降低β-抑制蛋白1与APH-1蛋白的结合的物质在制备防治神经退行性疾病药物中的应用

摘要

本发明涉及降低β-抑制蛋白1与APH-1蛋白的结合的物质在制备防治神经退行性疾病药物中的应用。本发明首次揭示β-Arrestin1可与γ-分泌酶的一个必要组分APH-1相互作用，从而影响γ-分泌酶的活性。本发明还公开了一种分离的APH-1AL及APH-1B的蛋白片段，所述蛋白片段既是β-抑制蛋白1与γ-分泌酶相关组分相互作用的靶点，又可以用于干扰β-抑制蛋白1与APH-1相互作用，从而抑制淀粉样蛋白的产生及相关的神经退行性疾病。本发明还公开了筛选防治神经退行性疾病的药物的方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，更具体地涉及一种新的神经退行性疾病相关的靶点，以及基于该靶点的抑制剂，以及基于该靶点的药物筛选模型和方法。 

背景技术

阿尔兹海默症是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病。患者临床表现为认知(计算、判断、综合等)功能障碍、记忆力减退、人格异常等。阿尔兹海默症的主要病理学特征为病人大脑内形成的淀粉样蛋白斑和神经纤维丝缠结。淀粉样蛋白斑是阿尔兹海默症的特征性病理学变化，主要由细胞内异常大量产生的淀粉样蛋白-β(Aβ)蛋白在细胞外积聚形成的。 

阿尔兹海默症的病因尚不明确，有多个理论试图解释其致病机理。Hardy和Selkoe提出的“Aβ假说”是目前被广为接受的理论。该理论认为，在复杂的遗传和环境因素长期作用下，神经细胞异常地大量产生Aβ，积累形成寡聚体和淀粉样蛋白斑，Aβ(尤其是寡聚化的Aβ)通过一系列级联反应(包括自由基反应、线粒体氧化损伤和炎症反应等直接或间接地作用于神经元和胶质细胞)，导致突触功能异常和神经元损伤，并且引起小胶质细胞和星型胶质细胞激活，加速神经纤维丝缠结的形成，长期作用后导致认知障碍。近期大量研究提供了多方面的证据支持“Aβ假说”，显示了Aβ在阿尔兹海默症致病机理中的核心作用。因此，研究Aβ产生和受调控机制是了解阿尔兹海默症致病机理的重要基础。 

Aβ由I型跨膜蛋白淀粉样前体蛋白(Amyloid Precursor Protein，APP)经过β-分泌酶和γ-分泌酶介导的蛋白质酶解作用产生：β-分泌酶和γ-分泌酶分别作用于APP的Aβ结构域的氨基端和羧基端，顺序剪切产生完整的Aβ。APP还能够被α-分泌酶剪切作用于Aβ结构域内，导致形成不完整的Aβ肽段。 

Aβ的主要产生机制为：APP经过β-分泌酶剪切作用形成两个片断，sAPPβ和C99，C99经过γ-分泌酶的剪切作用产生Aβ。淀粉样蛋白前体蛋白也能够被α-分泌酶剪切形成sAPPα和C83两个片断，但是无法产生Aβ。Aβ分泌到细胞外后形成寡聚体，并且进一步沉淀形成淀粉样蛋白斑。 

γ-分泌酶在Aβ产生中的作用是至关重要的，它在APP内部不同位点上的酶切作用决定了产生的Aβ的种类(主要为分别由40和42个氨基酸构成的Aβ₄₀和Aβ₄₂)。近年的研究发现γ-分泌酶是一种复杂的蛋白质复合体，由早老蛋白(Presenilin)、 Nicastrin、APH-1(anterior pharynx defective 1)和PEN-2(presenilin enhancer 2)等四种跨膜蛋白质组装形成，它们是构成具有酶活性的γ-分泌酶的必需组分。早老蛋白是γ-分泌酶复合体的蛋白酶催化亚基，其位于第6和第7跨膜区的第257位和第385位天冬氨酸残基是蛋白酶的活性位点。遗传型阿尔兹海默症人中存在一百多种早老蛋白错义突变。这些突变改变了γ-分泌酶的活性，使其更容易产生神经毒性更大的Aβ42。Nicastrin是识别底物的功能亚基，APH-1A是γ-分泌酶复合体组装的支架蛋白，PEN-2的主要功能是启动γ-分泌酶的成熟和激活并且稳定γ-分泌酶复合体。最近的研究报道了一些分子，如TMP21和Rer1p，存在于γ-分泌酶复合体中并且能够调控其活性，它们可能是γ-分泌酶的非必需组分。 

抑制蛋白(Arrestin)基因家族有四个成员，包括在各器官组织广泛分布的β-抑制蛋白1(β-Arrestin1)和β-抑制蛋白2(β-Arrestin2)，以及在视觉系统中表达的rod Arrestin和cone Arrestin。β-Arrestin在静息状态下是一个长链分子，由两个不同的结构域(氨基端结构域和羧基端结构域)经由12个氨基酸组成的铰链结构连接而成。这两个结构域由于分子间的作用力保持互相独立，在它们中间有一个被埋藏的极性内核。虽然β-Arrestin与不同的蛋白相互作用，但是迄今尚未发现β-Arrestin中有明确的发生蛋白质-蛋白质相互作用的特异结构域。β-Arrestin特异性地识别磷酸化蛋白，其对磷酸化形式的作用对象亲和力远高于非磷酸化形式。 

β-Arrestin最初是作为G蛋白偶联受体信号的终止因子被发现的。β-Arrestin通过与激活的受体结合导致受体脱敏和内吞，从而终止了G蛋白的信号。当激动剂持续作用时，受体对激动剂的反应性会随时间而很快地减弱，这就是受体的脱敏反应，体现了细胞对于受体信号在时间和强度上精确的调控。受体的脱敏效应是由一系列反应组成，当激动剂激活受体后，G蛋白偶联受体激酶也被激活并且磷酸化活化的受体，受体被磷酸化后发生构象改变，与β-Arrestin的亲和力增加，促使β-Arrestin从细胞质中快速转位到细胞膜并与受体紧密结合，阻断了受体与G蛋白的进一步结合，受体的信号即被终止。 

调控受体脱敏作用是β-Arrestin经典的功能。后来的发现表明β-Arrestin通过结合各种信号分子，还可以参与调控其他信号通路。β-Arrestin可以促进受体信号转导，在激动剂存在的条件下，β-Arrestin将c-Src招募到β₂AR上，促进了MAPK的激活。这种招募作用导致了对多种生理活动的调控，如嗜中性粒细胞的胞吐、NK1受体介导的抗凋亡功能以及内皮肽刺激葡萄糖转运蛋白的转位。β-Arrestin可以调控MAPK的激活。由于在MAPK级联通路中，一个上游的激酶可以激活许多下游激酶，生物体就需要组织特定的MAPK信号途径，来保证信号转导的特异性、重复性和高效性。β-Arrestin作为支架蛋白介导相应激酶的相互作用，保证它们形成完整的信号转导复合体，同时也使这个复合体处于细胞内特定的区域，从而与磷酸酯酶相隔离，避免激酶失活。 

除了结合传统的G蛋白偶联受体外，β-Arrestin也能结合其它类型的受体，并且 影响其内吞和转运作用，如Frizzled、Smoothened、Notch、III型转化生长因子β受体(type III transforming growth factor-βreceptor)、低密度脂蛋白受体(low-densitylipoprotein receptor)、Na⁺/H⁺交换转运子(Na⁺/H⁺exchanger 5transporter)。 

β-Arrestin在中枢神经系统中各个区域都有表达。在大脑内，β-Arrestin1的mRNA水平比β-Arrestin2高2-3倍，β-Arrestin1的蛋白质水平比β-Arrestin2更是高出10-20倍。研究显示，β-Arrestin2参与调控阿片成瘾和多巴胺依赖的行为。但是β-Arrestin1在中枢神经系统的生理和病理中的作用并不明确。 

鉴于β-Arrestin在调控信号通路中的重要作用，研究其在疾病中的作用有助于揭示致病机理，更深入地了解疾病的发病原因。 

发明内容

在本发明的第一方面，提供了一种降低β-抑制蛋白1与APH-1蛋白的结合的物质的用途，用于制备预防、缓解或治疗神经退行性疾病的组合物。 

在另一优选例中，所述的神经退行性疾病是以脑内形成淀粉样蛋白斑为特征的神经退行性疾病。 

在另一优选例中，所述的神经退行性疾病是阿尔兹海默症或帕金森症。 

在另一优选例中，所述的降低β-抑制蛋白1与APH-1蛋白的结合选自：降低β-抑制蛋白1的表达或者抑制β-抑制蛋白1的功能；降低APH-1蛋白的表达或者抑制APH-1蛋白的功能；干扰或者抑制β-抑制蛋白1与APH-1蛋白的结合；或减弱β-抑制蛋白1与APH-1蛋白的相互作用。 

在另一优选例中，所述的APH-1蛋白选自APH-1AL蛋白或APH-1B蛋白。 

在另一优选例中，所述降低β-抑制蛋白1与APH-1蛋白的结合的物质选自：(a)含有SEQ ID NO:33中第246-265位氨基酸序列的蛋白片段；(b)含有SEQ ID NO:33中第235-265位氨基酸序列的蛋白片段；(c)含有SEQ ID NO:34中第234-257位氨基酸序列的蛋白片段；(d)将(a)-(c)任一的蛋白片段的氨基酸序列经过一个或多个(如1-5个，更佳地1-3个，更佳地1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)-(c)蛋白片段功能的多肽；并且，所述的蛋白片段不包括具有全长APH-1AL蛋白或APH-1B氨基酸序列的蛋白。 

在另一优选例中，所述降低β-抑制蛋白1与APH-1蛋白的结合的物质选自：(i)氨基酸序列如SEQ ID NO:33中第246-265位的蛋白片段；(ii)氨基酸序列如SEQ ID NO:33中第235-265位的蛋白片段；或(iii)氨基酸序列如SEQ ID NO:34中第234-257位的蛋白片段。 

在另一优选例中，所述的抑制β-抑制蛋白1活性的物质是特异性结合β-抑制蛋白 1的抗体，或特异性干扰β-抑制蛋白1表达的小干扰分子，或表达小干扰分子的载体或病毒(如慢病毒)。 

在另一优选例中，所述的小干扰分子具有SEQ ID NO:23所示的序列。 

在本发明的另一方面中，提供了一种分离的β-抑制蛋白1的蛋白片段，所述的蛋白片段选自：(1)含有SEQ ID NO:1中第241-360位氨基酸序列的蛋白片段；(2)含有SEQ ID NO:1中第181-418位氨基酸序列的蛋白片段；或(3)含有SEQ ID NO:1中第241-418位氨基酸序列的蛋白片段。并且，所述的蛋白片段不包括具有SEQ ID NO:1全长氨基酸序列的蛋白。 

在本发明的另一方面中，提供了一种β-抑制蛋白1或其蛋白片段的用途，用于制备或筛选特异性抑制β-抑制蛋白1或其蛋白片段的物质，所述的物质是预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质。 

在本发明的另一方面中，提供了一种分离的APH-1蛋白片段，选自：(a)含有SEQID NO:33中第246-265位氨基酸序列的蛋白片段；(b)含有SEQ ID NO:33中第235-265位氨基酸序列的蛋白片段；(c)含有SEQ ID NO:34中第234-257位氨基酸序列的蛋白片段；(d)将(a)-(c)任一的蛋白片段的氨基酸序列经过一个或多个(如1-5个，更佳地1-3个，更佳地1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)-(c)蛋白片段功能的多肽；并且，所述的蛋白片段不包括具有全长APH-1AL蛋白或APH-1B氨基酸序列的蛋白。 

在另一优选例中，所述的APH-1蛋白片段选自：(i)氨基酸序列如SEQ ID NO:33中第246-265位的蛋白片段；(ii)氨基酸序列如SEQ ID NO:33中第235-265位的蛋白片段；或(iii)氨基酸序列如SEQ ID NO:34中第234-257位的蛋白片段。 

在另一优选例中，所述的APH-1蛋白片段的N端或C端还包括反式激活蛋白(TAT-tag)；较佳地，所述的反式激活蛋白具有SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。 

在本发明的另一方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码前面任一所述的蛋白片段。 

在本发明的另一方面，提供了一种筛选预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括： 

以β-抑制蛋白1或其蛋白片段(优选本发明上述的蛋白片段)作为筛选的靶点，选出特异性抑制该靶点的物质，所述的物质是预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质。 

在本发明的一个实施方式中，所述的方法包括： 

(1)将候选物质与表达β-抑制蛋白1或其蛋白片段的体系接触； 

(2)检测候选物质对β-抑制蛋白1或其蛋白片段的影响； 

若所述候选物质抑制β-抑制蛋白1或其蛋白片段的表达或活性，则表明该候选物质是预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质。 

在另一优选例中，所述的方法中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达β-抑制蛋白1或其蛋白片段的体系中；和/或步骤(2)包括：检测测试组的体系中β-抑制蛋白1或其蛋白片段的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达β-抑制蛋白1或其蛋白片段的体系；如果测试组中β-抑制蛋白1或其蛋白片段的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，如低20%以上，较佳的低50%以上；更佳的低80%以上)对照组，就表明该候选物质是预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质。较佳地，所述的候选物质包括(但不限于)：针对β-抑制蛋白1或其上游或下游蛋白设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物等。 

在本发明的另一方面中，提供了一种蛋白复合体，所述复合体包括：β-抑制蛋白1或其蛋白片段，所述蛋白片段包含SEQ ID NO:1中第241-360位氨基酸序列；和APH-1蛋白(如APH-1AL蛋白或APH-1B蛋白)或权利要求9所述的APH-1蛋白片段。 

在本发明的另一方面中，提供了一种筛选预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括： 

以所述的蛋白复合体作为筛选的靶点，选出特异性抑制所述蛋白复合体形成的物质，所述的物质是预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质。 

在本发明的另一个实施方式中，所述的方法包括：(1)将候选物质与含有本发明蛋白复合体的体系接触；(2)检测候选物质对所述蛋白复合体的影响；若所述候选物质抑制所述蛋白复合体中的蛋白相互作用(如相互结合)减弱，则表明该候选物质是预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质。 

在另一优选例中，所述的方法中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述含有蛋白复合体的体系中；和/或步骤(2)包括：检测测试组的体系中蛋白复合体中蛋白的相互作用情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的含有所述蛋白复合体的体系；如果测试组中蛋白复合体中蛋白的相互作用在统计学上弱于(优选显著弱于，如弱20%以上，较佳的弱50%以上；更佳的弱80%以上)对照组，就表明该候选物质是预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质。较佳地， 所述的候选物质包括(但不限于)：针对所述蛋白复合体中任一蛋白设计的蛋白片段、干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物等。 

