一种利用O-甲基转移酶生物合成紫檀芹的方法

摘要

本发明公开了一种利用O-甲基转移酶生物合成紫檀芹的方法，属于代谢工程技术领域。本发明是单独表达O-甲基转移酶或表达O-甲基转移酶的同时融合表达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶，构建了能够以p-香豆酸或白藜芦醇为底物合成紫檀芹的基因工程菌，避免了原料和气候条件的制约，在可控条件下实现紫檀芹的生产，为工业化生产紫檀芹奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用O-甲基转移酶生物合成紫檀芹的方法，属于代谢工程技术领域。

背景技术

紫檀芹是一种在蓝莓和葡萄中发现的与白藜芦醇相关的二苯乙烯类化合物，属于植物用 于抗传染病的植物抗毒素。动物实验表明，紫檀芹有抗癌、抗高胆固醇血症、抗高甘油三酯 血症的特性，还能够抵御认知能力下降。除此之外，尽管鲜有研究，但紫檀芹还是被认为具 有抗糖尿病的作用。

Schmidlin等的研究表明白藜芦醇O-甲基转移酶（ROMT）可以催化白藜芦醇直接转化为 紫檀芹（Schmidlin等，2008；Accession No：FM178870）。如图1所示，紫檀芹可以由4-香 豆酸-辅酶A-连接酶（4CL）、芹合酶（STS）以及O-甲基转移酶（ROMT）催化生成。

本发明的目的是在细胞系统中同时表达ROMT、4CL及STS，以实现白藜芦醇向紫檀芹 的转化。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供能利用O-甲基转移酶合成紫檀芹的基因工程菌， 是单独表达O-甲基转移酶或表达O-甲基转移酶并融合表达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶 的基因工程菌。

所述基因工程菌可以是以下4种：

（1）表达了源自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的4-香豆酸-辅酶A连接酶（4CL）、源 自葡萄（Vitis vinife）的芹合酶（STS）的融合蛋白4CL::STS以及源自葡萄（Vitis vinife）的 O-甲基转移酶的大肠杆菌基因工程菌。所述大肠杆菌基因工程菌是以E.coli BL21（DE3）为 宿主，携带重组质粒pETDuet-4CLSTS和Sumo-ROMT。所述pETDuet-4CLSTS是携带编码 4CL::STS的融合基因的pETDuet-1重组载体，所述Sumo-ROMT是携带编码ROMT基因的 pETite N-His SUMO Kan重组载体。

（2）表达了源自葡萄（Vitis vinife）的O-甲基转移酶（ROMT）的大肠杆菌基因工程菌。 所述大肠杆菌基因工程菌是以E.coli BL21（DE3）为宿主，携带重组质粒Sumo-ROMT；所 述Sumo-ROMT是携带编码ROMT基因的pETite N-His SUMO Kan重组载体。

（3）表达了源自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的4-香豆酸-辅酶A连接酶（4CL）、源 自葡萄（Vitis vinife）的芹合酶（STS）的融合蛋白4CL::STS以及源自葡萄（Vitis vinife）的 O-甲基转移酶的酵母基因工程菌。酵母基因工程菌是以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） WAT11为宿主，携带重组质粒pAG304GPD-4CLSTS和pAG305GPD-ROMT。所述 pAG304GPD-4CLSTS是携带编码融合基因的pAG304GPD-ccdB重组载体；所述 pAG305GPD-ROMT是携带编码ROMT的基因的pAG305GPD-ccdB重组载体。

（4）表达了源自葡萄（Vitis vinife）的O-甲基转移酶（ROMT）的酵母基因工程菌。所 述酵母基因工程菌是以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WAT11为宿主，携带 pAG305GPD-ROMT重组质粒；所述重组质粒pAG305GPD-ROMT是携带编码ROMT的基因 的pAG305GPD-ccdB重组载体。

