命体内源性H₂S的研究工作都致力于其若干生理功能。继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后，H₂S被确定为第三个具有生物活性的气体，被称为气体递质或气体介体。H₂S广泛分布于全身各处，据估计其生理相关浓度的范围从纳摩尔级到毫摩尔级水平不等。在生理浓度水平下，硫化氢参与一系列的生理过程，包括调节血管张力、心肌收缩、神经传导、胰岛素分泌等。一旦细胞不能维持其硫化氢的生理范围内水平，便会引起动脉和肺动脉高压、阿尔茨海默氏症、胃粘膜损伤、肝硬化等疾病。此外，硫化氢也表现为用作活性氧物种和活性氮物种的抗氧化清除剂。此外许多研究还显示出三个气体递质，H₂S、NO和CO，之间还有各种交互作用指示着人体的健康与疾病。因此，近年来对生物体内源性硫化氢的研究兴趣也稳步增长方兴未艾。 

荧光探针是有效检测生命体内H₂S的手段之一。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、可用于实时可逆检测等优点。Christopher J.Chang等公开了一类用以检测硫化氢的荧光探针SF1及SF2（结构见图1，C.J.Chang et.al,J. Am.Chem.Soc.,2011,133,10078），与H₂S作用后荧光增强从而检测H₂S的存在。但是这类荧光探针对对硫化氢响应慢，不能用于快速地检测H₂S。Binghe Wang等公开了一种检测H₂S的荧光探针DNS-Az（结构见图1，B.Wang et.al,Angew.Chem.Int.Ed.,2011,50,9672）,但此探针的激发发射波长位于紫外区，不能有效避免生物自体荧光的干扰，同时紫外光对生物体光漂白作用很大，易于损伤生物样品。上述探针都是荧光增强型探针，没有波长的变化，无法实现定量检测。为达到充分穿透到组织内部和避免细胞自发荧光干扰目的，大大降低外部环境的干扰，实现定量检测，仍然需要开发具有较长激发发射波长的可操作性荧光探针。因此，开发具有良好选择性，可在近红外区进行检测生物体系中H₂S的荧光探针具有重要意义。 

发明内容

本发明的目的在于，提供一种基于硝基还原检测细胞内硫化氢的荧光探针及其应用。 

为实现上述目的本发明采用的技术方案为： 

一种基于硝基还原检测细胞内硫化氢的荧光探针，荧光探针为以半菁染料或花菁染料作为荧光母体，并在母体上引入间硝基苯胺或/和间硝基苯酚。 

所述荧光探针为以半菁染料或花菁染料作为荧光母体，并在母体上引入间硝基苯胺或间硝基苯酚，如结构式Ⅰ、Ⅱ所示； 

式Ⅰ 

式Ⅱ 

式Ⅰ中， 

R₁为苯基或烯丙基； 

R₂、R₃为C_1-5烷基、苯基或苄基； 

R₄、R₅为H、C_1-20的烷基、羟基、烷氧基、氰基、烷基仲胺基、硝基、卤素或磺酸基； 

Y为N、O或S； 

式Ⅱ中， 

R₁为苯基或烯丙基； 

R₂为C_1-5烷基、苯基或苄基； 

R₃为H、C_1-20的烷基、羟基、烷氧基、氰基、烷基仲胺基、硝基、卤素或磺酸基； 

R₄为C_1-5烷基、苯基或苄基； 

X为卤素、N、O或S; 

Y为N、O或S。 

基于硝基还原检测细胞内硫化氢的荧光探针的应用，所述荧光探针用于水体或生物体内外硫化氢的检测。 

所述荧光探针用于检测生物体系内硫化氢，并进行细胞或组织的荧光成像。 

将通式Ⅰ或Ⅱ与待测定水体或生物体内外的硫化氢从而导致荧光强度的改变，所得通式III、IV结构的化合物； 

通式III 

通式IV。 

本发明的有益效果：本发明探硫化氢荧光探针的这类化合物，在硫化氢存在下对应的荧光强度发生变化，可用于硫化氢的检测，大大降低外部条件的干扰，提高检测准确度。尤其是，这类化合物用作荧光探针，可用于细胞内硫化氢的检测，这对深入研究硫化氢在生物体内的产生、输送及累积等过程的动力学机理，进一步了解硫化氢的生理和毒理作用具有重要意义。 

