一种负载β-胡萝卜素的壳聚糖基自组装纳米胶束溶液及其制备方法

摘要

本发明公开了一种负载β-胡萝卜素的壳聚糖基自组装纳米胶束溶液及其制备方法。本发明使用咪唑类离子液体作为壳聚糖的有效溶剂，通过丙交酯在催化剂作用下的开环聚合并接枝到壳聚糖大分子链上得到壳聚糖接枝聚乳酸；然后利用壳聚糖接枝聚乳酸在水溶液中的自组装行为实现疏水性β-胡萝卜素的有效包埋。本发明能有效提高β-胡萝卜素水溶性和抗氧化性，且制备工艺简单，条件温和，制备得到的纳米胶束溶液具有良好的稳定性，有望为化妆品领域或功能食品领域提供一种天然有效的稳定载体和水相分散剂。

说明书

技术领域

本发明属于纳米载体技术领域，涉及以天然且生物可降解的壳聚糖为原料 进行疏水化改性的方法，特别涉及一种β-胡萝卜素纳米胶束载体的制备方法 及其应用，为化妆品行业和功能食品行业提供一种天然有效的稳定载体和水相 分散剂。

背景技术

β-胡萝卜素是在自然界中最普遍存在的天然色素，是维护人体健康不可缺 少的营养素。同时作为一种有效的抗氧化剂，它能够有效地清除人体游离自由 基，防止皮肤老化及组织损伤，因此在化妆品和食品领域日益受到广泛关注。 然而，β-胡萝卜素不溶于水，生物利用度低，富含的共轭双键结构使其对光、 热等外界因素较为敏感，稳定性差。目前，寻找适当的方法有效提高β-胡萝 卜素的水溶性和稳定性成为人们关注的热点。

近年来，作为新型的药物载体，聚合物纳米胶束因其具有良好的理化性能 而备受关注。聚合物胶束是由两亲性的聚合物材料在水中自组装形成，具有均 一的纳米尺寸及球形的核-壳型结构。其疏水性内核可有效包载难溶性的药物， 而亲水性的外壳可增强其在水性介质中的稳定性和分散性。特别是壳聚糖，由 于其具有良好的生物可降解性、生物相容性、抗菌性和无毒性等特点，已被广 泛应用于生物、医药、食品、农业等领域。然而，由于壳聚糖的结晶性高，溶 解性差，大大限制了壳聚糖的应用。因此，对壳聚糖进行疏水化改性，提高其 溶解性，扩大其应用领域是壳聚糖研究的一个重要方向。

目前，大部分的的壳聚糖疏水改性是在稀酸性溶液或有机溶剂中进行的， 而有关以离子液体作为溶剂的研究报道则较少。聚乳酸是一种脂溶性的具有良 好的生物可降解性和生物相容性的聚合物，是由美国食品和药物管理局（FDA） 认证的绿色高分子材料。

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用壳聚糖接枝聚乳酸纳米胶束负载β-胡萝 卜素的制备方法。该方法是用自组装纳米胶束对疏水性染料β-胡萝卜素进行 包埋，利用微相萃取作用，将疏水性的染料富集于胶束内核。由本发明方法制 备的纳米胶束，可有效增强β-胡萝卜素的水溶性和化学稳定性，并能有效保 持甚至增强β-胡萝卜素的的抗氧化效果，是一种良好的载体材料。

本发明的另一个目的在于提供由本发明方法制备的纳米胶束溶液，该胶束 溶液能够保持β-胡萝卜素本身的抗氧化性，提供所述的作为抗氧化，防护衰 老的化妆品或功能食品辅料使用。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

一种负载β-胡萝卜素的壳聚糖基自组装纳米胶束溶液的制备方法，包括 以下步骤：

（1）壳聚糖接枝聚乳酸的合成：将壳聚糖溶于咪唑类离子液体中；向上 述溶液中加入丙交酯及催化剂，氮气保护下100～130℃反应12～24h；乙醇沉 淀后重复洗涤，抽提24～48h；真空干燥得到壳聚糖接枝聚乳酸；所述催化剂 为辛酸亚锡或4-二甲氨基吡啶（DMAP）；其中壳聚糖与丙交酯、催化剂的摩 尔比为1：（1～4）：（0.00001～0.1）；

