快速鉴定与黄曲霉毒素B1互作的宿主蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种通过固相层析寻找出黄曲霉毒素B

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及一种通过固相层析筛选与黄曲霉毒素B₁结合的蛋白的方法及对其是否与AFB₁具有结合性的体外验证分析。

背景技术

真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人和动物有极大危害。历年来有大量关于真菌毒素污染粮食和作物，导致事物中毒事件的报道，其中常见到的真菌毒素有：黄曲霉毒素、黄绿青霉素、橘青霉素、T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌稀醇等。其中，黄曲霉毒素（Aflatoxins, AFT）是主要由黄曲霉 （aspergillus flavus）寄生曲霉 （Aspergillus parasiticus）产生的次生代谢产物，污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品。黄曲霉毒素在 1993年被世界卫生组织的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，其毒性作用主要是对肝脏的损害。在天然食物中以黄曲霉毒素B₁（Aflatoxin B₁, AFB₁）最为多见，危害性也最强。动物实验表明，AFB₁具有强肝脏毒性和致癌效应。

一直以来科学家围绕AFB₁的产毒机理、毒素的致毒机理展开了大量研究，但由于该毒素是小分子的特点，针对毒素被动物细胞吸收的机理研究很少。本发明设计了一种快速鉴定与AFB₁互作的蛋白的方法，本发明通过固相亲和层析法寻找出黄曲霉毒素的结合蛋白，利用该方法可以快速有效地找出与AFB₁互作的结合蛋白，为促进对该毒素的致毒机理的研究奠定基础。本方法包含，将AFB₁与载体蛋白进行偶联，将毒素与载体蛋白的偶联复合物固定在PVDF膜上，让偶联复合物与宿主的总蛋白孵育，进行非特异性洗涤和特异性洗脱并进行质谱鉴定。通过该方法得到的AFB₁的互作蛋白准确度高，能为毒素被动物细胞吸收机理的研究打下基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速鉴定与黄曲霉毒素B1互作的宿主蛋白的方法，通过固相层析筛选与黄曲霉毒素B₁结合的蛋白的方法，及对其与AFB₁是否具有结合性的体外验证分析。经此方法的筛选和验证，目前已经发现40S核糖体蛋白SA和雌二醇β脱氢酶5能与AFB₁结合，是AFB₁的互作蛋白。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速鉴定与黄曲霉毒素B₁互作的宿主蛋白的方法，是先将黄曲霉毒素B₁与牛血清白蛋白进行偶联，再通过固相层析的方法，筛选与黄曲霉毒素B₁结合的蛋白，经质谱分析鉴定后，再通过体外结合实验验证蛋白与黄曲霉毒素B₁的结合性。

所述的通过固相层析的方法来筛选与黄曲霉毒素B₁结合的蛋白，是将牛血清蛋白-黄曲霉毒素B₁偶联复合物展示在甲醇活化后的PVDF膜上，3-5℃过夜孵育；将孵育了牛血清蛋白-黄曲霉毒素B₁的PVDF膜用质量分数为2% 牛血清蛋白溶液进行封闭后，将膜置于小鼠肝脏总蛋白溶液中3-5℃过夜孵育以充分结合，同时用只展示牛血清蛋白分子的PVDF膜置于小鼠肝脏总蛋白溶液中作为阴性对照；再用3-5℃预冷的磷酸盐缓冲液或磷酸盐吐温缓冲液进行非特异性洗脱，3-5℃振摇10min，洗涤四次，用2M的NaCl进行特异性洗脱，3-5℃振摇30min，洗脱液中的互作蛋白浓缩后进行SDS-PAGE分析，银染后取差异条带进行质谱分析鉴定。

所述的通过体外结合实验验证蛋白与黄曲霉毒素B₁的结合性，对经质谱鉴定的黄曲霉毒素B₁互作蛋白进行基因克隆、诱导表达、纯化后，通过ELISA的方法验证相应蛋白与黄曲霉毒素B₁的结合性；

所述的通过体外结合实验验证，具体步骤为：将牛血清蛋白-黄曲霉毒素B₁偶联复合物包被于孔中，在3-5℃下过夜，2wt.%的牛血清蛋白溶液在37℃下封闭2 h后，加入纯化的黄曲霉毒素B₁互作蛋白37℃孵育2 h，再相继加入一抗和二抗，最后相继加入TMB显色和 H₂SO₄终止液，同时设置包被牛血清蛋白的阴性孔作为对照，经此方法验证出40S核糖体蛋白SA和雌二醇β脱氢酶5与黄曲霉毒素B₁有结合性。

所述的一抗为抗蛋白的His标签抗体，37℃孵育1 h；二抗为抗His抗体的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1 h。