附图说明

图1背景技术中所举的已公开的次氯酸荧光探针结构示意图； 

图2为本发明实施例提供的探针合成路线示意图； 

图3为本发明实施例提供的探针检测原理示意图； 

图4为本发明实施例提供的温度对检测速率的影响； 

图5为本发明实施例提供的不同pH下探针所采用的荧光探针的荧光强度变化曲线； 

图6为本发明实施例提供的所采用的荧光探针对硫化氢的选择性示意 图； 

图7为本发明实施例提供的所采用的荧光探针789nm荧光强度与硫化氢浓度变化的线性拟合曲线 

图8为本发明实施例提供的所采用的荧光探针Cy-NO₂用于检测细胞内硫化氢的共聚焦显微镜成像。 

图9为本发明实施例提供的所采用的荧光探针Cy-NO₂用于探针细胞内定位的共聚焦显微镜照片。 

具体实施方式

荧光探针的通式为： 

通式Ⅰ 

通式Ⅱ 

通式Ⅰ中， 

R₁为苯基、烯丙基； 

R₂、R₃为C_1-5烷基、苯基、苄基； 

R₄、R₅为H、C_1-20的烷基、羟基、烷氧基、氰基、烷基仲胺基、硝基、卤素、磺酸基； 

Y为N、O、S； 

通式Ⅱ中， 

R₁为苯基、烯丙基； 

R₂为C_1-5烷基、苯基、苄基； 

R₃为H、C_1-20的烷基、羟基、烷氧基、氰基、烷基仲胺基、硝基、卤素、磺酸基； 

R₄为C_1-5烷基、苯基、苄基； 

X为卤素、N、O、S; 

Y为N、O、S。 

当R₁为苯基，Y为O时，所述荧光探针的通式为： 

通式V 

通式V中： 

R₂、R₃为C_1-5烷基、苯基、苄基； 

R₄、R₅为H、C_1-20的烷基、羟基、烷氧基、氰基、烷基仲胺基、硝基、卤素、磺酸基； 

当R₁为苯基，Y为N时，所述荧光探针的通式为： 

通式VI 

通式VI中： 

R₁为苯基、烯丙基； 

R₂为C_1-5烷基、苯基、苄基； 

R₃为H、C_1-20的烷基、羟基、烷氧基、氰基、烷基仲胺基、硝基、卤素、磺酸基； 

R₄为C_1-5烷基、苯基、苄基； 

X为卤素、N、O、S; 

本发明中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指 支链烷基。例如，“C_1-6烷基”包括C_1-4烷基、C_1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。 

本发明中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。 

本发明中使用的术语“苄基”是指-CH₂-Ph基团。当用“任选取代”修饰苄基时，指该苄基可以未取代的形式存在，或者可被合适的取代基在任何合适的位置取代。合适的取代基包括但不限于H、C_1-18烷基、CN、COOH、NH₂、NO₂、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰氨基、卤素、或C_1-6卤代烷基等，只要最终形成的化合物具有本发明期望的性质。优选苄基由COOH、NH₂、OH、C_1-6烷氧基、卤素任选取代。 