（2）载药纳米胶束溶液的制备：将步骤（1）制备的壳聚糖接枝聚乳酸溶于 超纯水，磁力搅拌下缓慢滴加β-胡萝卜素/四氢呋喃溶液，得到壳聚糖接枝聚 乳酸的混合液；然后将混合液探针超声0.5～2h，旋转蒸发出去四氢呋喃，加水 定容至初始胶束溶液体积后微孔膜过滤，即制得负载β-胡萝卜素的壳聚糖自 组装纳米胶束溶液。

步骤（2）所述壳聚糖接枝聚乳酸的混合液中β-胡萝卜素的浓度为0.05～2.0 mg/mL。

步骤（2）所述微孔膜的孔径为0.22～0.45μm。

步骤（2）中所述的壳聚糖接枝聚乳酸水溶液浓度为0.5～2mg/mL。

步骤（2）中所述超声条件为：输出功率30～400W，脉冲宽度2.0s，间 歇时间2.0s，时间0.5～2h。

步骤（2）中所述的旋转蒸发按照以下条件进行：超声结束后将混合液置 于旋转蒸发仪下旋蒸出去四氢呋喃，优选的温度35℃，时间10～20min。

步骤（1）中所述的壳聚糖的分子量为50～200kDa，脱乙酰度为85～99%。

步骤（1）中所述的咪唑类离子液体为氯化-1-烯丙基-3-甲基咪唑（AmimCl） 或氯化1-丁基-3-甲基咪唑（BmimCl）。

步骤（1）中所述真空干燥的条件为在45～55℃，干燥24～48h。

本发明的发明原理在于：本发明提出利用自组装的壳聚糖基纳米胶束作为 包载β-胡萝卜素的载体，该自组装的胶束以亲水性的壳聚糖骨架作为外壳， 而疏水性的聚乳酸支链作为内核，用于β-胡萝卜素的包载。本发明能有效解 决β-胡萝卜素的水溶性和化学稳定性差、生物利用率低的问题，同时提高了β- 胡萝卜素的抗氧化性质。本发明制备的负载β-胡萝卜素的壳聚糖基自组装纳 米胶束溶液及其对β-胡萝卜素的包载方法可应用于高端化妆品和功能食品领 域。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明使用咪唑类离子液体作为壳聚糖的有效溶剂，通过丙交酯在辛 酸亚锡或4-二甲氨基吡啶催化下开环聚合形成聚乳酸中间体后与壳聚糖的羟 基或氨基反应，得到的壳聚糖接枝聚乳酸；产物具有良好的生物可降解性、无 毒性和生物相容性。

（2）本发明制备的壳聚糖衍生物在水中可自组装形成纳米胶束。通过聚乳 酸的疏水作用形成疏水内核，而壳聚糖的亲水骨架则在疏水内核的外面形成亲 水外壳，大大增强其水溶性。

（3）本发明制备得到的具有独特的核-壳型球形结构的纳米胶束可将疏水 药物富集于疏水内核中，从而增加疏水药物的溶解性，包封率和载药量较高， 为疏水性β-胡萝卜素提供优良的载体，可扩展其优化和应用。

（4）本发明制备得到的负载β-胡萝卜素的壳聚糖基自组装纳米胶束溶液， 制备工艺简单，条件温和，并具有良好的稳定性。

附图说明

图1为实施例1中壳聚糖接枝共聚物的红外光谱图：a为CS的红外光谱 图，b为CS-g-PLA的红外光谱图。

图2为实施例1中壳聚糖接枝共聚物的核磁氢谱图：a为CS的核磁氢谱 图，b为CS-g-PLA的核磁氢谱图。

图3为实施例1中DPPH法测定抗氧化性的结果图。

图4为实施例1中FRAP法测定抗氧化性的结果图。

图5为实施例2中DPPH法测定抗氧化性的结果图。

图6为实施例2中FRAP法测定抗氧化性的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

实施例1

（1）壳聚糖接枝聚乳酸（CS-g-PLA）的制备：称取10g氯化1-烯丙基-3- 甲基咪唑于25mL三口烧瓶，80℃油浴溶解后加入1g壳聚糖（CS，分子量 50kDa，脱乙酰度90%），磁力搅拌4h至分散均匀；再缓慢加入1.8g丙交酯 及100μL辛酸亚锡，氮气保护下升温至130℃反应24h；反应结束后，使用 无水乙醇沉淀，离心后弃去上清液，收集的沉淀继续使用乙醇洗涤4次；然后 在索氏抽提器中用丙酮抽提24h；最后将抽提后的产物在45℃下真空干燥24h， 得到CS-g-PLA，其反应方程式为：