所述4-香豆酸-辅酶A连接酶是由来自拟南芥（Arabidopsis thaliana，生态型哥伦比亚-0） 的4CL基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述芹合酶是由源自葡萄（Vitis  vinife）的STS基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。上述两个基因融合获得 编码4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白4CL::STS的基因，核苷酸序列如SEQ ID  NO.3所示。O-甲基转移酶（ROMT）是由源自葡萄（Vitis vinife）的基因编码的，该基因核苷 酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WAT11的构建方法参照文献Urban P,Mignotte  C,Kazmaier M,Delorme F,Pompon D(1997)Cloning,yeast expression,and characterization of  the coupling of two distantly related Arabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P450reductases  with P450CYP73A5.J Biol Chem272(31):19176-19186。

本发明要解决的第二个技术问题是提供利用所述基因工程菌生物合成紫檀芹的方法，包 括以下4种具体方法：

（1）以改良M9培养基在200rpm、37℃条件下培养携带重组质粒pETDuet-4CLSTS 和Sumo-ROMT的E.coliBL21（DE3）至OD₆₀₀=0.6，添加终浓度1mM的IPTG 诱导培养2h，添加p-香豆酸乙醇溶液至终浓度为0.5g/L，在相同条件下继续 培养以合成紫檀芹。所述p-香豆酸乙醇溶液是以纯乙醇为溶剂，p-香豆酸浓度 为0.5g/mL。

（2）以改良M9培养基在200rpm、37℃条件下培养携带重组质粒Sumo-ROMT的 E.coliBL21（DE3）至OD₆₀₀=0.6，添加终浓度1mM的IPTG诱导培养2h，将 白藜芦醇DMSO溶液添加到培养物中至白藜芦醇终浓度为0.228g/L，相同条 件下继续培养以合成紫檀芹。所述白藜芦醇DMSO溶液是以DMSO为溶剂， 白藜芦醇的浓度为0.228g/mL。

（3）以SD drop-out培养基在30℃条件下培养携带pAG304GPD-4CLSTS和 pAG305GPD-ROMT的S.cerevisiae WAT11细胞至OD₆₀₀=0.2，然后添加p-香 豆酸乙醇溶液至终浓度为0.5g/L，继续振荡培养4天以合成紫檀芹。所述p- 香豆酸乙醇溶液是以纯乙醇为溶剂，p-香豆酸浓度为0.5g/mL。

（4）以SD drop-out培养基在30℃条件下培养携带pAG305GPD-ROMT的S. cerevisiae WAT11细胞至OD₆₀₀=0.2，将白藜芦醇DMSO溶液添加到培养物中 至白藜芦醇终浓度为0.228g/L，相同条件下继续培养。所述白藜芦醇DMSO 溶液是以DMSO为溶剂，白藜芦醇的浓度为0.228g/mL。

所述改良M9培养基是在标准M9培养基的基础上添加1.25g/L酵母提取物和0.5%（v/v） 甘油得到的。

本发明还提供了能够以p-香豆酸为底物生物合成白藜芦醇的基因工程菌，包括（1）融合 表达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶（SEQ ID NO.3）的E.coliBL21（DE3），（2）融合表 达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶（SEQ ID NO.3）的S.cerevisiae WAT11细胞。

4-香豆酸-辅酶A连接酶是由来自拟南芥（Arabidopsis thaliana，生态型哥伦比亚-0）的 4CL基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。芹合酶是由源自葡萄（Vitis vinife） 的STS基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将上述两个基因融合获得编码 4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。O- 甲基转移酶（ROMT）是由源自葡萄（Vitis vinife）的基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示。4-香豆酸-辅酶A连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，芹合酶的氨基酸 序列如SEQ ID NO.6所示，4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID NO.7所示，O-甲基转移酶（ROMT）的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

目前，紫檀芹的获得方法主要是依赖从少数几种植物中提取，还没有微生物合成紫檀芹 的方法。本发明构建了能够以p-香豆酸或白藜芦醇为底物合成紫檀芹的基因工程菌，避免了 原料和气候条件的制约，在可控条件下实现紫檀芹的生产，为工业化生产紫檀芹奠定基础。