将通式V，VI结构应用于检测H₂S时，其是与H₂S作用后，生成具有通式VII、VIII结构的化合物，从而导致荧光强度的改变； 

通式VII 

通式VIII 

通式VII、VIII可对H₂S进行定性、定量的检测。 

具体实施方式

实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。 

实施例1.具体式Ⅰ所示化合物的合成。 

如图2所示，实施例具体式Ⅰ所采用的探针化合物的结构用代号Cy-NO₂表示 

0.696g间硝基苯酚和0.0524-0.173g氢化钠溶于30mL无水DMF，加入0.5g花菁染料Cy7-Cl,氮气保护下室温反应24h。反应结束后，真空除去DMF，硅胶色谱柱提纯，洗脱剂为乙酸乙酯和甲醇，得深绿色产品0.425 g,产率73.2%。¹H NMR(500MHz,CDCl₃-D₁)δ(ppm):1.25-2.09(m,20H),2.63-2.65(q,4H),4.17-4.22(q,4H),6.08-6.17(d,2H),7.04-7.98(m,12H),8.01-8.09(d,2H).¹³C NMR(500MHz,CDCl₃-D₁)δ(ppm):171.4,162.2,159.7,141.7,141.1,131.7,129.9,128.8,125.3,122.3,122.2,117.4,110.7,110.5,110.2,100.7,77.3,77.0,76.8,49.0,40.0,28.4,27.8,24.8,21.0,12.4,12.3.LC-MS(API-ES):m/z C₄₀H₄₄N₃O₃⁺Calcd 614.3,found[M⁺]614.5.Elemental analysis calcd(%)for C₄₀H₄₄IN₃O₃:C,64.77;H,5.98;N,5.67;O,6.47;found:C,64.76;H,5.99;N,5.68;O,6.48. 

实施例2具体式Ⅱ所示化合物的合成 

如图2所示，实施例具体式Ⅰ所采用的探针化合物的结构用代号mCy-NO₂表示 

0.696g间硝基苯胺溶于30mL无水DMF，加入三乙胺，室温搅拌15min后，再加入0.50g花菁染料Cy7-Cl,氮气保护下于60-90℃反应24h。反应结束后，真空除去DMF，用硅胶色谱柱提纯，洗脱剂为乙酸乙酯和甲醇。得到深蓝色产品0.274g，产率47.3%。¹HNMR(400MHz,CDCl₃-D₁,0.1%CD₃COOD-D₄)δ(ppm):8.00(s,1H),7.30-7.15(m,8H),6.50(s,1H),5.84(s,1H),5.28(s,1H),4.02(m,2H),2.96(s,2H),2.88(s,2H),2.79(s,1H),1.87-1.58(m,10H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃-D₁)δ(ppm):168.8,162.6,142.4,140.7,140.1,128.5,127.7,123.8,122.2,122.0,121.5,120.0,109.2,105.54,96.3,59.2,54.6,45.5,39.3,32.9,29.6,29.3,28.6,25.1,24.4,22.7,22.0,20.1,12.1,11.0ppm.LC-MS(API-ES):m/z C₃₀H₄₂ClN₃O⁺Calcd 462.1943,found 492.2000.Elemental Analysis:Calcd C,70.04;H,6.31;N,9.08,found C,70.06;H,6.30;N,9.09. 

其通式中各个化合物，可按照上述合成方法以半菁染料为母体的探针的合成。 

实施例3 

具体式Ⅰ所示化合物Cy-NO₂对硫化氢响应的温度效应 

为尽可能模拟生理条件，以下各项检测效果实验均在pH=7.4条件下进行（HEPES缓冲溶液，浓度为40mM），探针浓度采用10μM。 

pH采用HEPES缓冲溶液控制。于10ml比色管中加入10μM具体式Ⅰ所示化合物Cy-NO₂，再加入40mM HEPES，然后加入350μM Na₂S，超纯水定容到10ml，摇匀溶液，在25、37、45、60℃下平衡50min后，将上述工作液加入荧光皿中测定荧光光谱。。荧光强度随温度的变化如图4所示。图4表明Cy-NO₂和H₂S的反应速率受温度影响。为了实现生物体内应用的目的我们将温度优化为37℃。 