在本发明的另一方面中，提供了一种筛选预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)将候选物质与含有(如表达)β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的体系接触；(2)检测候选物质对β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的相互作用的影响；若所述候选物质抑制β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的相互作用，则表明该候选物质是预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质。较佳地，所述的方法中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述含有(如表达)β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的体系中；和/或步骤(2)包括：检测测试组的体系中β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的相互作用情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的含有β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的体系；如果测试组中β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的相互作用在统计学上弱于(优选显著弱于，如弱20%以上，较佳的弱50%以上；更佳的弱80%以上)对照组，就表明该候选物质是预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质。较佳地，所述的候选物质包括(但不限于)：针对所述β-抑制蛋白1或APH-1蛋白设计的蛋白片段、干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物等。更佳地，检测候选物质对β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的相互作用的影响包括：检测β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的相互结合，若它们的相互结合在统计学上减弱(优选显著弱于，如弱20%以上，较佳的弱50%以上；更佳的弱80%以上)，就表明该候选物质是预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质；或检测β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的作用时间，若它们的作用时间在统计学上减少(优选显著减少，如减少20%以上，较佳的减少50%以上；更佳的减少80%以上)，就表明该候选物质是预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质；或检测β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的有效结合能力，若它们的有效结合在统计学上减少(优选显著减少，如减少20%以上，较佳的减少50%以上；更佳的减少80%以上)，就表明该候选物质是预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质。更佳地，检测候选物质对β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的相互作用的影响包括：检测β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段形成的复合体的数量，若所述的复合体的数量在统计学上减少(优选显著减少， 如减少20%以上，较佳的减少50%以上；更佳的减少80%以上)，就表明该候选物质是预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质。更佳地，检测候选物质对β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的相互作用的影响包括：检测γ-分泌酶复合体的数量或蛋白酶活性，若所述的复合体的数量或蛋白酶活性在统计学上减少(优选显著减少，如减少20%以上，较佳的减少50%以上；更佳的减少80%以上)，就表明该候选物质是预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质。 

在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于预防或治疗神经退行性疾病有用的物质。 

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。 

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。 

附图说明

图1.阿尔兹海默症人组织中的β-Arrestin表达。用Western杂交实验检测Braak0-VI期的病人组织样品。用抗β-Arrestin抗体A2CT和兔抗Actin抗体分别检测β-Arrestin和Actin的表达，以肌动蛋白(Actin)作为上样量对照。其中，βarr1表示β-Arrestin1；βarr2表示β-Arrestin2。 

图2.阿尔兹海默症人组织中的β-Arrestin1表达。用Western杂交实验检测Braak0-VI期的病人组织样品。用抗β-Arrestin抗体A2CT和兔抗Actin抗体分别检测β-Arrestin1和Actin的表达，分别测量和统计β-Arrestin1和Actin的信号值，以Actin作为上样量对照。图示每一圆点代表一样品，短横线代表该组平均值。**P<0.01，***P<0.001。 

图3.阿尔兹海默症人组织中的β-Arrestin2表达。用Western杂交实验检测Braak0-VI期的病人组织样品。用A2CT和兔抗Actin抗体分别检测β-Arrestin2和Actin的表达，分别测量和统计β-Arrestin2和Actin的信号值，以Actin作为上样量对照。图示每一圆点代表一样品，短横线代表该组平均值。**P<0.01。 

图4.阿尔兹海默症人组织中的β-Arrestin1表达。分别用基因芯片(左图)和定量PCR实验(右图)检测Braak 0-VI期的病人组织样品中β-Arrestin1的mRNA表达水平。图示每一圆点代表一样品，短横线代表该组平均值。 

图5.免疫组织化学实验检测人大脑组织中的β-Arrestin1分布。用A1CT抗体染色检测β-Arrestin1在健康人(ND)和阿尔兹海默症人(AD)皮层组织中的β-Arrestin1在神经元(用长箭头表示)和星型胶质细胞(用短箭头表示)中的分布。 

图6.TgCRND8小鼠组织中的β-Arrestin表达。用Western杂交实验检测野生型(WT)和TgCRND8小鼠组织样品。用A2CT和兔抗Actin抗体分别检测β-Arrestin和Actin的表达，分别测量和统计β-Arrestin1、β-Arrestin2和Actin的信号值，以Actin作为上样量对照。*P<0.05，***P<0.001。 

图7.APP/PS1小鼠组织中的β-Arrestin表达。用Western杂交实验检测野生型(WT)和APP/PS1小鼠组织样品。用A2CT和兔抗Actin抗体分别检测β-Arrestin和Actin的表达，分别测量和统计β-Arrestin1、β-Arrestin2和Actin的信号值，以Actin作为上样量对照。**P<0.01。 

图8.免疫组织化学实验检测小鼠大脑组织中的β-Arrestin1表达。用A1CT抗体染色检测β-Arrestin1在野生型、TgCRND8和β-Arrestin1基因敲除(KO)小鼠皮层和海马组织中的β-Arrestin1表达。 

图9.β-Arrestin1基因敲除小鼠组织中的Aβ水平。用酶联免疫吸附实验检测野生型(WT)和β-Arrestin1基因敲除(KO)小鼠皮层(Cx)和海马(Hp)组织样品中的Aβ₄₀和Aβ₄₂水平。β-Arrestin1基因敲除引起皮层和海马组织中的Aβ₄₀和Aβ₄₂水平下降。n=4-5；*P<0.05，**P<0.01。 

图10.β-Arrestin1基因敲除小鼠组织中的APP表达。用Western杂交实验检测野生型(WT)和β-Arrestin1基因敲除(KO)小鼠海马(Hp)组织样品中全长APP、APP-CTFα(C83)和APP-CTFβ(C99)表达，以Actin为上样量对照。左图为代表性的Western杂交实验结果。右图为全长APP、APP-CTFα和APP-CTFβ的Western杂交信号测量统计图。n=3-5；*P<0.05。 

图11.β-Arrestin1基因敲除小鼠组织中的分泌酶蛋白酶活性。用荧光底物活性实验检测野生型(WT)和β-Arrestin1基因敲除(KO)小鼠海马(Hp)组织样品中α-、β-和γ-分泌酶的蛋白酶活性。n=4；**P<0.01。 

图12.原代培养神经元(Neuron)和Neuro-2a神经母细胞瘤细胞的β-Arrestin表达。原代培养神经元和Neuro-2a神经母细胞瘤细胞转染对照(NS)和β-Arrestin1(βarr1)小干扰RNA(左图)，或者转染HA标记的野生型β-Arrestin1(右图)，用Western杂交实验检测内源(A2CT抗体)或者外源(抗HA抗体)表达的β-Arrestin。 

图13.抑制β-Arrestin1表达下调Aβ水平。原代培养神经元(左图)和Neuro-2a神经母细胞瘤细胞(右图)转染对照(NS)和β-Arrestin1(βarr1)小干扰RNA，用酶联免疫吸附实验检测细胞培养基中的Aβ₄₀和Aβ₄₂水平。数据为3次实验结果，表示为平均值±标准误差。*P<0.05，**P<0.01。 

图14.过表达β-Arrestin1表达上调Aβ水平。原代培养神经元(左图)和Neuro-2a神经母细胞瘤细胞(右图)转染对照(Con)和β-Arrestin1(βarr1)质粒，用酶联免疫吸附实验检测细胞培养基中的Aβ₄₀和Aβ₄₂水平。数据为3次实验结果，表示为平均值±标准误差。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。 

图15.抑制β-Arrestin1表达下调γ-分泌酶活性。原代培养神经元(左图)和Neuro-2a 神经母细胞瘤细胞(右图)转染对照(NS)和β-Arrestin1(βarr1)小干扰RNA，用分泌酶荧光底物活性实验检测细胞的分泌酶蛋白酶活性。数据为3次实验结果，表示为平均值±标准误差。*P<0.05，**P<0.01。 

图16.过表达β-Arrestin1表达上调γ-分泌酶活性。 

原代培养神经元(左图)和Neuro-2a神经母细胞瘤细胞(右图)转染对照(Con)和β-Arrestin1(βarr1)质粒，用γ-分泌酶荧光底物活性实验检测细胞的γ-分泌酶蛋白酶活性。数据为3次实验结果，表示为平均值±标准误差。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。 

图17.抑制内吞转运途径不影响β-Arrestin1上调γ-分泌酶活性。Neuro-2a神经母细胞瘤细胞转染多克隆位点携带Rab5S34N和Rab7T22N蛋白的编码序列的表达质粒，用γ-分泌酶荧光底物活性实验检测细胞的γ-分泌酶蛋白酶活性。数据为3次实验结果，表示为平均值±标准误差。 

图18.β-Arrestin1结合APH-1AL。HEK293T细胞分别共转染FLAG偶联的β-Arrestin1(βarr1)和HA偶联的PS1-NTF、PS1-CTF、Nicastrin(NCT)、APH-1AL或PEN-2。转染48小时后裂解细胞，用偶联抗FLAG抗体的琼脂糖凝胶免疫沉淀β-Arrestin1。Western杂交实验显示APH-1AL被共沉淀，PS1-NTF、PS1-CTF、Nicastrin和PEN-2不被共沉淀。 

图19.β-Arrestin1和APH-1AL在细胞内的共定位。HEK293T细胞共转染FLAG偶联的β-Arrestin1(βarr1)和HA偶联的APH-1AL，用Cy3偶联的抗FLAG抗体和FITC偶联的抗HA抗体染色，用激光共聚焦显微镜观察细胞样品并获取图像。 

图20.β-Arrestin1不结合APP和BACE1。HEK293T细胞分别共转染FLAG偶联的β-Arrestin1(βarr1)和HA偶联的APH-1AL、APP或BACE1。转染48小时后裂解细胞，用偶联抗HA抗体的琼脂糖凝胶免疫沉淀APH-1AL、APP和BACE1。Western杂交实验显示APH-1AL被共沉淀，APP和BACE1不被共沉淀。 

图21.激活β2AR不影响β-Arrestin1结合APH-1AL。HEK293T细胞共转染了β2AR、FLAG偶联的β-Arrestin1(βarr1)和HA偶联的APH-1AL，用10μM的isoproterenol(ISO)刺激不同时间后进行免疫共沉淀实验。 

图22.β-Arrestin1不结合APH-1AS。HEK293T细胞分别共转染HA偶联的β-Arrestin1(βarr1)和FLAG偶联的APH-1AL、APH-1AS或APH-1B。转染48小时后裂解细胞，用偶联抗HA抗体的琼脂糖凝胶免疫沉淀β-Arrestin1。Western杂交实验显示APH-1AL和APH-1B被共沉淀，APH-1AS不被共沉淀。 

图23.内源表达β-Arrestin1结合APH-1AL。HEK293T细胞裂解后用抗β-Arrestin1抗体A1CT免疫沉淀β-Arrestin1。Western杂交实验显示内源表达的β-Arrestin1被共沉淀。共孵育50μM的CT20则竞争了β-Arrestin1和APH-1AL的共沉淀。 

图24.人大脑组织中含有APH-1AL的γ-分泌酶的蛋白酶活性和复合体蛋白质水平。健康人(ND)和病人(AD)大脑皮层组织用抗APH-1AL抗体A1.2进行免疫共沉淀实验。共孵育50μM的CT20则竞争了A1.2对于APH-1AL免疫沉淀。用γ-分泌酶荧光底物活性实验检测沉淀复合物的γ-分泌酶蛋白酶活性。(n=10)；***P<0.001。 

图25.用Western杂交实验显示沉淀复合物的γ-分泌酶组分分子(N1表示正常人1号、N2表示正常人2号、A1表示AD病人1号、A2表示AD病人2号)。 

图26.激活β2AR不影响含有APH-1AL的γ-分泌酶复合体蛋白质水平。HEK293T细胞用10μM的异丙基肾上腺素(Isoproterenol，ISO)刺激不同时间后用抗APH-1AL抗体A1.2进行免疫共沉淀实验。 

图27.β-Arrestin1突变体构建示意图，这些突变体的γ-分泌酶活性和APH-1AL结合性。 

图28.β-Arrestin1突变体和APH-1AL的免疫共沉淀。HEK293T细胞共转染带有HA标记的β-Arrestin1突变体和带有FLAG标记的APH-1AL质粒，用免疫共沉淀实验分析β-Arrestin1突变体和APH-1AL的相互作用。 

图29.β-Arrestin1突变体对γ-分泌酶活性的作用。Neuro-2a神经母细胞瘤细胞转染多克隆位点携带如图所示蛋白突变体编码序列的表达质粒，用γ-分泌酶荧光底物活性实验检测细胞的γ-分泌酶蛋白酶活性。数据为3次实验结果，表示为平均值±标准误差。*P<0.01。 

图30.甘油梯度分离β-Arrestin1基因敲除小鼠海马的γ-分泌酶复合体。野生型(WT)和β-Arrestin1基因敲除(KO)小鼠的海马组织提取物经10-30%甘油梯度分别分离为20个组分，用Western杂交实验(上图)检测每一个组分的PS1-NTF、PS1-CTF、Nicastrin(NCT)、APH-1A、PEN-2、β-Arrestin和APP的表达。 

图31.β-Arrestin1基因敲除小鼠海马组织中的γ-分泌酶组分分子表达水平下调。野生型(WT)和β-Arrestin1基因敲除(KO)小鼠的海马组织提取物用Western杂交实验检测PS1-NTF、Nicastrin(NCT)、APH-1AL、PEN-2和Actin的表达。经分析统计后计算PS1-NTF、Nicastrin(NCT)、APH-1AL和PEN-2的信号相对于Actin信号的比值，作为其相对表达量。(n=8)；*P<0.05，***P<0.001。 

图32.甘油梯度分离β-Arrestin1基因敲除小鼠海马的γ-分泌酶复合体。野生型(WT)和β-Arrestin1基因敲除(KO)小鼠的海马组织提取物经10-30%甘油梯度分别分离为20个组分，用γ-分泌酶荧光底物活性实验检测每一个组分的γ-分泌酶蛋白酶活性。插入小图为第8组分中的γ-分泌酶比活。(n=3)；*P<0.05，**P<0.01。 

图33.甘油梯度分离β-Arrestin1基因敲除小鼠海马的γ-分泌酶复合体。野生型(WT)和β-Arrestin1基因敲除(KO)小鼠的海马组织提取物经10-30%甘油梯度分别分离 为20个组分，用抗APH-1AL抗体A1.2免疫沉淀第8号组分中含有APH-1AL的γ-分泌酶，Western杂交实验显示沉淀复合物的γ-分泌酶组分分子。 

图34.甘油梯度分离β-Arrestin1基因敲除小鼠海马的γ-分泌酶复合体。野生型(WT)和β-Arrestin1基因敲除(KO)小鼠的海马组织提取物经10-30%甘油梯度分别分离为20个组分，用抗APH-1AL抗体A1.2免疫沉淀第8号组分中含有APH-1AL的γ-分泌酶，γ-分泌酶荧光底物活性实验检测沉淀复合物的γ-分泌酶蛋白酶活性。(n=3)；*P<0.05。 

图35.甘油梯度分离Neuro-2a神经母细胞瘤细胞的γ-分泌酶复合体。分别转染了β-gal、野生型β-Arrestin1或1-240突变体质粒的Neuro-2a神经母细胞瘤细胞提取物经10-30%甘油梯度分别分离为20个组分，用Western杂交实验检测每一个组分的PS1-NTF、PS1-CTF、Nicastrin(NCT)、APH-1A和β-Arrestin的表达。 