附图说明

图1紫檀芹的生物合成途径。

图2p-香豆酸、白藜芦醇和紫檀芹三种物质的标样的HPLC图谱。

图3融合表达了4CL和STS的E.coil细胞提取物的HPLC图谱。

图4表达了ROMT的E.coil细胞提取物的HPLC图谱。

图5共表达了4CL、STS和ROMT的E.coil细胞提取物的HPLC图谱。

图6融合表达了4CL和STS的酵母细胞提取物的HPLC图谱。

图7表达了ROMT的酵母细胞提取物的HPLC图谱。

图8共表达了4CL、STS和ROMT的酵母细胞提取物的HPLC图谱。

具体实施方式

4-香豆酸-辅酶A连接酶是由来自拟南芥（Arabidopsis thaliana，生态型哥伦比亚-0）的 4CL基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。芹合酶是由源自葡萄（Vitis vinife） 的STS基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将上述两个基因融合获得编码 4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。O- 甲基转移酶（ROMT）是由源自葡萄（Vitis vinife）的基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示。4-香豆酸-辅酶A连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，芹合酶的氨基酸 序列如SEQ ID NO.6所示，4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID NO.7所示，O-甲基转移酶（ROMT）的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

一种制备紫檀芹的方式是在细胞系统中表达白藜芦醇O-甲基转移酶，以含有白藜芦醇的 培养基培养细胞系统产紫檀芹。

一种制备白藜芦醇的方式是在细胞系统中表达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶，以含 p-香豆酸的培养基培养细胞系统产白藜芦醇。

另一种制备紫檀芹的方式是在第一细胞系统中表达4-香豆酸-辅酶A-连接酶（4CL）、芹 合酶（STS），以含p-香豆酸的培养基培养该第一细胞系统产白藜芦醇。在第二细胞系统中表 达O-甲基转移酶（ROMT），以含有白藜芦醇的培养基培养该第二细胞系统产紫檀芹。

菌种、质粒

HI-Control10G和DH5α用于质粒扩增，BL21（DE3）用于在大肠杆菌中重组表达蛋白， 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WAT11用于在酵母中表达蛋白。P-香豆酸、白藜芦醇和 紫檀芹标样均从Sigma购买获得。pETite N-His SUMO Kan载体从Lucigen（Middleton，WI） 购买。pETDuet-1从Novagen购买获得，并用于重组蛋白表达。pAG304GPD-ccdB、pAG305GPD- ccdB从Addgene（Boston，MA）获得。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WAT11的构建方法参照文献Urban P,Mignotte C, Kazmaier M,Delorme F,Pompon D(1997)Cloning,yeast expression,and characterization of the  coupling of two distantly related Arabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P450reductases with  P450CYP73A5.J Biol Chem272(31):19176-19186。

改良M9培养基是在标准M9培养基的基础上添加1.25g/L酵母提取物和0.5%（v/v）甘 油得到的。

DNA操作

所有DNA操作均参照标准程序。限制性酶和T4DNA连接酶均从New England Biolabs 购买。所有PCR扩增和克隆反应均采用Phusion高保真DNA聚合酶（New England Biolabs）。

RNA提取和cDNA合成

ROMT（O-甲基转移酶）、4CL（4-香豆酸-辅酶A-连接酶）、STS（芹合酶）克隆于不同 的植物。用于克隆ROMT和STS的葡萄RNA，以及用于克隆4CL的拟南芥RNA均采用Trizol  Plus RNA纯化试剂盒（Invitrogen）。cDNA的合成是利用Promega Inc.的Im Prom-Ⅱ^TM反向 转录系统，按照其使用说明完成的。基因扩增是利用表1所示引物借助New England Biolabs  PhusionPCR试剂盒完成的。

产物的提取

发酵培养液（400μL）用800μL乙酸乙酯进行萃取，然后将提取物用Eppendorf Vacufuge （Eppendorf Scientific Westbury，NY）在室温下进行蒸发干燥，然后再复溶于200μL80%（v/v） 的甲醇中。