实施例4 

具体式Ⅰ所示化合物Cy-NO₂对硫化氢的选择性 

pH采用HEPES缓冲溶液控制。于10ml比色管中加入10μM具体式Ⅰ所示化合物Cy-NO₂，再加入20mM HEPES，超纯水定容到10ml，摇匀溶液，37℃下平衡50min后，将上述工作液加入荧光皿中测定荧光光谱。 荧光强度F随pH的变化如图5所示。图5表明在pH 4.0～9.0的范围内F没有明显变化，即在pH 4.0～9.0的体系中，都可以使用Cy-NO₂检测硫化氢。 

于10ml比色管中加入10μM探针，再加入40mM HEPES pH 7.4，再加超纯水到5ml，摇匀，然后加入各种待测物，最后用超纯水定容到10ml。摇匀溶液，平衡50min，将工作液倒进荧光皿测定荧光光谱。Cy-NO₂对硫化氢的选择性如图6所示。图6表明Cy-NO₂对硫化氢具有很好的选择性，与硫化氢作用后，Cy-NO₂对应的荧光增强。测定条件下Na₂S,HSO₃^-,SO₃^2-,S₂O₃^2-,S₂O₄^2-,S₂O₅^2-,NO,H₂O₂at 300μM.Cl^-,Br^-,I^-,N₃^-,NO₂^-,OAc^-,Lipoic acid,citrate,glutathione,cysteine,S-nitrosoglutathione和2-mercaptoethanol等不能使探针荧光变化。 

实施例5 

具体式Ⅰ所示化合物Cy-NO₂对水溶液和血清中硫化氢的定量检测 

于10ml比色管中加入10μM Cy-NO₂，再加入40mM HEPES pH 7.4，再加超纯水到5ml，摇匀，然后加入不同浓度硫化氢，最后用超纯水/血清定容到10ml。摇匀溶液，平衡50min，将工作液倒进荧光皿测定荧光光谱，取各789nm处荧光光谱值，输入软件OriginPro 8.0,得到线性工作曲线。 

定容后过氧化亚硝酰浓度：0,50,100,150,200,250,300,350μM. 

图7红线和蓝线表示随H₂S浓度的变化体系荧光强度的变化，表明随硫化氢浓度的增加，体系789nm吸收强度在明显增强。 

图7蓝线表示在水溶液中789nm的荧光强度与硫化氢浓度变化的线性拟合曲线，线性拟合曲线的线性回归常数为0.992，表明探针能定量的测定ONOO^-的浓度。 

图7红线表示在血清中789nm的荧光强度与硫化氢浓度变化的线性拟合曲线，线性拟合曲线的线性回归常数为0.996，表明探针能定量的测定ONOO^-的浓度。 

实施例6 

具体式Ⅰ所示化合物Cy-NO₂用于细胞内硫化氢的检测 

RAW264细胞按照American type Tissue Culture Collection规定进行培养。如图8所示10uM Cy-NO₂孵育RAW264细胞30分钟，用培养基洗涤3次，置于共聚焦荧光显微镜下拍照。另取4组细胞，加入10uM Cy-NO₂孵育RAW264细胞3分钟，然后加入(b)50μM,(c)150μM,(d)250μM,and(e)350μM Na₂S孵育细胞30分钟，用培养基洗涤3次，共聚焦显微镜拍照，结果如图9所示，荧光强度明显升高；然后加入1uM Hoechest孵育RAW264细胞10分钟，用培养基洗涤3次，置于共聚焦荧光显微镜下拍照，9a与9b叠加后结果如图9c所示。图9c表明探针主要对细胞质染色。 

本发明中所设计的所有硫化氢探针均为荧光开关型的荧光探针，在变换不同荧光母体的操作后所有探针的荧光行为均与实施例相似。也就是母 体上引入间硝基苯酚或者间硝基苯胺基团后，母体荧光被猝灭，当加入硫化氢将硝基还原为氨基之后，荧光母体的荧光恢复。 

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。