CS-g-PLA的鉴别：红外光谱图中，在1743cm^-1处出现了新的吸收峰， 在2930cm^-1和2880cm^-1处分别为甲基和亚甲基的C-H伸缩振动吸收峰，其强 度明显高于CS，证明CS与聚乳酸（PLA）发生了接枝反应；CS-g-PLA核磁 氢谱中，化学位移1.29和1.05的特征峰对应于聚乳酸末位上和重复单元上的 甲基质子峰，再次证明了CS接枝PLA反应的成功。

（2）载药纳米胶束溶液的制备：将步骤（1）制备的壳聚糖接枝聚乳酸溶于 超纯水；称取5mgβ-胡萝卜素于2mL四氢呋喃中溶解，磁力搅拌下缓慢滴加 至10mL1mg/mL CS-g-PLA水溶液中；超声2h（输出功率75W，脉冲宽度2.0 s，间歇时间2.0s）后，35℃下旋转蒸发15min除去四氢呋喃，并加水定容至 10mL；用0.45μm微孔滤膜过滤除去未包埋的β-胡萝卜素，得到β-胡萝卜素 负载的纳米胶束溶液。

紫外光谱仪（HP8453）457nm处测定β-胡萝卜素胶束溶液的吸光度值， 根据β-胡萝卜素的标准曲线计算出β-胡萝卜素的包封率为42.1%，载药量为 20.5%，纳米胶束中β-胡萝卜素的浓度为205μg/mL。用Malvern粒度仪测定 出其粒径分别为139.4nm。

（3）DPPH法测定抗氧化性：配制浓度为205μg/mLβ-胡萝卜素乙醇溶液 10mL；分别取2mL上述等浓度的β-胡萝卜素/乙醇或步骤(2)中β-胡萝卜素/ 胶束加入2mL40mg/mL DPPH溶液中，室温下避光反应，每隔一段时间用紫 外光谱仪（HP8453）517nm处测定混合溶液的吸光度。DPPH自由基的清除 率结果见图3。从图中可以看出，随着时间的变化，β-胡萝卜素/乙醇和β-胡萝 卜素/胶束具有类似的清除DPPH自由基的趋势。反应40min后β-胡萝卜素/ 胶束的自由基清除率可以达到99%，而β-胡萝卜素/乙醇的清除率在30%左右。 说明纳米胶束包载的β-胡萝卜素保持了原有的抗氧化性质。

（4）FRAP法测定抗氧化性:称取0.31g乙酸钠于容量瓶，加水溶解，再加 入1.6mL冰醋酸，混合后加水定容至100mL,得到0.3mol/L乙酸钠缓冲溶液； 称取2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）31.233mg，溶解于10mL40mmol/L HCl溶 液后,加入10mL20mmol/L FeCl₃水溶液及100mL0.3mol/L乙酸钠缓冲溶 液，混合均匀后得到FRAP工作液；配制浓度为205μg/mLβ-胡萝卜素乙醇溶 液10mL；分别取150μL上述β-胡萝卜素/乙醇和步骤(3)中β-胡萝卜素/胶束， 加入4.5mL FRAP工作液中，37℃下避光反应，每隔一段时间用紫外光谱仪 （HP8453）593nm处测定混合溶液的吸光度。FRAP法抗氧化性的结果见图 4。由图可以看出，β-胡萝卜素乙醇体系FRAP值随着时间的变化而逐渐增大， β-胡萝卜素/胶束也有类似的变化趋势，但其FRAP值略高于前者。充分证明 了纳米胶束包载的β-胡萝卜素能够保持原有的抗氧化性。

实施例2

（1）CS-g-PLA的制备:称取10g氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑于25mL三口烧 瓶，80℃油浴溶解后加入1g CS（分子量50kDa，脱乙酰度90%），磁力搅拌 4h至分散均匀；再缓慢加入1.8g丙交酯及100μL辛酸亚锡，氮气保护下升 温至130℃反应24h；反应结束后，使用无水乙醇沉淀并重复洗涤；然后用丙 酮抽提24h；最后将抽提后的产物在45℃下真空干燥24h。