HPLC分析

利用Dionex Ultimate3000系统对所提取的产物中的白藜芦醇和紫檀芹进行分析。中间产 物通过反相色谱Kinetex C18（粒径为2.6μm；150×4.6mm）进行分离，洗脱液为0.1%（v/v） 的蚁酸（溶液A）和100%的乙腈（溶液B）。样品用80%的甲醇进行稀释，梯度洗脱程序如 下：10%的溶液B洗脱2min，10%-70%的溶液B线性洗脱18min，70%-30%的溶液B线性洗 脱1min，30%-10%的溶液B线性洗脱2min，10%的溶液B洗脱以流速0.8ml/min洗脱5min。 为了定量分析，所有中间体都通过外标法测定。化合物通过HPLC系统的二极管阵列检测器 检测的滞留时间和相应的光谱进行定性。3个标准样品（p-香豆酸、白藜芦醇和紫檀芹）经 HPLC分析得到了3个分离效果良好的峰（图2）。

实施例1在E.coliBL21（DE3）中融合表达4CL、STS产白藜芦醇

为融合表达4CL及STS，两个基因通过PCR扩增策略融合在一起。4CL的终止子被敲 除，并在4CL和STS的开放阅读框之间插入一个由3个氨基酸组成的连接肽（Gly-Ser-Gly）， 以此获得了一个大小为2.87kb的编码4CL、3肽连接子和STS的融合基因，融合基因4CL：： STS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4CL：：STS融合基因通过pCR8/GW/TOPO TA克 隆试剂盒连接到入门载体（Gateway entry vector）然后转化进入One Shot大肠杆菌感受态细 胞，并测序验证。4CL：：STS融合基因通过扩增、BamHⅠ和HindⅢ双酶切连接到pETDuet-1 载体上，得到重组质粒pETDuet-4CLSTS，转化进入E.coliBL21（DE3）。

挑选E.coli BL21单菌落到3mL含100μL/mL氨苄霉素的LB培养基中37℃过夜培养获 得种子培养液，将种子培养液转接到50mL含有100μL/mL氨苄霉素的改良M9培养基中在 200rpm、37℃条件下培养至OD₆₀₀=0.6，添加1mM的IPTG诱导培养2h，添加p-香豆酸乙醇 溶液（纯乙醇为溶剂）至终浓度为0.5g/L，在相同条件下继续培养，间歇取样用HPLC进行 分析。

我们检测了以改良M9培养基摇瓶培养携带pETDuet-4CLSTS质粒的E.coliBL21（DE3） 时白藜芦醇的产量，如图3所示，p-香豆酸可被成功转化为白藜芦醇。

实施例2在E.coliBL21（DE3）中表达ROMT

编码O-甲基转移酶（ROMT）的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，将ROMT的 基因扩增产物按照pETite N-His SUMO Kan载体的使用说明连接到pETite N-His SUMO Kan 载体上。通过测序验证正确插入基因的重组质粒命名为Sumo-ROMT，并将该该重组质粒转 化到BL21（DE3）中进行异源表达。

将携带Sumo-ROMT质粒的E.coliBL21（DE3）以改良M9培养基在37℃条件下培养至 OD₆₀₀=0.6，添加1mM的IPTG诱导培养2h，将白藜芦醇溶解于DMSO添加到培养物中至终 浓度为0.228g/L，相同条件下继续培养，间歇取样用HPLC分析。

如图4所示，摇瓶培养时，将白藜芦醇添加到表达ROMT的E.coli培养物中，白藜芦醇 可转化为紫檀芹，转化率为30%。HPLC分析结果也证明了这一点，然而，出现了一个未知 的峰，可能是原白藜芦醇上的甲基。

实施例3在E.coliBL21（DE3）中融合表达4CL：：STS并同时表达ROMT

携带pETDuet-4CLSTS和Sumo-ROMT质粒的E.coliBL21（DE3）以改良M9培养基在 200rpm、37℃条件下培养至OD₆₀₀=0.6，添加1mM的IPTG诱导培养2h，添加p-香豆酸乙醇 溶液（纯乙醇为溶剂）至终浓度为0.5g/L，在相同条件下继续培养，间歇取样用HPLC进行 分析。