本发明的优点在于：真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人和动物有极大危害。一直以来科学家围绕真菌毒素，特别是AFB₁的致毒机理展开了大量研究，但由于该毒素是小分子的特点（很难鉴定与其互作的宿主蛋白），针对毒素被动物细胞吸收的机理，以及被细胞吸收后细胞内与其互作蛋白的了解很少。本发明提供了一种确实可行，并且快速简便的筛选与真菌毒素（以黄曲霉毒素为例）互作蛋白的方法，为进一步了解真菌毒素的致毒机理奠定基础。

附图说明

图1 AFB₁的结构分子式。

图2 AFB₁与BSA偶联路线。 

图3 AFB1、BSA和偶联产物三种物质的紫外扫描图；其中1为牛血清蛋白；2为黄曲霉毒素B₁；3为牛血清蛋白-黄曲霉毒素B₁偶联复合物。

图4 AFB1结合蛋白的SDS-PAGE分析；其中M为Marker；1为牛血清蛋白-黄曲霉毒素B₁偶联复合物；2为牛血清蛋白； 3为牛血清蛋白-黄曲霉毒素B₁偶联复合物；4为牛血清蛋白；1和2泳道是PBST洗涤组，3和4是PBS洗涤组。

图5鉴定的AFB₁结合蛋白的体外表达与纯化。其中，A图：Rpsa蛋白的表达纯化。M:Marker；1：IPTG诱导PET28a菌菌液；2： IPTG诱导PET28a-rpsa重组菌菌液；3：纯化的Rpsa蛋白；B图：Akr1c6蛋白的表达纯化。M:Marker；1：IPTG诱导PET28a菌菌液；2：IPTG诱导PET28a-akr1c6重组菌菌液；3：纯化的Akr1c6蛋白；C图：Cyb5a蛋白的表达纯化。M:Marker；1：IPTG诱导PET28a菌菌液；2：IPTG诱导PET28a-cyb5a重组菌菌液；3：纯化的Cyb5a蛋白。

图6鉴定的AFB₁结合蛋白与AFB₁的体外结合验证。把交联产物BSA-AFB1包被在酶标孔中，再加入纯化的蛋白和一抗（抗蛋白的抗体）、二抗、显色液、终止液，测OD值，通过OD值来判断黄曲霉毒素B1与蛋白的结合性。

具体实施方式

一、聚丙烯酰胺凝胶的配制

（1）2 mol/L Tris-HCl（pH8.8）：称取24.2 g Tris base加适量超纯水溶解，用盐酸调pH值至8.8，加超纯水定容至100 mL。

（2）1 mol/L Tris-HCl（pH6.8）：称取12.1 g Tris base加适量超纯水溶解，用盐酸调pH值至6.8，加超纯水定容至100mL。

（3）30 %丙烯酰胺储存液：称取29.2 g丙烯酰胺，0.8 g N’，N’-亚甲叉双丙烯酰胺，加超纯水溶解至100 mL，待其完全溶解后用滤纸过滤，4 ℃避光保存。

（4）10 % SDS：称取10 g SDS（电泳级），加超纯水溶解至100 mL，室温保存。

（5）10%过硫酸铵：称取100 mg过硫酸铵，加超纯水溶解至1 mL。

（6）4×分离胶缓冲液：量取75 mL 2 mol/L Tris-HCl（pH8.8），4 mL 10% SDS，加21mL ddH2O，可在4 ℃保存数月。

（7）4×浓缩胶缓冲液：量取50 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH6.8），4 mL 10% SDS，加46 mL ddH2O，可在4 ℃保存数月。

（8）电极缓冲液：称取3 g Tris base，14.4 g甘氨酸，1 g SDS，加适量超纯水溶解，用盐酸调pH值至8.3，加超纯水定容至1000 mL。也可制成10×的储存液，在室温下可长期保存。

（9） 5×上样缓冲液：称取10 mg溴酚蓝，加入0.6 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH6.8），2.5 mL 甘油，2 mL 10 % SDS，0.5 mL β-疏基乙醇和4.4 mL ddH2O，可在4 ℃保存数周，或在-20 ℃保存数月。

（10）考马氏亮蓝染色液：称取1 g考马氏亮蓝R-250，200 mL甲醇，50 mL冰醋酸，加蒸馏水溶解至500 mL。

（11）考马氏亮蓝脱色液：量取450 mL甲醇，100 mL冰醋酸，加蒸馏水至1000

mL。

二、基因克隆及蛋白纯化试剂名称及方法

（1） 1.0%琼脂糖凝胶：称取0.2 g琼脂糖于20 mL0.5×TBE，加热溶解，将其倒入制胶板中，插入梳子， 

（2） 5×TBE ：称量54.0 g Tris碱，27.5 g硼酸，加入800 mL，加入20 mL 0.5 mol/L的EDTA（pH8.0），至充分溶解后用水定容到1 L，室温储存。