图36.甘油梯度分离Neuro-2a神经母细胞瘤细胞的γ-分泌酶复合体。分别转染了β-gal、野生型β-Arrestin1或1-240突变体质粒的Neuro-2a神经母细胞瘤细胞提取物经10-30%甘油梯度分别分离为20个组分，用γ-分泌酶荧光底物活性实验检测每一个组分的γ-分泌酶蛋白酶活性。插入小图为第8组分中的γ-分泌酶比活。**P<0.01。 

图37.β-Arrestin1影响γ-分泌酶复合体的组装。分别转染了对照和β-Arrestin1小干扰RNA的野生型(WT)和早老蛋白基因敲除(KO)小鼠胚胎上皮细胞用抗APH-1AL抗体(A1.2)免疫沉淀γ-分泌酶复合体。Western杂交实验检测免疫沉淀产物中的β-Arrestin、Nicastrin、PS1(PS1-NTF)、PEN-2和APH-1AL。 

图38.抑制内源β-Arrestin1表达减少TgCRND8小鼠的淀粉样蛋白斑。双侧海马分别注射了表达LacZ(Lenti-siLacZ)和β-Arrestin1小干扰RNA的慢病毒(Lenti-siArrb1)的TgCRND8小鼠的大脑切片图像。通过观察慢病毒表达的GFP荧光检测慢病毒在小鼠双侧海马组织中的表达位置和强度。用抗β-Arrestin1抗体A1CT通过免疫组织化学实验检测小鼠双侧海马组织中的内源β-Arrestin1。用抗Aβ抗体6E10通过免疫组织化学实验检测小鼠双侧海马和皮层组织中的淀粉蛋白斑。标尺所示长度代表400μm。 

图39.抑制内源β-Arrestin1表达减少TgCRND8小鼠的淀粉样蛋白斑。通过软件分析TgCRND8小鼠的大脑切片图像，统计和计算双侧海马和皮层组织中的淀粉样蛋白斑所占图像面积的百分比。(n=10)；**P<0.01。 

图40.抑制内源β-Arrestin1表达减少TgCRND8小鼠的Aβ水平。从双侧海马分别注射了表达LacZ和β-Arrestin1小干扰RNA的慢病毒的TgCRND8小鼠的大脑组织中分离出海马(左图)和皮层(右图)组织，用表面活性剂(SDS)和甲酸(FA)提取蛋白质，用酶联免疫吸附实验检测蛋白质提取物中的Aβ₄₀和Aβ₄₂水平。测量数值表示为μg/g组织湿重。(n=10)；*P<0.05，***P<0.001。 

图41.抑制内源β-Arrestin1表达降低TgCRND8小鼠的γ-分泌酶活性。从双侧海马分别注射了表达LacZ和β-Arrestin1小干扰RNA的慢病毒的TgCRND8小鼠的大脑组织中分离出海马(Hp)和皮层(Cx)组织，用γ-分泌酶荧光底物活性实验检测蛋白 质提取物中的γ-分泌酶活性。(n=5)；**P<0.01。 

图42.过表达β-Arrestin1表达增加TgCRND8小鼠的淀粉样蛋白斑。海马分别注射了表达对照、野生型β-Arrestin1和1-240突变体慢病毒的TgCRND8小鼠的大脑切片图像。通过观察慢病毒表达的GFP荧光检测慢病毒在小鼠海马组织中的表达位置和强度。用抗Aβ抗体6E10通过免疫组织化学实验检测小鼠海马和皮层组织中的淀粉蛋白斑。标尺所示长度代表400μm。 

图43.过表达β-Arrestin1表达增加TgCRND8小鼠的淀粉样蛋白斑。通过软件分析TgCRND8小鼠的大脑切片图像，统计和计算双侧海马和皮层组织中的淀粉样蛋白斑所占图像面积的百分比。(n=6)；**P<0.01。 

图44.过表达β-Arrestin1表达增加TgCRND8小鼠的Aβ水平。从海马分别注射了表达对照、野生型β-Arrestin1和1-240突变体慢病毒的TgCRND8小鼠的大脑组织中分离出海马(左图)和皮层(右图)组织，用表面活性剂(SDS)和甲酸(FA)提取蛋白质，用酶联免疫吸附实验检测蛋白质提取物中的Aβ₄₀和Aβ₄₂水平。测量数值表示为μg/g组织湿重。(n=6)；*P<0.05，**P<0.01。 

图45.抑制内源β-Arrestin1表达降低TgCRND8小鼠的γ-分泌酶活性。从海马分别注射了对照、野生型β-Arrestin1和1-240突变体慢病毒的TgCRND8小鼠的大脑组织中分离出海马(Hp)和皮层(Cx)组织，用γ-分泌酶荧光底物活性实验检测蛋白质提取物中的γ-分泌酶活性。(n=6)；***P<0.001。 

图46.β-arrestin1敲除对APP/PS1小鼠认知记忆的影响。利用新颖性探求实验研究βarr+/+，βarr-/-，βarr+/+APP/PS1，βarr-/-APP/PS1小鼠对相同物体的偏好得分(Preference score)以及对不同物体的认知指数(Recognition Index)。并利用One-wayANOVA结合post hoc tests进行事后检验分析认知指数，P<0.0001(βarr+/+vs.βarr+/+APP/PS1,P<0.001；βarr+/+APP/PS1vs.βarr-/-APP/PS1,P<0.001)。 

图47.β-arrestin1敲除改善APP/PS1小鼠在不可见平台训练中的表现。在Morris水迷宫实验不可见平台训练中，记录每只小鼠每天每次找到平台的时间后进行统计。Two-way ANOVA分析结合Tukey post hoc tests进行事后检验，表明β-arrestin1敲除显著减低APP/PS1小鼠在不可见平台训练中找到平台的时间(n=7-9，βarr1-/-APP/PS1vs.βarr1+/+APP/PS1小鼠，P=0.0145)。 

图48.β-arrestin1敲除改善APP/PS1小鼠在probe trial中的表现。在Morris水迷宫实验probe trial中，记录每只小鼠在水池中的探索轨迹及时间进行统计。One-wayANOVA结合post hoc tests进行事后检验分析在目标象限中搜寻的时间，P=0.0151(βarr1+/+小鼠vs.βarr1+/+APP/PS1小鼠，P<0.05；βarr1+/+APP/PS1小鼠vs.βarr1-/-APP/PS1小鼠，P<0.05)。 

图49.小鼠在Morris水迷宫实验probe trial中的游泳距离和游泳速度。 

图50.β-arrestin1敲除显著减少APP/PS1小鼠脑组织中的β-淀粉样蛋白沉淀斑块。图示的三种基因型小鼠(βarr+/+，βarr+/+APP/PS1，βarr-/-APP/PS1)麻醉后进行心 脏灌流，取大脑半球进行PFA固定及蔗糖脱水后进行冰冻切片。用anti-Aβ抗体对大脑冰冻切片中的β-淀粉样蛋白沉淀斑块进行染色，图像由ZEISS OBSERVER Z1显微镜获得，用Image-Pro Plus 5.1统计阳性信号斑块的像素点。(n=4-5，*P<0.05)。 

图51.β-arrestin1敲除显著降低APP/PS1小鼠脑中海马区及皮层区的可溶性及不可溶性的Aβ40和Aβ42含量。图示的三种基因型小鼠(βarr+/+，βarr+/+APP/PS1，βarr-/-APP/PS1)麻醉后进行心脏灌流，取大脑半球剥离海马及皮层区，用SDS提取可溶性Aβ，用甲酸提取不可溶性Aβ，进行酶联免疫吸附实验(ELISA)实验，检测小鼠脑组织中的Aβ40和Aβ42含量。(n=4-5，*P<0.05，**P<0.01)。 

图52.β-arrestin1敲除显著降低APP/PS1小鼠脑组织中γ-分泌酶活性。图示的两种基因型小鼠(βarr+/+APP/PS1，βarr-/-APP/PS1)麻醉后进行心脏灌流，取大脑半球剥离海马区，用荧光底物酶活实验检测α-,β-及γ-分泌酶活性。(n=4-5，***P<0.001)。 

图53.β-arrestin1敲除降低APP/PS1小鼠脑组织中γ-分泌酶全酶复合体的形成。图示的两种基因型小鼠(βarr+/+APP/PS1，βarr-/-APP/PS1)麻醉后进行心脏灌流，取大脑半球剥离海马区，用BN-PAGE检测γ-分泌酶全酶复合体的形成。 

图54.根据APH-1AL和APH-1B的胞内环及羧基末端序列合成的短肽示意图。APH-1是一个七次跨膜蛋白，包含3个胞外环、3个胞内环和1个羧基末端。由于β-arrestin1是胞浆蛋白，因此β-arrestin1只能结合到APH-1的这些胞内部分，所以根据APH-1AL的胞内环及羧基末端合成了AL1、AL3、AL5和ACT；根据APH-1B的胞内环及羧基末端合成了BL1、BL3、BL5和BCT。 

图55.根据APH-1AL和APH-1B的胞内环及羧基末端序列合成的短肽序列。红色部分为对应胞内环及羧基末端的序列，其中红色下划线部分为比较短的胞内环，合成时对其进行了三重复；在短肽N端加上了TAT-tag以及FITC荧光标记便于检测是否有效进入细胞。 

图56.FITC-TAT-tagged短肽有效进入细胞。HEK293细胞用10μM ACT短肽处理40小时后，用新鲜培养基洗一次后更换培养基。活细胞图像由ZEISS OBSERVERZ1 microscope (Carl Zeiss)配备AxioCamMR3 digital camera及AxioVisionsoftware(Carl Zeiss)获得。结果显示，FITC-TAT-tagged短肽ACT可以有效进入细胞。 

图57.FITC-TAT-tagged短肽对β-arrestin1与APH-1AL或者APH-1B的相互作用的影响。左图：HEK293T细胞共转染HA-β-arrestin1和Flag-APH-1AL，磷酸钙法转染8小时后更换培养基时加入10μM对应FITC-TAT-tagged短肽，转染48小时后(即短肽处理40小时后)用含1%TritonX-100的裂解液裂解细胞，进行免疫共沉淀及免疫印迹实验；右图：HEK293T细胞共转染HA-β-arrestin1和Flag-APH-1B，其它处理同左图。结果显示，只有ACT、BCT短肽可以抑制β-arrestin1与APH-1AL和APH-1B的相互作用，其它胞内环短肽对其相互作用没有显著影响。 

图58.FITC-TAT-tagged短肽对Aβ产生的影响。用1μM和10μM的FITC-TAT-tagged短肽分别处理APPswe HEK293稳转细胞株40小时后，收集细胞培 养基，用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定其中的总Aβtotal。数据为三次实验结果，表示为平均值±标准误差。***P<0.001。 

图59.FITC-TAT-tagged短肽对α-、β-及γ-分泌酶活性的影响。图25中的APPsweHEK293稳转细胞经FITC-TAT-tagged短肽处理40小时后，收集细胞，用荧光底物酶活实验检测细胞α-、β-及γ-分泌酶活性。结果显示，只有ACT、BCT短肽可以显著降低γ-分泌酶活性，而对α-或β-分泌酶活性并没有影响，其它胞内环短肽对α-、β-和γ-分泌酶活性都没有影响。数据为三次实验结果，表示为平均值±标准误差。*P<0.05。 

图60.ACT、BCT短肽对γ-分泌酶全酶复合体组装的影响。用10μM的FITC-TAT-tagged短肽(AL5、ACT、BCT)分别处理HEK293细胞40小时后，收集细胞，提取细胞膜进行BN-PAGE检测γ-分泌酶全酶复合体的形成。Mock为细胞培养基对照组。结果显示，ACT、BCT短肽可以有效抑制γ-分泌酶全酶复合体组装，而对照组短肽AL5则不能抑制其组装。 

图61.ACT、BCT短肽对NCT/APH-1前复合体组装的影响。PS1/2双敲除小鼠胚胎成纤维细胞转染β-arrestin1质粒，Fugene HD转染8小时后，更新培养基并用10μM的FITC-TAT-tagged短肽(AL5、ACT、BCT)分别处理PS1/2双敲除小鼠胚胎成纤维细胞40小时后，收集细胞，提取细胞膜进行BN-PAGE检测NCT/APH-1前复合体的形成。Mock为细胞培养基对照组。结果显示，ACT、BCT短肽可以有效抑制NCT/APH-1前复合体组装，而对照组短肽AL5则不能抑制其组装。 

图62.利用Split-TEV实验重现β-arrestin1与APH-1AL的相互作用。将β-arrestin1和APH-1AL分别与TEV酶的氮末端（NTEV）和TEV酶的羧基末端（CTEV）偶联，β-arrestin1与APH-1AL相互作用使得NTEV和CTEV靠近并发挥完整TEV酶活性并启动下游报告基因信号。 

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，首次发现β-Arrestin1表达水平的上升增加细胞的Aβ蛋白水平，从而加速疾病进程；并且还发现β-Arrestin1可与γ-分泌酶的一个必要组分APH-1(APH-1AL或APH-1B)相互作用，从而影响γ-分泌酶的活性。因此，可以以β-Arrestin1与APH-1的复合体作为靶点来筛选预防或治疗神经退行性疾病的药物。 

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。 

如本文所用，所述的“神经退行性疾病”是指一类与淀粉样前体蛋白代谢产生细胞毒性片段(如Aβ40，Aβ42)相关的神经退行性疾病，也即以脑内形成淀粉样 蛋白斑为特征的神经退行性疾病，如阿尔茨海默症(又称为老年性痴呆)。 

如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。 

β-Arrestin1或其蛋白片段 

在对阿尔茨海默症的研究过程中，本发明人发现β-Arrestin1在阿尔茨海默症患者以及模型小鼠的脑组织中选择性高表达。 

所述的β-Arrestin1蛋白包括全长的β-Arrestin1蛋白或其生物活性片段(或称为蛋白片段或活性片段)。例如，所述的β-Arrestin1蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:1所示的序列基本上相同。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的β-Arrestin1蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。β-Arrestin1蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。任何一种β-Arrestin1蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，β-Arrestin1蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的β-Arrestin1蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长β-Arrestin1蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长β-Arrestin1蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。 

作为本发明的优选方式，所述的β-Arrestin1蛋白的片段是包含SEQ ID NO:1中第241-360位氨基酸序列的蛋白。经验证，β-Arrestin1蛋白的上述生物活性片段保留了全长β-Arrestin1蛋白的生物活性。 

本发明还包括了编码所述β-Arrestin1蛋白片段的分离的核酸，也可以是其互补链。编码β-Arrestin1蛋白片段的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。在获得了编码所述的β-Arrestin1蛋白的生物活性片段的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。 

APH-1或其蛋白片段 

APH-1作为γ-分泌酶的组分，与β-Arrestin1蛋白相互结合，影响γ-分泌酶的活性，促进Aβ的产生。因此，APH-1(包括APH-1AL或APH-1B)可以作为药物筛选的靶点。 