向共表达了4CL：：STS融合蛋白和ROMT的E.coli培养物中添加p-香豆酸，如图5的 HPLC图谱所示，24h时p-香豆酸成功转化为白藜芦醇和紫檀芹，p-香豆酸到紫檀芹的转化率 为20%。样品在96h内进行HPLC检测。

实施例4在酵母中融合表达4CL：：STS

将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的4CL：：STS融合基因连接到载体pAG304GPD-ccdB （Addgene，Boston，MA）上，得到重组质粒pAG304GPD-4CLSTS，并将该重组质粒并转 入S.cerevisiae WAT11。酵母转化借助Frozen-EZ酵母转化Ⅱ试剂盒（Zymmo Research，Orange， CA）进行。阴性对照质粒为pAG304GPD-ccdB。

携带pAG304GPD-4CLSTS的S.cerevisiae WAT11细胞以SD drop-out培养基在30℃条件 下培养至OD₆₀₀=0.2，然后添加p-香豆酸（0.5g/L），继续振荡培养4天，间歇取样用HPLC 进行分析。

将携带pAG304GPD-4CLSTS的新鲜酵母菌落以3ml含0.5g/Lp-香豆酸的drop-out培养基 在30℃条件下培养4天。细胞提取物经HPLC分析，如图6所示，几乎所有的p-香豆酸在4 天内都被转化为了白藜芦醇。与E.coli相比，酵母的转化效率更高。

实施例5在酵母中表达ROMT

将核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的ROMT基因通过LR ClonaseⅡ酶混合试剂盒替换连 接到pAG305GPD-ccdB（Addgene），得到重组质粒pAG305GPD-ROMT，转入S.cerevisiae  WAT11细胞用于发酵。

将携带pAG305GPD-ROMT的S.cerevisiae WAT11细胞以SD drop-out培养基在30℃条 件下培养至OD₆₀₀=0.2，然后添加白藜芦醇（0.228g/L），相同条件下继续培养，间歇取样用 HPLC进行分析。

如图7所示，摇瓶培养时，将白藜芦醇添加到表达ROMT的S.cerevisiae WAT11细胞培 养物中，白藜芦醇可转化为紫檀芹，转化率30%。HPLC分析结果也证明了这一点，然而， 出现了一个未知的峰，可能是原白藜芦醇上的甲基。

实施例6在酵母中融合表达4CL：：STS并同时表达ROMT

将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的4CL：：STS融合基因连接到载体pAG304GPD-ccdB。 将核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的ROMT基因通过LR ClonaseⅡ酶混合试剂盒替换连接到 pAG305GPD-ccdB（Addgene）。上述两步得到的重组质粒分别命名为pAG304GPD-4CLSTS 和pAG304GPD-ROMT。这些质粒含有组成型启动子GPD。将这些质粒转入S.cerevisiae  WAT11细胞用于发酵。阴性对照质粒为pAG304GPD-ccdB和pAG305GPD-ccdB。

将携带pAG304GPD-4CLSTS和pAG305GPD-ROMT的S.cerevisiae WAT11以SD drop-out 培养基在30℃条件下培养至OD₆₀₀=0.2，然后添加p-香豆酸（0.5g/L），相同条件下继续培养， 间歇取样用HPLC进行分析。

向共表达了4CL：：STS融合蛋白和ROMT的S.cerevisiae WAT11的培养物中添加p-香 豆酸，如图8的HPLC图谱所示，24h时p-香豆酸成功转化为白藜芦醇和紫檀芹，p-香豆酸 到紫檀芹的转化率为30%。样品在96h内进行HPLC检测。

表1 引物序列

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。此外，除特别说明之外，本发明所涉及的科学术语具有本领域技 术人员一般理解的含义。尽管有很多与本发明的相似、等同的材料方法均可以使用，但本发 明优选上述实施方式。

其他方面，本发明的目的及优势可以从本发明记载的附图、权利要求中得到。