（3）LB培养基：称量 10 g  Tryptone，5 g  Yeast Extract ，10 g NaCl ，                加入800 mL去离子水，pH值调至7.0，定容至1 L，高温高压灭菌后，4℃保存。

（4）氨苄青霉素（Amp）（100 mg/mL）：溶解1 g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10 mL，过滤除菌，分装成小份于-20℃贮存。

（5）卡那霉素（Kan）（50 mg/mL）：溶解0.5 g卡那霉素于足量的水中，最后定容至10 mL，过滤除菌，分装成小份于-20℃贮存。

（6）IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）（1 mol/L）：溶解238 mg的IPTG于1 mL水中，过滤除菌，贮存于-20℃。

（7）0.1 mol/L CaCl2：称取54 g CaCl2-6H2O，去离子水将溶液定容至1 L，用0.22 μm滤器过滤除菌，分装成10 mL小份贮存于-20℃。　　

（8）Buffer B, C, D, E ( L-1):称取13.8 g NaHPO4·H2O，1.2 g Tris Base，480.5 g尿素，溶解后，分别调节pH至8.0，6.3，5.9，4.5，使用前调节pH值。

三、ELISA方法中各试剂的名称及配制方法

(1) 0.05 M的碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6）：分别称取1.59 g碳酸钠和2.93 g的碳酸氢钠溶解于800 mL的双蒸水中，用2 mol/L的氢氧化钠调节其pH值至9.6，最后定容至1000 mL。

（2）1×磷酸盐缓冲液（PBS）：称取NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.58 g，KH2PO4 0.27 g，溶于 1 L水中，调 pH 至 7.2～7.4，121℃高压灭菌20 min。

（3）5%PBSM封闭液：在100mL的1×PBS( pH 7.4)中加入4g的脱脂奶粉。

（4）PBST洗脱液：即含有Tween-20浓度为0.05%的1×PBS。在1000 mL的1×PBS(pH 7.4)中加入0.5 mL的Tween-20。

（5）底物显色A液：分别称取27.2 g乙酸钠和3.2 g柠檬酸于1000 mL烧杯中，加入0.6 mL的30%的双氧水，最后定容至1000 mL。

（6）底物显色B液：分别称取0.4 g乙二胺四乙酸钠、1.9 g柠檬酸和0.4 g四甲基联苯胺（TMB）于1000 mL烧杯中，加入100 mL甘油，最后定容至1000 mL。

（7）终止液（2 mol/L硫酸）：取111 mL的浓硫酸缓慢的滴入889 mL的双蒸水中混匀即可。

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例是为了进一步说明本发明，但不应视为限制本发明。

实施例1快速鉴定与黄曲霉毒素B₁互作的宿主（小白鼠）蛋白

1)真菌毒素与载体蛋白进行偶联

黄曲霉毒素B₁(Aflatoxin B₁ 简称AFB₁)，购于美国Simga公司。根据AFB₁的结构特点，采用碳二亚胺法进行偶联。首先进行肟化反应，取2mg AFB ₁ 与4mg CMO 溶解于400 l 吡啶中，25℃避光振摇反应4h，将反应产物冷冻干燥即得AFB₁肟化产物；取0.2mg AFB ₁ 肟肟化产物溶于100 μL DMF-水(6:9 V/V ) 中，加入2mg EDC 避光混匀，再加入0.5% C-BSA溶液，25℃避光、100r/min 反应4h后，再补加EDC 2mg继续反应20h。将所得偶联产物装入透析袋在0.01mol/L PBS(pH7.4)中，置4℃透析3d ，期间更换透析液。并对AFB₁、C-BSA 和偶联产物三种物质进行紫外扫描，比较偶联产物吸收峰的变化。

2）将偶联的复合物固定在PVDF膜上；

剪取10cm*1cm的聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），在甲醇溶液中活化5s后，用PBS溶液加以洗涤，置于BSA-AFB₁溶液中，于4℃慢摇过夜，让蛋白分子与膜充分结合从而通过BSA将AFB₁展示在膜表面。

3）将偶联复合物与总蛋白孵育，偶联复合物与总蛋白相互结合；

按碧云天公司的细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒操作步骤提取小白鼠肝脏总蛋白，测蛋白浓度，并用PBS溶液将所提取的总蛋白稀释至2mg/ml。将孵育了BSA-AFB₁的PVDF膜用2%BSA溶液进行封闭后，取膜置于小鼠肝脏总蛋白溶液中，于4℃慢摇孵育过夜，让蛋白分子与AFB₁或BSA进行结合。同时用只包被BSA分子的PVDF膜置于小鼠肝脏总蛋白溶液中作为阴性对照。