所述的APH-1蛋白包括全长的APH-1蛋白或其生物活性片段(或称为蛋白片段或 活性片段)。例如，APH-1AL蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:33所示的序列基本上相同；APH-1B蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:34所示的序列基本上相同。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的APH-1蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。 

较佳地，所述APH-1AL蛋白或APH-1B的片段选自：(i)包含SEQ ID NO:33中第246-265位氨基酸序列的蛋白片段；(ii)包含SEQ ID NO:33中第235-265位氨基酸序列的蛋白片段；或(iii)包含SEQ ID NO:34中第234-257位氨基酸序列的蛋白片段；并且，所述的蛋白片段不包括具有全长APH-1AL蛋白或APH-1B氨基酸序列的蛋白。 

本发明人发现，APH-1AL蛋白或APH-1B的片段可以通过竞争性与β-抑制蛋白1或其片段结合，来组织APH-1与β-Arrestin1蛋白相互结合。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的(i)或(ii)或(iii)蛋白片段的衍生蛋白也包括在本发明中，只要其也能够发挥前述的竞争性抑制作用。一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。并且，能够保持(i)或(ii)蛋白片段的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性的蛋白也包含在本发明中。 

本发明还包括了编码(i)或(ii)或(iii)蛋白片段或其衍生蛋白的分离的核酸，也可以是其互补链。编码(i)或(ii)或(iii)蛋白片段的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。在获得了编码(i)或(ii)或(iii)蛋白片段的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。 

本发明还包括了包含编码所述(i)或(ii)或(iii)蛋白片段或其衍生蛋白的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。并且，含有编码所述(i)或(ii)或(iii)蛋白片段或其衍生蛋白的核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。 

抑制β-Arrestin1与APH-1相互作用的物质及其用途 

基于本发明的新发现，提供了一种抑制β-Arrestin1与APH-1(APH-1AL或APH-1B)相互作用的物质的用途，用于制备预防或治疗神经退行性疾病的组合物。 

所述的抑制β-Arrestin1与APH-1相互作用的物质包括：β-Arrestin1的抑制剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等；任何可降低β-Arrestin1蛋白的活性、降低β-Arrestin1蛋白的稳定性、抑制β-Arrestin1蛋白的表达、减少β-Arrestin1蛋白有效作用时间、抑制β-Arrestin1蛋白的分泌、或抑制β-Arrestin1的转录和翻译的物质。所述的抑制β-Arrestin1与APH-1相互作用的物质还包括：APH-1的抑制剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等；任何可降低APH-1蛋白的活性、降低APH-1蛋白的稳定性、抑制APH-1蛋白的表达、减少APH-1蛋白有效作用时间、抑制APH-1蛋白的分泌、或抑制APH-1的转录和翻译的物质。所述的抑制β-Arrestin1与APH-1相互作用的物质还包括：通过与β-Arrestin1或APH-1的部分或全部序列竞争性结合而减少两者相互结合的物质(例如，通过与APH-1蛋白结合来减少APH-1蛋白与β-抑制蛋白1结合的物质；或通过与β-抑 制蛋白1结合来减少APH-1蛋白与β-抑制蛋白1结合的物质)。上述物质均可用于本发明，作为对于防治阿尔茨海默症有效的物质 

作为本发明的优选方式，所述的抑制β-抑制蛋白1活性的物质是特异性结合β-抑制蛋白1的抗体，或特异性干扰β-抑制蛋白1表达的小干扰分子，或表达所述小干扰分子的载体或病毒(如慢病毒)。例如，所述的小干扰分子具有如SEQ ID NO:23的序列，其具有良好的干扰β-Arrestin1表达的效果。 

作为本发明的优选方式，所述的抑制β-抑制蛋白1活性的物质是APH-1AL蛋白或APH-1B的片段，其通过竞争性与β-抑制蛋白1或其片段结合，使得β-抑制蛋白1或其片段与APH-1AL蛋白或APH-1B发生结合的机率下降。优选地，APH-1AL蛋白或APH-1B的片段选自(i)包含SEQ ID NO:33中第246-265位氨基酸序列的蛋白片段；(ii)包含SEQ ID NO:33中第235-265位氨基酸序列的蛋白片段；或(iii)包含SEQID NO:34中第234-257位氨基酸序列的蛋白片段。 

较佳地，(i)或(ii)或(iii)的蛋白片段或其衍生蛋白还与入细胞引导物结合，以便于其能够更易于进入细胞内发挥作用，所述的“入细胞引导物(如穿膜肽)”是指一类具有细胞膜穿透作用的多肽，其自身或其与其它蛋白的融合蛋白可通过细胞膜进入到细胞内。所述的入细胞引导物例如包括：反式激活蛋白(TAT)、Penetratin、基于信号序列的肽、pVEC、Transportan、Amphiphilic model peptide和Arg9等。 

作为本发明的优选方式，所述的入细胞引导物是反式激活蛋白(Transactivator，TAT)。本发明人发现，TAT蛋白融合(i)或(ii)或(iii)的蛋白片段后，能够使外源(i)或(ii)或(iii)蛋白片段或其衍生蛋白更多地进入细胞内，从而发挥竞争性抑制作用。较佳地，所述的TAT-tag具有SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。 

筛选方法 

在得知了β-Arrestin1与APH-1的相互作用与神经退行性疾病的相关性以后，可基于该新发现来筛选抑制两者结合，进而减少Aβ产生的物质，所述的物质对于预防或治疗神经退行性疾病是有用的。 

因此，本发明提供了一种筛选预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：以β-Arrestin1或其蛋白片段作为筛选的靶点，选出特异性抑制该靶点的物质，所述的物质是预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质。 

作为本发明的优选方式，所述的方法包括：(1)将候选物质与表达β-Arrestin1或其蛋白片段的体系接触；(2)检测候选物质对β-Arrestin1或其蛋白片段的影响；若所述候选物质抑制β-Arrestin1或其蛋白片段的表达或活性，则表明该候选物质是预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质。更优选地，在进行筛选时，为了更易于观察到β-Arrestin1的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达β-Arrestin1或其蛋白片段的体系。 

作为本发明的更优选的方式，以β-Arrestin1的蛋白片段，特别是以含有SEQ ID NO:1中第241-360位氨基酸序列的蛋白片段作为筛选的靶点，从而可筛选到特异性作用于β-Arrestin1蛋白上该位点而不作用于其它位点的物质，该物质对于β-Arrestin1蛋白上除了APH-1AL结合区域以外的其它区域具有较小的影响，也即不影响β-Arrestin1蛋白的其它生物学功能。 

以蛋白上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该区域的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。 

经过大规模的药物筛选，可以获得一类特异性作用于β-Arrestin1，特别是作用于β-Arrestin1上第241-360位蛋白区域的潜在物质。这些初步筛选出的潜在物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以在进一步验证的基础上，从中筛选出能够对于调节β-Arrestin1的表达和活性真正有用的物质。 

鉴于本发明人发现β-Arrestin1与APH-1(特别是APH-1AL或APH-1B)相互作用，本发明还提供了一种蛋白复合体，所述复合体包括：β-Arrestin1或其蛋白片段，所述蛋白片段包含SEQ ID NO:1中第241-360位氨基酸序列；和APH-1或其片段。作为本发明的优选方式，所述的APH-1AL的氨基酸序列可以与GenBank登录号NP 001071096所示的序列基本上相同。所述的APH-1AL的生物活性片段(如其羧基端片段)或衍生物也可用于本发明。 

在得知了β-Arrestin1与APH-1相互作用后，可基于该新发现来筛选抑制β-Arrestin1与APH-1(特别是APH-1AL或APH-1B)相互作用，从而影响γ-分泌酶的形成，进而减少Aβ产生的物质，所述的物质对于预防或治疗神经退行性疾病是有用的。 

因此，本发明提供了一种筛选预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：以所述的蛋白复合体作为筛选的靶点，选出特异性抑制所述蛋白复合体形成的物质，所述的物质是预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质。 

作为本发明的优选方式，所述的方法包括：(1)将候选物质与含有所述的蛋白复合体的体系接触；(2)检测候选物质对所述蛋白复合体的影响；若所述候选物质抑制所述蛋白复合体中β-Arrestin1或其蛋白片段与APH-1或其片段的相互作用(如相互结合)，则表明该候选物质是预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质。 

因此，本发明提供了一种筛选预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)将候选物质与含有(如表达)β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的体系接触；(2)检测候选物质对β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的相互作用的影响；若所述候选物质抑制β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的相互作用，则表明该候选物质是预防、缓解或治疗神经退行性疾病的潜在物质。所述的检测选物质对β-抑制蛋白1或其蛋白 片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的相互作用可以在多方面进行观察，例如，观察β-抑制蛋白1或其蛋白片段与APH-1蛋白或其蛋白片段的相互结合、作用时间长短，有效结合的比例等。 

在一种筛选模式下，通过模拟所述β-Arrestin1或其蛋白片段、APH-1或其蛋白片段的三维结构来进行药物筛选。目前大量蛋白质的三维结构已由X射线晶体衍射技术和多维核磁共振(NMR)等技术解析而得，为研究蛋白质-配体复合物的分子识别提供了有利条件。 

目前已经有许多备选的筛选库(如小分子化合物筛选库)，使得高通量筛选成为可能。可借助计算机辅助药物设计，通过分析药物靶标，即蛋白分子功能位点的结构性质，设计出特定的化学小分子，使其分子的各部分分子结构和理化性质与靶标相匹配，以达到与之结合并发挥作用的目的，这些技术均是本领域人员所熟知的。 

在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术(GST-Pull Down)、噬菌体展示技术、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术。其中，酵母双杂交是一种大规模快速研究蛋白-蛋白间相互作用的方法，具有简单、稳定的优点。在酵母细胞中，一种与DNA-结构域融合的诱饵蛋白与一种与活化域融合的猎物蛋白相互作用。相互作用的成对分子结合于专一的序列模式，从而活化两个独立的报道基因的转录。在本发明的一种优选方式中，采用免疫沉淀技术来验证蛋白与蛋白之间的特异性相互作用。所述的免疫共沉淀技术的原理是：在保持蛋白-蛋白相互作用的条件下，收获和裂解细胞，从细胞提取液中特异性地免疫沉淀目的蛋白，然后通过电泳等方法分离免疫沉淀物。具有已知特性的蛋白的共沉淀，可采用抗该蛋白的抗体，通过比如Western印迹来检测。此外，如果细胞在裂解前已经用标记物进行过标记，则可通过放射自显影或其它免疫学技术来观察共沉淀的蛋白。 

本发明的另一优选方式是利用Split-TEV报告基因系统定量化重现β-arrestin1与APH-1AL的相互作用。将β-arrestin1和APH-1AL分别与TEV酶的氮末端（NTEV）和TEV酶的羧基末端（CTEV）偶联，β-arrestin1与APH-1AL相互作用使得NTEV和CTEV靠近并发挥完整TEV酶活性并启动下游报告基因信号。这一报告基因系统可以直接用于干扰β-arrestin1与APH-1AL相互作用的小分子化合物的高通量筛选。 

作为本发明的优选方式，还需要对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从这些物质中进一步选择和确定对于预防或治疗神经退行性疾病有用的物质。 

所述的“表达β-Arrestin1或其蛋白片段的体系”或“含有所述的蛋白复合体的体系”可以选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。在细胞水平上，可通过构建细胞模型的方式来进行筛选。相关细胞模型的构建是本领域技术人员熟知的。例如，可通过将β-Arrestin1或其蛋白片段的表达单位(如表达载体)转入到宿主细胞内，使之可稳定地表达β-Arrestin1或其蛋白片段。表达 单位和宿主细胞的选择是本领域人员熟知的技术。所述的宿主细胞例如是(但不限于)：HEK293细胞。当然，也可以以内源表达β-Arrestin1或其蛋白片段的细胞作为筛选的模型，所述细胞例如是(但不限于)：神经元细胞。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，2002下面结合)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。 

I.材料和方法 

1.材料 

细胞系和原代培养小鼠神经元 

HEK293T人胚胎肾细胞系：购自ATCC。 

Neuro-2a小鼠神经母细胞瘤细胞系：购自ATCC。 

野生型以及早老蛋白敲除(Psen1^-/-Psen2^-/-)的小鼠胚胎成纤维细胞系：获自比利时Katholieke Universiteit Leuven(由Bart De Strooper和Paul Saftig提供)。 

原代小鼠神经元：取自C57/BL6小鼠(P0或P1)大脑皮层，于体外培养。 

阿尔兹海默症人大脑组织样品 

病人中额叶皮层灰质组织样品获自Netherlands Brain Bank。每一Braak样品组含有7个样品，并且保证各组样品的性别、年龄(平均77周岁，范围为52-93周岁)、尸检间隔时间(平均6小时，范围为3-10小时)、脑脊液pH值(平均pH值6.7，范围为6.3-7.4)和ApoE基因型一致。 

实验动物 

β-Arrestin1基因敲除小鼠，C57BL/6近交系：获自美国Duke University MedicalCenter(由Robert Lefkowitz提供)[参见Conner,D.A.et al.β-Arrestin1knockout miceappear normal but demonstrate altered cardiac responses to β-adrenergic stimulation.Circ.Res.81(6),1021-1026(1997)]。杂合子小鼠自交，子代小鼠经基因型鉴定后，纯合子用于实验。 

1026(1997)]。杂合子小鼠自交，子代小鼠经基因型鉴定后，纯合子用于实验。 

]。杂合子小鼠自交，子代小鼠经基因型鉴定后，纯合子用于实验。 

代小鼠经基因型鉴定后，纯合子用于实验。 

纯合子用于实验。 

TgCRND8转基因模型小鼠，C3H/C57BL6远交系：表达APP的K670N，M671L，V717F突变体，获自加拿大University of Alberta(由David Westaway提供)[参见 Chishti,M.A.et al.Early-onset amyloid deposition and cognitive deficits in transgenicmice expressing a double mutant form of amyloid precursor protein 695.J.Biol.Chem.276(24),21562-21570(2001)]。TgCRND8转基因小鼠与B6C3/F1工具鼠交配繁殖子代，子代小鼠经基因型鉴定后，转基因小鼠阳性用于实验。 

APP/PS1转基因模型小鼠，C3H/C57BL6远交系：表达APP的K670N，M671L突变体和PS1的ΔE9突变体双转基因，购自Jackson Laboratory[参见Jankowsky,J.L.etal.Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42 residue β-amyloidpeptide in vivo:evidence for augmentation of a 42-specific γ-secretase.Hum.Mol.Genet.13(2),159-170(2004)]。APP/PS1转基因小鼠与B6C3/F1工具鼠交配繁殖子代，子代小鼠经基因型鉴定后，转基因小鼠阳性用于实验。 

质粒 

构建于pBluescript-SKII载体中的鼠源β-Arrestin1小干扰RNA序列如下：5’-GGGAAGCTCAAGCATGAGGACA-3’(SEQ ID NO:23)，对照小干扰RNA序列如下：5’-GGCCGCAAAGACCTTGTCCTTA-3’(SEQ ID NO:24)。质粒构建方法如下：化学合成带有小干扰RNA的正义和反义互补单链DNA(两端带有BamHI和HindIII酶切位点)。将互补单链DNA变性后退火形成双链DNA片断，并且和BamHI/HindIII双酶切线性化的pBluescript-SKII载体(Invitrogen)连接以构建入该载体中。 