（2）载药纳米胶束溶液的制备：将步骤（1）制备的壳聚糖接枝聚乳酸溶于 超纯水；称取10mgβ-胡萝卜素于2mL四氢呋喃中溶解，磁力搅拌下缓慢滴 加至10mL1mg/mL CS-g-PLA水溶液中；超声2h（输出功率75W，脉冲宽 度2.0s，间歇时间2.0s）后，35℃下旋转蒸发15min，并加水定容至10mL； 用0.45μm微孔滤膜过滤后，得到负载β-胡萝卜素的纳米胶束溶液。

紫外光谱仪（HP8453）457nm处测定β-胡萝卜素胶束溶液的吸光度值， 根据β-胡萝卜素的标准曲线计算出β-胡萝卜素的包封率为41.1%，载药量为 41.1%，纳米胶束中β-胡萝卜素的浓度为411μg/mL。用Malvern粒度仪测定 出其粒径分别为144.4nm，此胶束溶液4℃保存8天，其粒径基本保持不变， 因而具有良好的稳定性。

（3）DPPH法测定抗氧化性：配制浓度为411μg/mLβ-胡萝卜素乙醇溶液 10mL；分别取2mL等浓度的β-胡萝卜素/乙醇或步骤(2)中β-胡萝卜素/胶束 于试管中，加入2mL40mg/mL DPPH溶液中，室温下避光反应。每隔一段时 间用紫外光谱仪（HP8453）517nm处测定混合溶液的吸光度。DPPH自由基 的清除率结果见图5。从图中可以看出，随着时间的变化，β-胡萝卜素/乙醇和 β-胡萝卜素/胶束具有类似的清除DPPH自由基的趋势。反应10min后β-胡萝 卜素/胶束的自由基清除率几乎可以达到100%，而β-胡萝卜素/乙醇的清除率 不到60%。说明纳米胶束包载的β-胡萝卜素保持甚至增强了原有的抗氧化性 质。

（4）FRAP法测定抗氧化性：称取2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）31.233mg 溶于10mL40mmol/L HCl溶液后,加入10mL20mmol/L FeCl₃水溶液及100 mL0.3mol/L乙酸钠缓冲溶液,混合均匀后得到FRAP工作液；配制浓度为β- 胡萝卜素乙醇溶液10mL；分别取150μL411ug/mLβ-胡萝卜素/乙醇和步骤(2) 中β-胡萝卜素/胶束加入4.5mL FRAP工作液中，37℃下避光反应，每隔一段 时间用紫外光谱仪（HP8453）593nm处测定混合溶液的吸光度。FRAP法抗 氧化性的结果见图6。由图可以看出，β-胡萝卜素/乙醇和β-胡萝卜素/胶束溶 液的FRAP值都是随着时间的变化而逐渐增大，但β-胡萝卜素/胶束的FRAP 值明显高于。充分证明了纳米胶束包载的β-胡萝卜素能够有效保持甚至增强 原有的抗氧化性。

实施例3

（1）CS-g-PLA的制备:称取10g氯化1-丁基-3-甲基咪唑于25mL三口烧瓶， 80℃油浴溶解后加入1g CS（分子量100KDa，脱乙酰度85%），磁力搅拌4h 至分散均匀；再缓慢加入1.8g丙交酯及0.758g4-二甲氨基吡啶，氮气保护下 升温至130℃反应24h；反应结束后，使用无水乙醇沉淀，离心后弃去上清液， 收集的沉淀继续使用乙醇洗涤4次；然后用丙酮抽提24h；最后将抽提后的产 物在45℃下真空干燥24h。

（2）载药纳米胶束溶液的制备：将步骤（1）制备的壳聚糖接枝聚乳酸溶于 超纯水；称取0.6mgβ-胡萝卜素于2mL四氢呋喃中溶解，磁力搅拌下缓慢滴 加至10mL1mg/mL CS-g-PLA水溶液中；超声2h（输出功率90W，脉冲宽 度2.0s，间歇时间2.0s）后，35℃下旋转蒸发15min后，加水定容至10mL； 用0.45μm微孔滤膜过滤后，得到负载β-胡萝卜素的纳米胶束溶液。

紫外光谱仪（HP8453）457nm处测定β-胡萝卜素胶束溶液的吸光度值， 根据β-胡萝卜素的标准曲线计算出β-胡萝卜素的包封率为59.17%，载药量为 2.96%，纳米胶束溶液中β-胡萝卜素的浓度为29.6μg/mL。用Malvern粒度仪 测定出其粒径分别为64.72nm。

上述实施例为本发明的一些实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。