4）进行非特异性洗涤、特异性洗脱，得到与真菌毒素互作的蛋白。

取4℃预冷的PBS或PBST缓冲液对孵育后的膜进行非特异性洗涤，每次40mL，4℃振摇10min，洗涤四次。取4℃预冷的含2M NaCl的PBS缓冲液对洗涤后的膜进行特异性洗脱，4℃振摇30min，收集洗脱溶液。将所得洗脱溶液装入透析袋在0.01mol/L PBS(pH7.4)中，置4℃透析2d ，期间更换透析液，并用PEG20000对透析后的溶液进行浓缩。然后将实验组与对照组进行进一步的SDS-PAGE分析，银染后可见有8条差异条带，将其割胶进行质谱分析鉴定。具体质谱分析条件如下：

LC条件：高效液相色谱仪：Thermo Scientific Accera System；色谱柱：BioBasic C18 Column (100 x 0.18 mm，particle size: 5 um)；样品量：10uL；流动相：A: 水相（0.1% 甲酸）； B: 已腈（0.1%甲酸）；梯度：5%–35%B in 20 minutes,35%–95%B in 2 minutes；流速：2.5uL/min；

MS条件：质谱仪：LTQ-XL(Thermo Scientific)；喷雾电压：3.5 kV；毛细管温度：275℃；鞘气流速：15arb；母离子扫描范围：400-2000m/z；Isolation width：2 Da。

二级质谱条件：AGC Target 1e4, 1 microscans；碰撞能量：35% CID。 

检索：搜索使用的数据库为从UNIPROT(http://www.uniprot.org/）下载的Mus musculus.fasta蛋白库。质谱分析所获得的原始数据用Proteome Discoverer1.2软件进行相对定量分析。

5）质谱结果分析

对质谱结果进行分析，将与对应的条带大小不一致及匹配肽段太小的蛋白删掉，得到32种蛋白；再经文献分析，最后确定有必要进一步验证的三种蛋白：40S核糖体蛋白SA（Rpsa）和雌二醇 β脱氢酶5（Akr1c6），细胞色素b5（Cyb5a）。

表1  AFB₁结合蛋白条带的质谱分析

6）AFB₁结合蛋白的表达纯化

提取小鼠总RNA，反转录后得cDNA。设计rpsa、akr1c6和cyb5a基因的引物，以得到的cDNA作为模板克隆出相应基因，将其构建到载体PET28a上，再转入E.coli中，验证后对该菌加IPTG诱导蛋白表达，而后用镍柱对重组蛋白进行分离纯化，得到相应蛋白。

表1 引物序列表

7）AFB₁结合蛋白与黄曲霉毒素B₁的体外结合验证

采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）分析AFB₁与鉴定得到的AFB₁结合蛋白的结合作用。取交联产物BSA-AFB₁，用0.05M的碳酸盐缓冲液（pH 9.6）稀释至浓度为2μg/mL，100μL/孔包被酶标板，于4℃过夜；PBS洗板3次，用2%BSA封闭，200μL/孔，于37℃孵育2 h；PBS洗板3次，取纯化的蛋白Rpsa和Akr1c6，用2%BSA稀释至浓度为10μg/mL， 100μL/孔加入酶标孔中；PBS洗板3次，用2%BSA按1:4000稀释HIS抗体，加入酶标板，100μL/孔，于37℃孵育1 h；用PBST和 PBS各洗3遍，用2%BSA按1:6000稀释辣根过氧化物标记的山羊抗小鼠IgG，100μL/孔，于37℃孵育1 h；用PBST和PBS各洗3遍，加TMB显色，100μL/孔，于37℃孵育10 min；用2 M H₂SO₄终止反应，50μL/孔；测450nm吸光值。同时设置BSA、trx和GFP蛋白作为阴性对照，BSA-AFB₁交联产物、Rpsa蛋白、Akr1c6蛋白、Cyb5a蛋白作为阳性对照。结果显示Rpsa蛋白和Akr1c6蛋白与AFB₁有结合性， 但是没有发现Cyb5a蛋白与AFB₁有明显的结合力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  福建农林大学

 

<120>  快速鉴定与黄曲霉毒素B1互作的宿主蛋白的方法

 

<130>  6

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

ataggatcca tgtccggagc cctt                                            24

 

 

<210>  2

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gccgaagctt tcaggaccac tcagt                                           25

 

 

<210>  3

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

tacgaattca tggattctaa gcagcagac                                       29

 

 

<210>  4

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gccaagcttc cgttagtatt catccc                                          26

 

 

<210>  5

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

taagaattca tggccgggca gtcag                                           25

 

 

<210>  6

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

gccaagcttt caatcttctg ccatgtag                                        28