鼠源β-Arrestin1小干扰RNA和对照小干扰RNA(慢病毒FG12载体)构建方法如下：将pBluescript-SKII载体上的小干扰RNA和U6启动子用XhoI/XbaI双酶切，克隆入慢病毒FG12载体[参见Qin,X.F.等，Inhibiting HIV-1 infection in human T cellsby lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(1),183-188(2003)]。 

野生型FLAG-β-Arrestin1质粒和HA-β-Arrestin1质粒构建方法如下：β-Arrestin1全长编码序列通过逆转录PCR从HEK293T细胞RNA中获得，通过EcoRV/XhoI酶切位点构建入pcDNA3载体(Invitrogen)。 

HA-β-Arrestin1突变体1-180、181-418、1-240、241-360、1-360和241-418采用野生型HA-β-Arrestin1质粒(野生型HA-β-Arrestin由逆转录PCR获得)为模板，以适当的引物扩增相应片段后插入到pcDNA3载体的BamHI/XhoI位点中构建获得。 

FLAG-APH-1AL质粒、FLAG-APH-1AS质粒和HA-APH-1AL质粒获自德国Ludwig Maximilians University(由Harald Steiner提供)。 

HA-PS1-NTF质粒和HA-PS1-CTF质粒如下构建：以HEK293细胞总RNA为模板，通过逆转录-PCR扩增，以5’-CGC,GGA,TCC,ATG,ACA,GAG,TTA,CCT,GCA,CC-3’(SEQ ID NO:25)和5’-ATC,GCT,CGA,GCT,ATG,TTG,AGG,AGT,AAA,TGA,GAG-3’(SEQ ID NO:26)为引物扩增获得PS1-NTF编码序列；以5’-CGC,GGA,TCC,ATG,GTG,TGG,TTG,GTG,AAT,ATG-3’(SEQ ID NO:27)和5’-TCG, CTC,GAG,CTA,GAT,ATA,AAA,TTG,ATG,GA-3’(SEQ ID NO:28)为引物扩增获得PS1-CTF编码序列。通过BamHI/XhoI双酶切位点将PS1-NTF和PS1-CTF编码序列分别克隆入多克隆位点N端和C端分别带有HA抗原表位编码序列的pcDNA3载体； 

HA-Nicastrin质粒：获自美国University of Pennsylvania School of Medicine(由Robert Doms提供)。 

HA-PEN-2质粒，获自美国University of Chicago(由Sangram Sisodia提供)。 

HA-APP质粒如下构建：以HEK293细胞总RNA为模板，以5’-AGC，GAT，ATC，GAT，GCT，GCC，CGG，TTT，GGC-3’(SEQ ID NO:29)和5’-ATG,CTC,TAG,ATT,AGG,CGT,AGT,CGG,GGA,CGT,CGT,AGG,GGT,AGT,TCT,GCA,TCT,GCT,CAA,AG-3’(SEQ ID NO:30)为引物通过逆转录-PCR扩增获得APP编码序列，并且在其3’端带有HA抗原表位通过引物设计引入以便于检测。通过EcoRV/XbaI双酶切位点将APP编码序列克隆入pcDNA3载体，突变为“Swedish”突变体(K670M/N671L)。 

HA-BACE1质粒构建方法如下：以HEK293细胞总RNA为模板，以5’-CGC,GGA,TCC,ATG,GCC,CAA,GCC,CTG,CCC,TG-3’(SEQ ID NO:31)和5’-ATC,GC T,CGA,GTC，ACT，TCA，GCA，GGG，AGA，TGT-3’(SEQ ID NO:32)为引物通过逆转录-PCR扩增获得BAC E1编码序列。通过BanHI/XhoI双酶切位点将BACE1编码序列克隆入多克隆位点C端带有HA抗原表位编码序列的pcDNA3载体。 

各质粒可常规方法转化相关细胞，从而使得重组细胞表达相关的蛋白。 

抗体 

兔抗PS1-NTF抗体：购自Calbiochem公司。兔抗PS1-CTF抗体：购自Calbiochem公司。鼠抗Aβ单克隆抗体6E10：购自Chemicon公司。兔抗Flag抗体：购自Sigma公司。兔抗HA抗体：购自Sigma公司。兔抗Nicastrin抗体：购自Sigma公司。兔抗APH-1A抗体：购自Abcam公司。兔抗PEN-2抗体：购自Sigma公司。兔抗APP抗体：购自Sigma公司。兔抗Actin抗体：购自Sigma公司。兔抗β-Arrestin抗体A1CT和A2CT：获自美国Duke University Medical Center(由Robert Lefkowitz提供)。鼠抗APH-1AL抗体：通过常规方法免疫BALB/c小鼠获得，抗原为偶联KLH的合成短肽RRQEDSRVMVYSALRIPPED(SEQ ID NO:22)。 

其他试剂 

酶联免疫吸附实验试剂盒：检测人源Aβ₄₀和Aβ₄₂用酶联免疫吸附实验试剂盒购自Biosource公司。 

α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶荧光底物购自Calbiochem公司。 

Vectastain Elite ABC免疫组织化学实验试剂盒购自Vector Laboratories公司。 

[35S]-甲硫氨酸购自GE Healthcare公司。 

TNT体外转录/翻译试剂盒购自Promega公司。 

质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司。 

FuGENE HD转染试剂购自Roche公司。 

2.方法 

Western杂交实验检测病人和小鼠组织样品的β-Arrestin蛋白质水平 

小鼠组织样品取自同窝相同性别的野生型和转基因TgCRND8和APP/PS1小鼠海马组织。病人和小鼠组织样品分别用蛋白提取缓冲液(含有5mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mM EDTA，5mM EGTA，1%SDS和蛋白酶抑制剂)裂解，测定蛋白质浓度。等量蛋白质样品用Western杂交实验检测β-Arrestin，用Odyssey红外成像系统获取Western杂交实验图像并进行灰度分析。β-Arrestin的相对蛋白质水平由β-Arrestin的信号强度对Actin的信号强度比值的平均值归一化计算得来。 

基因芯片和定量PCR实验检测病人组织样品的β-Arrestin1mRNA水平 

取50mg冰冻病人组织样品，按照以前报导所述方法抽取RNA，检测RNA质量，进行RNA反转录反应和定量PCR实验。使用Agilent人类全基因组芯片进行杂交实验，用R/BioConductor的limma包处理基因芯片数据。定量PCR实验则选取表达水平不受阿尔兹海默症影响的基因作为参照基因。β-Arrestin和参照基因的引物序列为： 

ARRB1：5’-CGA GAC GCC AGT AGA TAC CA-3’(SEQ ID NO:2)，5’-TCA TCCTTC ATG CCT TTC AG-3’(SEQ ID NO:3)； 

ARRB2，5’-ACA CTG GAC CCT CTC TTG CT-3’(SEQ ID NO:4)，5’-TCC CTCCTG TCA CTC CTC TT-3’(SEQ ID NO:5)； 

DHX16，5’-TTG ACT CGG AGT GGC TAC CG-3’(SEQ ID NO:6)，5’-AGC GTGGCT GTT GCT CAA AGA-3’(SEQ ID NO:7)； 

DNTTIP2，5’-GGC TTC CCC AAG TAC TTC CA-3’(SEQ ID NO:8)，5’-AGC CAGCAG TTC TTC CAC AA-3’(SEQ ID NO:9)； 

KLHDC5，5’-AGG ATG CGT GGA ATT TTG TG-3’(SEQ ID NO:10)，5’-TTCATG TTC CGG TCT CTG GT-3’(SEQ ID NO:11)； 

TM9SF4，5’-CCA GCT GTG TGC AGA GGA TT-3’(SEQ ID NO:12)，5’-TCCACG ATG TCC AGC TTG TT-3’(SEQ ID NO:13)； 

SNW1，5’-CTT CTC CCA CCT TTC AGC AT-3’(SEQ ID NO:14)，5’-CTC ACTGTG GTT GGG GTA ACT-3’(SEQ ID NO:15)； 

AURKAIP1，5’-GCC TCA AAT TCA GTG CAA AA-3’(SEQ ID NO:16)，5’-CTCGAA CTT GAT CTG CTT GC-3’(SEQ ID NO:17)； 

ISOC2，5’-TGA GAC AGA GTG GTG CCT TC-3’(SEQ ID NO:18)，5’-TTC TGGATC TCC TTG AAC TGG-3’(SEQ ID NO:19)。 

细胞培养及转染 

细胞培养于含有5%二氧化碳的37℃细胞培养箱。Neuro-2a神经母细胞瘤细胞培 养于含10%胎牛血清的MEM培养基；HEK293T细胞、野生型以及早老蛋白基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞系培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。细胞于转染前16小时接种入培养皿内。HEK293T细胞和Neuro-2a神经母细胞瘤细胞采用磷酸钙法转染，转染6-8小时后弃去培养基，更换为新鲜培养基。小鼠胚胎成纤维细胞系采用FuGENE HD转染。原代小鼠神经元培养于含2%B27的Neurobasal培养基，用Amaxa Nucleofector系统转染，培养7天后用于实验。所有实验均以转染β-半乳糖苷酶(β-gal)或绿色荧光蛋白(GFP)质粒作为对照。 

慢病毒的包装纯化和立体定位注射 

重组慢病毒颗粒通过转染HEK293T细胞获得。将病毒核心质粒FG12获自美国Calfornia Institute of Technology(由David Baltimore提供)、包装质粒pRSVREV获自美国Calfornia Institute of Technology(由David Baltimore提供)和pMDLg/pRRE获自美国Calfornia Institute of Technology (由David Baltimore提供)以及表达质粒pHCMVG获自美国Calfornia Institute of Technology (由David Baltimore提供)通过磷酸钙法共转染入HEK293T细胞。转染后第2和第3天收集细胞培养基，2500rpm离心10分钟后，用0.45μm孔径滤膜过滤，然后28,000rpm超速离心2小时后，弃去上清。向沉淀加入适量生理盐水，4℃放置过夜溶解沉淀，保存于-80℃备用。 

TgCRND8小鼠双侧海马立体定位注射慢病毒。小鼠深度麻醉后置于立体定位仪上进行手术，按照以下坐标设定注射位点：前后-2.0毫米；内外±1.5毫米；背腹-2.0毫米。双侧海马分别注射β-Arrestin1小干扰RNA慢病毒和LacZ小干扰RNA慢病毒2μL，注射速度为1μL/分钟。手术4周后，心脏灌流生理盐水处死小鼠，灌流4%多聚甲醛固定，快速取出大脑组织浸泡于4%多聚甲醛继续固定2小时，30%蔗糖溶液脱水处理，制作30μm厚度冠状冰冻切片。用荧光显微镜观察慢病毒表达的GFP荧光以检测慢病毒表达情况。 

酶联免疫吸附实验检测Aβ水平 

分别收集Neuro-2a神经母细胞瘤细胞系和原代培养神经元培养12小时的培养基，用BNT77/BA27和BNT77/BC05酶联免疫吸附实验试剂盒(购自Wako)按照厂商提供方法检测培养基中所含的鼠源Aβ₄₀和Aβ₄₂水平。 

β-Arrestin1基因敲除小鼠的皮层和海马组织用0.4%二乙胺/100mM NaCl匀浆，100,000g离心1小时，上清加入1/10体积0.5M Tris-HCl(pH 6.8)中和，用BNT77/BA27和BNT77/BC05酶联免疫吸附实验试剂盒按照厂商提供方法进行实验检测上清中所含的鼠源Aβ₄₀和Aβ₄₂水平。 

心脏灌流生理盐水处死TgCRND8小鼠，开颅并分离大脑组织，立即用液氮速冻，保存于-80℃。实验前向大脑组织加入2%SDS溶液，置于室温解冻，然后超声波破碎组织。待组织完全破碎后以10,000g于4℃离心1小时。上清为SDS可溶性蛋白质组 分。沉淀中加入70%甲酸溶液，重悬沉淀后再次离心，上清为甲酸可溶性蛋白质组分，加入20倍体积的中和缓冲液(含1M Tris和0.5M Na₂HPO₄)。SDS和甲酸组分分别稀释后用人源Aβ₄₀和Aβ₄₂酶联免疫吸附实验试剂盒按照厂商提供方法进行实验。 

分泌酶荧光底物活性检测 

细胞或组织用裂解缓冲液(含有5mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mM EDTA和5mMEGTA)裂解，胰岛素针反复抽吸破碎细胞。用考马斯亮蓝方法测定蛋白质浓度，取一定量组分经12,000g于4℃离心30分钟，弃去上清。 

如用于检测γ-分泌酶活性，沉淀用反应缓冲液(含有0.25%CHAPSO、50mMTris-HCl(pH 6.8)、2mM EDTA和8μM γ-分泌酶荧光底物)重悬后，于37℃水浴中反应2小时。反应产物用荧光分光光度计测量荧光值，设定激发光波长λ_ex=355nm，发射光波长λ_em=440nm。 

如用于检测α-分泌酶活性，沉淀用反应缓冲液(含有100mM柠檬酸钠，(pH 4.0)和20μM α-分泌酶荧光底物)重悬后，于37℃水浴中反应1小时。测量反应产物荧光值设定参数：λ_ex=325nm，λ_em=393nm。 

如用于检测β-分泌酶活性，沉淀用反应缓冲液(含有50mM醋酸钠(pH 4.5)和10μMβ-分泌酶荧光底物)重悬后，于37℃水浴中反应30分钟。测量反应产物荧光值设定参数：λ_ex=320nm，λ_em=420nm。 

沉降(Pull-down)实验 

[³⁵S]甲硫氨酸标记的β-Arrestin1用TNT转录/翻译试剂盒按照厂商提供方法合成。偶联HA表位的PS1-NTF、PS1-CTF、Nicastrin、APH-1AL和PEN-2在HEK293T细胞中表达，用偶联抗HA抗体琼脂糖凝胶免疫沉淀，和[³⁵S]甲硫氨酸标记的β-Arrestin1在结合缓冲液(50mM HEPES(pH 7.5)、150mM NaCl、0.5mg/mL牛血清蛋白、1%Triton X-100、5mM EDTA、10%甘油和蛋白酶抑制剂)中共孵育。结合琼脂糖凝胶的β-Arrestin1用SDS聚丙烯酰胺电泳分离，放射自显影检测。 

免疫沉淀方法 

弃去细胞培养基，用预冷的PBS洗两遍细胞后，向细胞中加入裂解缓冲液(含有50mM HEPES(pH 7.5)、150mM NaCl、5mM EDTA、10%甘油、1%Triton X-100或1%CHAPSO和蛋白酶抑制剂)。收集细胞后于4℃裂解1小时。细胞裂解完毕后，以12,000g于4℃离心15分钟。取上清，加入偶联抗Flag抗体或抗HA抗体琼脂糖凝胶(内源APH-1AL用小鼠抗血清A1.2和Protein G-Sepharose凝胶沉淀)，于4℃孵育4-6小时。然后以2,000g于4℃离心收集琼脂糖凝胶，用裂解缓冲液洗3次后加入30μLSDS-PAGE上样缓冲液洗脱蛋白质。用Western杂交方法检测免疫沉淀产物。 

TgCRND8小鼠基因型鉴定 

按照标准方法提取鼠尾DNA。剪取约0.5cm长的鼠尾尖端，加入0.5mL裂解液(含有4M Urea、10mM EDTA、0.1M Tris HCl(pH 8.0)、0.2M NaCl、0.5% Sarkosyl和1mg/mL蛋白酶K)，置于56℃水浴直至鼠尾完全溶解。然后加入0.7mL酚氯仿并混匀，于4℃以9000rpm离心15分钟。取上清，加入等体积的异丙醇并混匀，于4℃以9000rpm离心15分钟沉淀DNA。弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀DNA。溶解DNA后测定浓度。 

PCR鉴定APP基因引物为：DW229：TGTCCAAGATGCAGCAGAACGGCTACGAAAA(SEQ ID NO:20)；DW191：GGCCGCGGAGAAATGAAGAAACGCCAAGCGCCGTGACT(SEQ ID NO:21)。 

PCR反应体系：10×PCR缓冲液2μL，25mM MgCl₂1.6μL，2mM dNTP 2μL，DNA模板100ng，10μM DW2290.5μL，10μM DW1910.5μL，50%甘油4μL，Taq酶3-5单位，加水补足20μL。PCR反应条件：94℃初始变性3分钟；94℃变性30秒，60℃复性30秒，72℃扩增90秒，循环35次。 

免疫组织化学实验 

小鼠大脑冠状切片用Vectastain Elite ABC试剂盒按照厂商提供方法进行实验检测β-Arrestin1和淀粉样蛋白斑。分别使用A1CT和6E10抗体检测β-Arrestin1和淀粉样蛋白斑。图像中的染色反应阳性信号面积用Image-Pro Plus 5.1软件分析和统计。每只小鼠取3-5张切片统计，其平均值作为该小鼠测量值。 

新颖性探求实验 

所有小鼠被随机编号并打乱顺序，以双盲法进行实验。实验在隔音箱中进行，在配备了摄像机的隔音箱中放置25厘米×25厘米×25厘米的透明有机玻璃盒子。第一天，所有小鼠被转移到行为学实验室以对生活环境进行适应；第二天，将小鼠依次放置在透明有机玻璃盒子中10分钟以适应实验环境；第三、四天，在透明有机玻璃盒子中放置两个完全一样的物体于对角线处，距离盒子边缘约5厘米，将每只小鼠依次放入其中任其探索20分钟；第五天，先在透明有机玻璃盒子中放置两个完全一样的物体(与第三、四天相同)，让每只小鼠进行10分钟的训练，并用摄像机记录其探索过程；1小时后将其中一个物体置换成全新的物体，再次将小鼠置于其中，任其探索10分钟，并用摄像机记录其探索过程。每只小鼠放入透明有机玻璃盒子前，都要用70%异丙醇清洗盒子底面及物体，以去除前一只小鼠残留的气味及粪便等。实验结束后，利用秒表分析统计视频中小鼠与每一个物体互动的时间。 

Morris水迷宫 

所有小鼠被随机编号并打乱顺序，以双盲法进行实验。水迷宫是由直径1.2米的 水池制成，其中填满白色牛奶，温度始终控制在22±0.5℃，水迷宫四周安放各种具有明显差别的方位提示标记，包括：红色三角，白色圆圈以及黑色方块。第1天到10天进行不可见平台训练，平台为直径12厘米的白色圆柱体，固定于目标象限正中的水面下约1.5厘米处，不作改变。小鼠从象限分隔线靠近水箱壁处放入水中，任其自由探索1分钟，如1分钟内没有爬上平台，则把小鼠引导到平台上，然后让它在平台上停留30秒，取出，擦干鼠毛，放回笼中。每只小鼠每天训练4次，每次训练放入位置为四个象限分隔线(随机)，平台固定不变，每次训练间隔40-60分钟。其间利用摄像机及对应软件记录小鼠的运动轨迹，并记录下每只小鼠每次到达平台的时间，无法自己找的的记60秒。在第四天，第七天，第十一天分别时进行测试，此时拿走平台，小鼠从象限分隔线靠近水箱壁处放入水中，放置顺序为北、西、东、南，任其自由探索1分钟，记录小鼠的运动轨迹，取出擦干鼠毛，放回笼中。所有数据最后由Ethovision XJ6 software统计并分析。 

Blue Native PAGE(SDS-PAGE)实验 

按照常规方法提取细胞膜沉淀。在25,000g于4℃离心1小时后，取其上清，并用SDS-PAGE免疫印迹检测其中的βarr1WT或者βarr18M以及actin，以作BN-PAGE的上样量对照。而其膜沉淀则用含有DDM(N-dodecyl-β-d-maltoside,J424,Amresco)去垢剂的缓冲液(对于γ-分泌酶全酶复合体：0.2%DDM；对于NCT/APH1前复合体：0.5% DDM；50mM sodium chloride,50mM imidazole,2mM 6-Aminohexanoic acid,1mM EDTA,pH 7.0)重悬，冰浴30分钟。25,000g于4℃离心15分钟后，取其上清，每40μl上清加入5μl 5%考马斯亮蓝G-250及5μl 50%甘油。BN-PAGE的每一条泳道上样量为120μg全蛋白的膜提取物。BN-PAGE采用Native makers(MW-GF-1000,Sigma)作为蛋白分子量标准品，它包括29KD，66KD，150KD，220KD，430KD，669KD的6种分子量大小的蛋白，它们在混合后与样品进行平行处理，并上样到胶两侧的泳道。选用5%-15%的梯度胶，用SE 600 Ruby vertical electrophoresis system(Amersham)在4℃80V条件下将所有样品电泳至浓缩胶，然后将电压升至160V继续电泳约2小时至样品前缘位于整块分离胶的三分之一处，更换内槽电泳液为仅含有十分之一考马斯亮蓝G-250的缓冲液(相对于之前的内槽液)。电泳结束后，剥离胶体，用含有0.1%SDS,25mM Tris,192mM glycine,20% methanol的缓冲液于室温孵育10分钟，然后将蛋白转膜至PVDF膜上，进行下一步免疫印迹实验。 

甘油梯度分离蛋白质复合体 

小鼠海马组织或Neuro-2a神经母细胞瘤细胞在匀浆缓冲液(5mM HEPES(pH7.4)、1mM EDTA、0.25M蔗糖和蛋白酶抑制剂)中匀浆，3,000g离心5分钟，弃去沉淀。取上清，100,000g离心1小时后，将沉淀用缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)、2mMEDTA、150mM NaCl、1%CHAPSO和蛋白酶抑制剂)重悬，100,000g再次离心30分 钟，所得上清用于甘油梯度实验。10-30%线性甘油梯度含有25mM HEPES(pH 7.2)、150mM NaCl和0.5%CHAPSO，于150,000g离心24小时后，梯度均分为20个组分用于Western杂交实验和γ-分泌酶荧光底物实验。 

数据统计分析 

实验数据表示为平均值±标准误差。病人组织样品的β-Arrestin表达水平采用ANOVA分析组间显著性差异后，用Student-Newman-Keuls检验分析两组之间的显著性差异。TgCRND8小鼠双侧海马感染慢病毒的实验采用成对t检验分析数据。其他实验所得数据则采用t检验分析显著性差异。P<0.05时认为组间有显著性差异。 

II.实施例 

实施例1.阿尔兹海默症人和转基因模型小鼠的β-Arrestin表达水平上升 

首先，为了研究β-Arrestin在阿尔兹海默症中是否发生改变，本发明人检测了病人大脑样品的β-Arrestin表达水平。病人样品根据依赖于神经病理学指标的Braak分期方法评价，按照病变程度分组为7组(依次为Braak 0、I、II、III、IV和VI期)[Braak,H.& Braak,E.Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.Acta.Neuropathol.82(4),239-259(1991)]。如图1和图2所示，用Western杂交方法检测β-Arrestin表达，发现β-Arrestin1蛋白质水平和Braak分期呈正相关(r=0.725，P<0.001)，并且β-Arrestin1的表达水平在第6和第7组(即Braak V和VI期)样品中出现明显上升(Braak V期，P=0.008；Braak VI期，P<0.001)。如图1和图3所示，β-Arrestin2的表达水平和Braak分期也呈正相关(r=0.508，P<0.001)，并且β-Arrestin2的表达水平在Braak VI期样品中出现明显上升(P=0.003)。 

本发明人通过基因芯片方法检测了病人组织中β-Arrestin1的mRNA水平，发现β-Arrestin1的mRNA水平和Braak分期呈正相关(r=0.584，P<0.001)，并且在第7组(即Braak VI期)样品中出现明显上升(P=0.048)(图4)。本发明人用定量PCR实验也验证了β-Arrestin1的mRNA水平和Braak分期的正相关(r=0.442，P=0.004)(图4)。 

本发明人通过免疫组织化学方法检测了人体组织中β-Arrestin1的分布情况，发现β-Arrestin1在健康人和病人组织中都分布于神经元和星型胶质细胞中(图5)。 

本发明人在阿尔兹海默症转基因模型小鼠中也发现β-Arrestin表达上升的现象。TgCRND8小鼠是APP“Swedish”和“Indiana”双突变体的转基因小鼠，具有认知功能障碍和大脑内的淀粉样蛋白斑病变。检测TgCRND8小鼠的海马组织样品发现，β-Arrestin1和β-Arrestin2的蛋白质水平明显上升(β-Arrestin1，P<0.001；β-Arrestin2，P=0.049)(图6)。 

为了检验这一现象是否仅限于TgCRND8这一种动物模型，本发明人又检测了APP/PS1小鼠的海马组织样品中的β-Arrestin表达。实验发现，β-Arrestin1的蛋白质水平在APP/PS1小鼠中明显上升(P=0.006)，然而β-Arrestin2的蛋白质水平没有发生 变化(图7)。 

用免疫组织化学实验检测β-Arrestin1在小鼠大脑组织中的分布也发现，和野生型小鼠相比，β-Arrestin1在TgCRN8小鼠的皮层和海马组织中表达水平明显上升(图8)。 

以上实验显示，β-Arrestin在病人和模型小鼠大脑中组织的蛋白质表达水平明显上升，而且β-Arrestin1相比β-Arrestin2的上升变化更显著，提示β-Arrestin可能和阿尔兹海默症有一定关联，β-Arrestin1调控Aβ产生和γ-分泌酶活性。 

为了揭示β-Arrestin在阿尔兹海默症中的可能作用，本发明人研究β-Arrestin能否调控Aβ水平。如图9所示，用酶联免疫吸附实验分别检测β-Arrestin1基因敲除小鼠皮层和海马组织内源表达的Aβ₄₀和Aβ₄₂，发现这两个脑区中的Aβ₄₀和Aβ₄₂水平都明显下降。皮层和海马是受阿尔兹海默症影响的主要脑区，这两个脑区中的Aβ水平受β-Arrestin1的表达影响，提示β-Arrestin1参与调控Aβ水平。 

Western杂交实验检测APP及其片断后发现，β-Arrestin1基因敲除小鼠中的APP-CTFα和APP-CTFβ水平上升，全长APP水平没有发生改变(图10)。APP-CTFα和APP-CTFβ分别是APP经α-分泌酶和β-分泌酶剪切后形成的小片断，也是γ-分泌酶的底物。此结果提示β-Arrestin1基因敲除小鼠的Aβ水平发生改变是受分泌酶影响产生的，而不是因为APP的表达水平变化引起的。 

本发明人进一步用荧光底物活性实验检测Aβ产生途径中的分泌酶蛋白酶活性。实验发现，γ-分泌酶活性在β-Arrestin1基因敲除小鼠的海马组织中明显降低，然而α-分泌酶和β-分泌酶的活性都没有发生变化(图11)。此结果与图10的实验结果一致，说明β-Arrestin1基因敲除引起γ-分泌酶活性降低，导致底物积累，APP-CTFα和APP-CTFβ水平上升。 

为了检验在体外培养细胞中β-Arrestin1是否能够影响Aβ水平和γ-分泌酶活性，分别用原代培养神经元和Neuro-2a神经母细胞瘤细胞进行实验。原代培养神经元和Neuro-2a神经母细胞瘤细胞的β-Arrestin表达如图12。 

如图13所示，用小干扰RNA抑制原代神经元和Neuro-2a神经母细胞瘤细胞内源β-Arrestin1的表达，细胞的Aβ₄₀和Aβ₄₂水平都明显下降。相反的，在原代神经元和Neuro-2a神经母细胞瘤细胞中过表达β-Arrestin1后，细胞的Aβ₄₀和Aβ₄₂水平都明显上升(图14)。 

分别检测原代神经元和Neuro-2a神经母细胞瘤细胞的γ-分泌酶活性后发现，用小干扰RNA抑制细胞内源β-Arrestin1的表达引起γ-分泌酶活性下降(图15)。相反的，在原代神经元和Neuro-2a神经母细胞瘤细胞中过表达β-Arrestin1后，细胞的γ-分泌酶活性都明显上升(图16)。 

以上实验结果提供了直接证据，显示β-Arrestin1通过改变γ-分泌酶活性调控Aβ水平。 

实施例2.β-Arrestin1通过结合APH-1AL调控γ-分泌酶活性 

本发明人以前的研究发现β2AR被激活后能够通过介导γ-分泌酶进入内吞途径增强其蛋白酶活性。为了检验内吞作用是否参与了β-Arrestin1对于γ-分泌酶的调控作用，本发明人用调控内吞转运小泡形成过程的Rab5和Rab7的显性负突变体(Rab5S34N和Rab7T22N)抑制内吞转运过程，并且发现Rab5S34N和Rab7T22N都不能抑制β-Arrestin1增强的γ-分泌酶活性(图17)。因此排除了内吞作用参与β-Arrestin1对于γ-分泌酶的调控作用的可能性。 

β-Arrestin1能够通过结合细胞表面受体和胞内信号通路分子调控不同信号通路。本发明人推测蛋白质-蛋白质相互作用可能参与了β-Arrestin1对于γ-分泌酶的调控作用。为了检验这一推测，本发明人首先检测β-Arrestin1和γ-分泌酶组分的相互作用。 

体外转录/翻译合成[³⁵S]标记的β-Arrestin1，和细胞表达纯化的PS1-NTF、PS1-CTF、Nicastrin、APH-1AL和PEN-2分别共孵育，通过Pull-down实验检测β-Arrestin1和γ-分泌酶组分之间的相互作用。放射自显影显示β-Arrestin1结合APH-1AL，但是不结合PS1-NTF、PS1-CTF、nicastin或PEN-2。 

用免疫共沉淀实验验证β-Arrestin1和APH-1AL的细胞内相互作用。如图18所示，β-Arrestin1只结合APH-1AL，但是不结合γ-分泌酶的其它组分，如PS1-NTF、PS1-CTF、Nicastrin和PEN-2。由于Triton X-100能够完全破坏各组分之间的相互作用，完全解离γ-分泌酶，因此β-Arrestin1和APH-1AL的相互作用是特异的，并且不依赖于γ-分泌酶的其它组分。 

本发明人通过激光共聚焦显微荧光染色实验发现β-Arrestin1和APH-1AL在细胞内形成点状分布的共定位，而且在细胞核外周的胞质内形成连续的囊泡状共定位分布(图19)。 

本发明人还发现β-Arrestin1不结合APP或β-分泌酶(BACE1)。如图20所示，通过免疫共沉淀实验发现，细胞中过表达的APP和BACE1都不与β-Arrestin1发生共沉淀。这一结果进一步显示，β-Arrestin1特异性地作用于Aβ产生途径中的γ-分泌酶，对另一蛋白酶β-分泌酶及其底物APP都没有相互作用。 

为了检验受体信号是否能够对β-Arrestin1和APH-1AL的相互作用产生动态影响，本发明人通过免疫共沉淀实验检测β2AR被激活后β-Arrestin1和APH-1AL相互作用的作用。本发明人发现β2AR的激动剂isoproterenol(ISO)刺激后，β-Arrestin1和APH-1AL的共沉淀没有发生明显变化(图21)。 

APH-1AS是APH-1AL的羧基端变异体，是通过mRNA的可变剪切产生。APH-1B则是APH-1A的同源蛋白质[Francis,R.et al.aph-1and pen-2are required for Notch pathway signaling,γ-secretase cleavage of β APP,and presenilin protein accumulation.Dev.Cell3(1),85-97(2002)]。如图22所示，免疫共沉淀实验显示APH-1AS不结合β-Arrestin1，提示APH-1AL的羧基端可能是结合β-Arrestin1必需的。 

用抗β-Arrestin1抗体A1CT免疫沉淀HEK293T细胞中的β-Arrestin1，Western杂交实验显示内源表达的APH-1AL被共沉淀(图23)，这种共沉淀能够被CT20(APH-1AL羧基末端20个氨基酸残基构成的肽段)竞争，说明内源表达的β-Arrestin1和APH-1AL发生相互作用，并且这种相互作用是依赖于APH-1AL的羧基端。 

本发明人用抗APH-1AL的抗体A1.2免疫特异性地沉淀含有APH-1AL的γ-分泌酶，发现其复合体蛋白质水平和蛋白酶活性在病人组织中上升了约40%(图25)。另外一方面，本发明人发现β2AR被激活后并不影响含有APH-1AL的γ-分泌酶复合体蛋白质水平(图26)，说明β-Arrestin1和β2AR通过截然不同的机制调控γ-分泌酶的活性。 

为了分析β-Arrestin1和APH-1AL结合必需的区域，本发明人构建了一系列β-Arrestin1突变体(图27)，将它们克隆入载体后转化HEK293T细胞，裂解细胞后进行免疫共沉淀。免疫共沉淀实验显示，β-Arrestin1羧基端结构域缺失的突变体(1-180和1-240)不能结合APH-1AL(图28)。而且，1-180和1-240也不能增强γ-分泌酶活性(图29)。然而，缺失羧基末端的β-Arrestin1突变体1-360能够结合APH-1AL和增强γ-分泌酶活性。另一方面，β-Arrestin1的氨基端结构域缺失的突变体(181-418和241-418)能够结合APH-1AL和增强γ-分泌酶活性。β-Arrestin1第241-360氨基酸残基构成的片断能够结合APH-1AL和增强γ-分泌酶活性。综上所述，β-Arrestin1调控γ-分泌酶活性是依赖于其第241-360氨基酸残基和APH-1AL的相互作用。 

实施例3.β-Arrestin1调控γ-分泌酶复合体组装 

APH-1AL是γ-分泌酶复合体中组装形成过程中的支架蛋白，它对于形成稳定和有活性的γ-分泌酶多蛋白大分子量复合体是必需的[Niimura,M.et al.Aph-1contributes to the stabilization and trafficking of the γ-secretase complex throughmechanisms involving intermolecular and intramolecular interactions.J.Biol.Chem.280(13),12967-12975(2005)]。APH-1AL缺失或突变都能够导致γ-分泌酶无法组装和激活[Lee,S.F.et al.A conserved GXXXG motif in APH-1is critical for assembly andactivity of the γ-secretase complex.J.Biol.Chem.279(6),4144-4152(2004)]。为了检验β-Arrestin1是否影响了γ-分泌酶的组装和激活过程，本发明人利用甘油梯度离心实验从小鼠海马组织提取物中分离γ-分泌酶复合体，用Western杂交实验分析各分子量组分中的蛋白质复合体含量，用γ-分泌酶荧光底物活性实验检测各分子量组分中的γ-分泌酶活性。如图30所示，Western杂交实验检测甘油梯度离心分离组分后发现，β-Arrestin1主要分布于低分子量的分离组分(66-150kDa)中，和低分子量蛋白质复合体(约150kDa分子量的APH-1AL和未成熟的Nicastrin二聚复合体)或者高分子量蛋白质复合体(200-669kDa以上分子量的PS1、成熟的Nicastrin、APH-1A和PEN-2四聚复合体)没有明显的共分布。值得注意的是，分子量为150kDa和200-443kDa的γ-分泌酶蛋白质复合体在β-Arrestin1基因敲除小鼠海马组织中的分布水平相比野生型小鼠海马组织都明显下降。与此结果相一致，实验显示β-Arrestin1基因敲除小鼠组织中γ-分泌酶各个组分分子的蛋白质水平下降了20-40%，反映了这些分子无法组装形 成γ-分泌酶复合体后发生的降解作用(图31)。然而，β-Arrestin1基因敲除和野生型小鼠海马组织中，APP在各分子量组分中的分布没有明显差异。用γ-分泌酶荧光底物活性实验检测蛋白酶活性发现，具有蛋白酶活性的γ-分泌酶复合体主要富集于第8组分，其分子量约为240kDa。而且，β-Arrestin1基因敲除小鼠组织的第8组分中的γ-分泌酶蛋白质含量也明显下降。检测第8组分中的γ-分泌酶蛋白酶比活(单位含量蛋白酶的酶切活性)后发现，β-Arrestin1基因敲除并不影响γ-分泌酶的比活，说明γ-分泌酶的催化能力不受β-Arrestin1影响(图32)。 

本发明人用免疫共沉淀实验分析了β-Arrestin1基因敲除和野生型小鼠海马组织中的γ-分泌酶复合体水平，发现β-Arrestin1基因敲除小鼠组织中和APH-1AL共沉淀的PS1、Nicastrin和PEN-2的水平明显下降，说明γ-分泌酶复合体水平发生下降(图33)，而且γ-分泌酶复合体的蛋白酶活性也明显下降(图34)。 

本发明人用分别转染了β-gal、野生型β-Arrestin1或1-240突变体质粒的Neuro-2a神经母细胞瘤细胞进行了相似的甘油梯度分离蛋白质复合体实验(图35)。实验结果显示，过表达β-Arrestin1增加了分子量约为150kDa的APH-1AL/Nicastrin复合体和分子量为200-443kDa的完整的γ-分泌酶复合体的表达水平。然而，过表达缺失APH-1AL结合区域的1-240突变体对γ-分泌酶复合体的表达水平没有明显作用。由于1-240突变体不能结合APH-1AL或增强γ-分泌酶活性，这一现象和前述结果一致。而且，过表达β-Arrestin1也不影响第8组分中的γ-分泌酶比活(图36)。 

以上实验结果提示，β-Arrestin1通过影响γ-分泌酶复合体的组装过程调控γ-分泌酶活性。 

为了验证以上结论，本发明人从细胞中免疫沉淀γ-分泌酶复合体进行分析(图37)。γ-分泌酶复合体的组装过程是从形成APH-1/Nicastrin两聚中间体起始的，然后结合早老蛋白/PEN-2复合体或者依次结合早老蛋白和PEN-2形成完整的四聚体复合体。缺失早老蛋白将导致细胞中的Nicastrin无法成熟，PEN-2表达下降，APH-1/Nicastrin二聚中间体积累，以及无法形成完整的γ-分泌酶四聚体复合体和蛋白酶活性。因此，缺失早老蛋白的细胞是研究γ-分泌酶复合体组装的非常有用的工具。本发明人用抗APH-1AL抗体A1.2从野生型小鼠胚胎上皮细胞的CHAPSO提取物中免疫沉淀了大量内源表达的APH-1AL和γ-分泌酶其它组分PS1、Nicastrin和PEN-2。CHAPSO能够保持γ-分泌酶复合体的完整性，而Triton X-100则能够完全破坏γ-分泌酶复合体。因此，用A1.2只能从野生型小鼠胚胎上皮细胞的Triton X-100提取物中免疫沉淀APH-1AL，但是不能共沉淀PS1、Nicastrin或PEN-2。有趣的是，CHAPSO提取物中被免疫共沉淀的β-Arrestin1水平远比Triton X-100提取物中得到的低，显示了β-Arrestin1更容易结合没有形成复合体的APH-1AL。 

本发明人还发现，野生型和早老蛋白敲除的小鼠胚胎上皮细胞Triton X-100提取物中免疫共沉淀的β-Arrestin1水平相当，显示β-Arrestin1和APH-1AL的相互作用不依赖于早老蛋白。如果用小干扰RNA抑制β-Arrestin1的表达，则明显降低了野生型 细胞CHAPSO提取物中免疫沉淀的γ-分泌酶组分的水平。此结果提供证据支持了β-Arrestin1调控γ-分泌酶复合体表达水平的结论。如果用小干扰RNA抑制早老蛋白敲除细胞的β-Arrestin1的表达，则明显降低了CHAPSO提取物的共沉淀的Nicastrin水平，显示了β-Arrestin1参与调控APH-1/Nicastrin两聚中间体的形成过程。 

以上实验结果显示了β-Arrestin1通过结合APH-1AL影响形成APH-1AL/Nicastrin中间复合体和完整的γ-分泌酶复合体的过程，从而调控γ-分泌酶的蛋白酶活性。 

实施例4.改变β-Arrestin1的表达水平影响阿尔兹海默症病理变化 

由于已发现β-Arrestin1基因敲除小鼠大脑皮层和海马组织中的Aβ水平下调，表明抑制β-Arrestin1的表达有可能降低Aβ的产生和积累，提示抑制β-Arrestin1的表达具有潜在的临床应用价值。为了研究这一可能性，本发明人利用转基因小鼠模型TgCRND8进行动物实验，通过注射表达β-Arrestin1小干扰RNA的慢病毒降低小鼠海马组织内的β-Arrestin1表达水平。在对侧的海马组织内注射表达LacZ小干扰RNA的慢病毒作为对照。如图38所示，慢病毒表达的GFP显示了慢病毒在海马内的表达区域和水平，表达β-Arrestin1和LacZ小干扰RNA的慢病毒表达水平相当，主要感染了海马的齿状回区神经元，分布于胞体和树突上，在轴突上也有一定分布。用抗β-Arrestin1抗体进行免疫组织化学实验检测β-Arrestin1的表达(图38)，发现β-Arrestin1小干扰RNA显著地抑制了β-Arrestin1的表达。用抗Aβ抗体6E10进行免疫组织化学实验检测淀粉样蛋白斑(图38)，发现在注射了表达β-Arrestin1小干扰RNA的慢病毒的一侧海马组织中，淀粉样蛋白斑明显减少。在没有注射慢病毒的其他脑区(如皮层)中，双侧组织中的淀粉样蛋白斑没有明显差异。分析图像并统计后证实了以上发现，抑制海马的β-Arrestin1表达缺失减少了淀粉样蛋白斑的数量，作为对照的双侧皮层组织中的淀粉样蛋白斑数量没有差异(图39)。 

此外，通过酶联免疫吸附实验测量注射过慢病毒的TgCRND8小鼠大脑组织中的Aβ₄₀和Aβ₄₂水平后发现，感染了表达β-Arrestin1小干扰RNA的慢病毒的海马组织中的Aβ₄₀和Aβ₄₂水平都明显下降。作为对照，没有被慢病毒感染的皮层组织中的Aβ₄₀和Aβ₄₂水平则没有差异(图40)。 

此外，通过荧光底物活性实验检测TgCRND8小鼠大脑组织中的γ-分泌酶活性后发现，在感染了表达β-Arrestin1小干扰RNA的慢病毒的一侧海马组织中，γ-分泌酶活性明显下降。作为对照，在没有被慢病毒感染的双侧皮层组织中，γ-分泌酶活性则没有差异(图41)。 

为了在TgCRND8小鼠模型中验证β-Arrestin1调控γ-分泌酶活性的分子机制，本发明人通过注射表达野生型β-Arrestin1和1-240突变体的慢病毒改变小鼠海马组织内的β-Arrestin1表达水平。如图42所示，慢病毒表达的GFP显示了慢病毒在海马内的表达区域和水平，对照、野生型β-Arrestin1和1-240突变体的慢病毒表达水平相当，主要感染了海马的齿状回区神经元，分布于胞体和树突上，在轴突上也有一定分布。 用抗Aβ抗体6E10进行免疫组织化学实验检测淀粉样蛋白斑(图42)，发现在注射了表达野生型β-Arrestin1的慢病毒的一侧海马组织中，淀粉样蛋白斑明显增加，而在注射了表达1-240突变体的慢病毒的一侧海马组织中，淀粉样蛋白斑没有明显变化。在没有注射慢病毒的其他脑区(如皮层)中，组织中的淀粉样蛋白斑没有明显差异(图42)。分析图像并统计后证实了以上发现，增加海马的β-Arrestin1表达确实增加了淀粉样蛋白斑的数量，作为对照的皮层组织中的淀粉样蛋白斑数量没有差异(图43)。 

此外，通过酶联免疫吸附实验测量注射过慢病毒的TgCRND8小鼠大脑组织中的Aβ₄₀和Aβ₄₂水平后发现，感染了表达野生型β-Arrestin1的慢病毒的海马组织中的Aβ₄₀和Aβ₄₂水平都明显增加，而感染了表达1-240突变体的慢病毒的海马组织中的Aβ₄₀和Aβ₄₂水平都没有变化。作为对照，没有被慢病毒感染的皮层组织中的Aβ₄₀和Aβ₄₂水平则没有差异(图44)。 

此外，通过荧光底物活性实验检测TgCRND8小鼠大脑组织中的γ-分泌酶活性后发现，在感染了表达野生型β-Arrestin1的慢病毒的海马组织中，γ-分泌酶活性明显增加，而感染了表达1-240突变体的慢病毒的海马组织中的γ-分泌酶活性没有变化。作为对照，在没有被慢病毒感染的双侧皮层组织中，γ-分泌酶活性则没有差异(图45)。 

实施例5.在AD模型小鼠中敲除β-arrestin1可以有效缓解其学习认知记忆障碍 

为了验证β-arrestin1在体内条件下对AD发病进程的影响，本发明人将AD模型小鼠APP/PS1转基因小鼠与β-arrestin1敲除小鼠进行杂交，并得到β-arrestin1敲除的APP/PS1小鼠。所有小鼠年龄并没有显著区别，均匀分布在7-9个月。APP/PS1小鼠可以表现出年龄相关的β-淀粉样蛋白沉淀斑块及学习认知记忆缺陷。于是，本发明人首先利用新颖性探求实验检测了β-arrestin1敲除对小鼠认知记忆的影响。如图46左图所示，四种基因型小鼠(βarr+/+，βarr-/-，βarr+/+APP/PS1，βarr-/-APP/PS1)在训练阶段，面对两个相同物体时，并没有表现出偏好性(与两个物体互动时间各占约50%)，表明对两个相同物体同等熟悉；1小时后，将其中一个物体替换为新物体，发现非APP/PS1转基因小鼠(βarr+/+，βarr-/-)对新物体表现出更大的偏好性(与新物体平均互动时间达到70-80%)，且β-arrestin1在非转基因小鼠中的敲除并不会对此产生影响，这与之前的报道一致(图46右图)；而βarr+/+APP/PS1小鼠并没有对新物体表现出偏好性，β-arrestin1敲除后的βarr-/-APP/PS1小鼠则与新物体平均互动时间达到70-80%，对各组认知指数(Recognition Index)进行One-way ANOVA分析表明其认知记忆缺陷得到了明显缓解(图46右图)。 

进一步利用Morris水迷宫实验检测β-arrestin1敲除对小鼠学习及空间记忆的影响。如图47所示，在不可见平台阶段，βarr+/+APP/PS1小鼠表现出比野生型同窝小鼠(βarr+/+)更低的学习能力(到达平台的时间增加，P<0.001)，而βarr-/-APP/PS1小鼠到达平台的时间相比βarr+/+APP/PS1小鼠明显减少(P=0.0145)，表明其学习能力得到了显著改善。 

在不可见平台训练结束后，即第11天进行probe trial以检测小鼠的空间记忆能力。结果发现，与βarr+/+APP/PS1小鼠相比，βarr-/-APP/PS1小鼠在目标象限(即不可见平台训练时平台所在象限)中花了更多时间搜寻平台，表明βarr-/-APP/PS1小鼠的空间记忆能力得到了显著的改善(图48)。各组小鼠在probe trial中的典型搜寻轨迹如图42所示。另外，APP/PS1转基因以及β-arrestin1的敲除并不影响小鼠在水迷宫中的游泳距离和游泳速度，表明不影响其运动能力(图49)。 

综上所述，在APP/PS1小鼠中敲除β-arrestin1可以显著改善其学习认知及空间记忆能力，而并不会影响其一般运动能力。 

在进行完行为学实验后，所有小鼠被处死并进行后续AD相关的生化分析。如图50所示，APP/PS1小鼠脑组织中积累了典型的β-淀粉样蛋白沉淀斑块，而β-arrestin1敲除后的APP/PS1小鼠脑组织中β-淀粉样蛋白沉淀斑块显著减少。利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠脑组织中的Aβ40和Aβ42含量，结果显示，β-arrestin1敲除后的APP/PS1小鼠脑中海马区及皮层区的可溶性及不可溶性的Aβ40和Aβ42含量都显著降低(图51)。 

利用荧光底物酶活实验检测β-arrestin1敲除的APP/PS1小鼠脑组织中α-,β-和γ-分泌酶的活性，发现β-arrestin1敲除后，γ-分泌酶活性显著降低，而α-和β-分泌酶活性没有显著变化(图52)。 

由于在β-arrestin1敲除小鼠脑组织中发现β-arrestin1并不会影响γ-分泌酶各个组分的表达量(图10)。因此，利用Blue Native-Polyacrylamide GelElectrophoresis(BN-PAGE)，本发明人检测了β-arrestin1对γ-分泌酶复合体组装的影响。在BN-PAGE中，成熟的γ-分泌酶全酶复合体大约是在440KD左右的条带。利用BN-PAGE检测了β-arrestin1敲除后，APP/PS1小鼠脑组织中γ-分泌酶的组装。发现与βarr+/+APP/PS1小鼠相比，βarr-/-APP/PS1小鼠脑组织中γ-分泌酶全酶复合体的形成减少(图53)。值得注意的是，β-arrestin1的敲除并没有完全破坏γ-分泌酶的形成，暗示β-arrestin1只结合并调节了一部分的NCT/APH-1前复合体，并可以在体内条件下调控γ-分泌酶活性及全酶复合体的组装。 

实施例6.干预β-arrestin1/APH-1相互作用可以降低Aβ生成及γ-分泌酶活性 

根据APH-1AL和APH-1B的胞内环及羧基末端序列，本发明人合成了8条相应的短肽(图54)，其序列如图55所示。所有短肽都用FITC荧光标记，并在连接上了11个氨基酸的TAT-tag，TAT-tag已被报道可以帮助短肽穿过细胞膜进入细胞，细胞在被FITC-TAT tag标记的短肽处理后，并没有观察到短肽有的细胞毒作用(图56)。 

用FITC-TAT-tagged短肽处理过表达了β-arrestin1及APH-1AL或者APH-1B的细胞后，发现只有ACT和BCT短肽可以同时抑制β-arrestin1与APH-1AL(APH1-AL)的相互作用，而其它胞内环的短肽则并不能影响其相互作用(图57左图)；在β-arrestin1与APH-1B(APH1-B)的相互作用上，也观察到了相同的结果(图57右图)， 暗示β-arrestin1与APH-1AL或者APH-1B的相互作用是依赖于APH-1AL和APH-1B的羧基末端的，这与图12中β-arrestin1不结合APH1-AS的结果相一致。另外，BCT短肽可以抑制β-arrestin1与APH-1AL相互作用，ACT可以抑制β-arrestin1与APH-1B相互作用，而且β-arrestin18M点突变体同时不结合APH-1AL及APH-1B，表明β-arrestin1可能通过自身同一结构域与APH-1AL及APH-1B发生相互作用。 

为了检测FITC-TAT-tagged短肽对Aβ产生及γ-分泌酶活性的影响，本发明人用FITC-TAT-tagged短肽处理了APPswe HEK293细胞(表达APP swedish突变体的HEK293稳转细胞株；由HEK293细胞株转染APP swedish突变体后，利用嘌呤霉素puromycin筛选得到)，发现只有ACT、BCT短肽可以显著降低Aβ产生(图58)。通过荧光底物酶活实验，发现只有ACT、BCT短肽可以显著降低γ-分泌酶活性，而对α-或β-分泌酶活性并没有影响(图59)，其它胞内环短肽对α-、β-和γ-分泌酶活性都没有影响。 

为了进一步证实上述结论，本发明人检测了可以抑制β-arrestin1/APH-1相互作用的ACT、BCT短肽对γ-分泌酶全酶复合体和NCT/APH-1前复合体的调节作用。如图60所示，HEK293细胞被ACT、BCT短肽处理后，相对于对照组(培养基和AL5短肽处理)，γ-分泌酶全酶复合体形成减少；过表达了β-arrestin1的PS1/2双敲除小鼠胚胎成纤维细胞，被ACT、BCT短肽处理后，相对于对照组(培养基和AL5短肽处理)NCT/APH-1前复合体形成减少(图61)，并且ACT、BCT短肽可以有效抑制β-arrestin1与NCT/APH-1前复合体的共迁移。综上所述，β-arrestin1对γ-分泌酶活性及全酶组装的调节是通过调节其NCT/APH-1前复合体的组装来实现的，而且是依赖于β-arrestin1与APH-1的相互作用的。 

实施例7.沉降法筛选药物 

参照如实施例2中所述的方法，体外转录/翻译合成[³⁵S]标记的β-Arrestin1，和细胞表达纯化的APH-1AL共孵育，构成β-Arrestin1与APH-1AL相互作用的体系。设置以下处理组： 

对照组：不给予候选物质的β-Arrestin1与APH-1AL相互作用的体系，在建立体系后立即用候选物质处理；和 

测试组：给予候选物质的β-Arrestin1与APH-1AL相互作用的体系。 

通过Pull-down实验检测测试组和对照组中β-Arrestin1和γ-分泌酶组分之间的相互作用，利用放射自显影观察β-Arrestin1结合APH-1AL的情况。若相对于对照组，测试组中β-Arrestin1与APH-1AL相互作用在有统计学上显著的减弱，则说明候选物质是预防或治疗阿尔茨海默症的潜在物质。 

实施例8.免疫共沉淀法筛选药物 

参照如实施例2中所述的方法，在HEK293T细胞中共转染FLAG偶联的 β-Arrestin1(βarr1)和HA偶联APH-1A，构成β-Arrestin1与APH-1AL相互作用的体系。设置以下处理组： 

对照组：不给予候选物质的β-Arrestin1与APH-1AL相互作用的体系，在建立体系后立即用候选物质处理；和 

测试组：给予候选物质的β-Arrestin1与APH-1AL相互作用的体系。 

转染48小时后裂解细胞，用偶联抗FLAG抗体的琼脂糖凝胶免疫沉淀β-Arrestin1。Western杂交实验观察APH-1AL被共沉淀的情况。若相对于对照组，测试组中β-Arrestin1与APH-1AL相互作用在有统计学上显著的减弱，则说明候选物质是预防或治疗阿尔茨海默症的潜在物质。 

实施例9.小分子化合物的药物筛选 

采用X射线晶体衍射技术，根据SEQ ID NO:1中第241-360位氨基酸序列设计模拟的蛋白三维结构，采用高通量虚拟筛选技术，以SPECS化合物数据库中的化合物为候选物质。将初步筛选与SEQ ID NO:1中第241-360位氨基酸序列的蛋白有特异性结合作用的化合物进行归类，结果获得了一些经初筛认为潜在有效的候选化合物。 

利用Split-TEV报告基因系统定量化重现β-arrestin1与APH-1AL的相互作用。将β-arrestin1和APH-1AL分别与TEV酶的氮末端（NTEV）和TEV酶的羧基末端（CTEV）偶联，β-arrestin1与APH-1AL相互作用使得NTEV和CTEV靠近并发挥完整TEV酶活性并启动下游报告基因信号，结果如图62。这一报告基因系统可以直接用于干扰β-arrestin1与APH-1AL相互作用的小分子化合物的高通量筛选。 

讨论 

本发明首先发现了β-Arrestin在阿尔兹海默症人大脑组织中的表达水平上升，并且在转基因小鼠模型中也出现了相似的现象。然而，β-Arrestin仅在具有严重病理变化的病人组织样品中出现表达水平上升，提示β-Arrestin的表达可能在疾病发生早期并不产生明显的变化，而是在阿尔兹海默症发展进入后期病程以后受未知因素的影响出现上升。进一步的研究发现，增加β-Arrestin1的表达水平能够增加细胞的Aβ水平。据此推测，在阿尔兹海默症的后期进程中，可能形成了一种由β-Arrestin1介导的反馈机制参与调控阿尔兹海默症的发展，通过阿尔兹海默症引起的β-Arrestin1表达水平上升增加Aβ的产生，加速疾病的发展进程。 

本发明人进一步研究了β-Arrestin1通过增强γ-分泌酶活性增加Aβ产生的现象及其分子机制。发现β-Arrestin1调控γ-分泌酶活性是依赖于和APH-1AL结合后影响γ-分泌酶复合体组装过程实现的。 

γ-分泌酶复合体由早老蛋白、Nicastrin、APH-1和PEN-2组成。Presenlin具有蛋白酶催化活性，是主要的研究对象。Nicastrin是γ-分泌酶的底物识别组分。APH-1 在γ-分泌酶复合体组装过程中起着支架蛋白作用。PEN-2启动γ-分泌酶复合体成熟和激活的功能，并且稳定γ-分泌酶中的早老蛋白氨基端/羧基端二聚体。 

近来的研究发现了很多早老蛋白/γ-分泌酶结合蛋白质，其中某些分子，如CD147、phospholipase D1和TMP21，还被认为是γ-分泌酶的非必需组分并且负调控γ-分泌酶活性。最近发现，endoplasmic reticulum 1 protein(Rer1p)通过和APH-1竞争结合Nicastrin并且负调控γ-分泌酶活性。但是，目前发现的APH-1结合蛋白质非常少，这方面的研究还是一个未知领域。 

本发明人发现，β-Arrestin1是APH-1的结合蛋白质。但是β-Arrestin1并不结合其它三种γ-分泌酶的必需组分，也不存在于γ-分泌酶复合体中。因此，β-Arrestin1并不是γ-分泌酶的组分。β-Arrestin1通过增强APH-1AL/Nicastrin中间体的形成来加速γ-分泌酶复合体组装。这种新颖的调控机制加深了本发明人对于γ-分泌酶这种复杂的蛋白质复合体的了解，为研究以β-Arrestin1为代表的信号通路分子调控γ-分泌酶的方式提供新的切入点。 

本发明人以前的工作中发现了β₂AR通过增强γ-分泌酶活性增加Aβ产生的现象。并且发现这一现象依赖于激动剂引起的β₂AR内吞和γ-secretas向晚期内吞小体/溶酶体的转运。β₂AR被激动剂激活后招募β-Arrestin，β-Arrestin进一步招募内吞相关蛋白质，形成受体内吞机制。敲除或突变β-Arrestin会抑制受体内吞作用，导致β₂AR无法激活γ-分泌酶。本发明人的研究显示，β₂AR通过结合早老蛋白1影响γ-分泌酶。由于β-Arrestin1不结合早老蛋白1，所以不参与介导β₂AR和γ-分泌酶的直接相互作用。β-Arrestin1突变体181-418、241-418和241-360缺失受体结合结构域无法结合β₂AR，但是仍能够结合APH-1AL和增强γ-分泌酶活性。缺失羧基末端的β-Arrestin1突变体1-360和241-360无法结合内吞相关蛋白质clathrin和adaptor protein 2，它们仍能够结合APH-1AL和增强γ-分泌酶活性。这一结果显示，β-Arrestin1不可能利用调控G蛋白偶联受体的机制通过招募内吞相关蛋白质直接引导γ-分泌酶进入内吞途径从而引起γ-分泌酶转运进入内吞小体/溶酶体系统。 

综上，可以发现G蛋白偶联受体和β-Arrestin1展现了两种截然不同的调控γ-分泌酶的方式，也显示了γ-分泌酶其自身的复杂性导致的复杂和精细的受调控机制。通过和γ-分泌酶的相互作用和共内吞机制，激活的G蛋白偶联受体改变了γ-分泌酶在细胞内小泡上的分布，以一种快速和短时程的作用方式影响γ-分泌酶的蛋白酶活性。另一方面，β-Arrestin1则通过直接改变γ-分泌酶复合体的组装过程和活性γ-分泌酶的水平，以一种缓慢和长时程的作用方式影响γ-分泌酶的蛋白酶活性。这两种方式同时存在于细胞内，可能反映了神经元受到不同细胞外信号刺激时的不同应答方式。本发明人目前的研究初步揭示了G蛋白偶联受体和β-Arrestin1在阿尔兹海默症致病机理中作用，显示了将G蛋白偶联受体和β-Arrestin1发展成为阿尔兹海默症治疗新靶点的可能性。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

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