一株从烟末浓缩液分离的枯草芽孢杆菌SM及其在造纸法再造烟叶中的应用

摘要

本发明涉及造纸法再造烟叶生产领域，尤其涉及一株从烟末浓缩液分离的增香菌及其应用。本发明所述的枯草芽孢杆菌SM（BacillussubtilisstrainSM）是从杭州利群环保纸业公司提供的烟末浓缩液中筛选得到，通过GC-MS检测分析、闻香和感官评吸结果显示，枯草芽孢杆菌SM通过增加烟末浓缩液的香气量，可提升再造烟叶制品的香气，并可减轻杂气和降低刺激性，在造纸法再造烟叶生产工艺上具有广泛的工业化应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及造纸法再造烟叶生产领域，尤其涉及一株从烟末浓缩液分离的增香菌及其应用。

背景技术

目前国内造纸法再造烟叶生产工艺的流程是：将烟末和烟梗中的水溶性物质用水萃取,同时分离纤维和不溶物。固液分离后,固体部分打浆抄造制成纸基,液体部分浸取浓缩成浓缩液，再喷涂或浸润到纸基上，最后干燥加香，制成再造烟叶，并回用于卷烟厂。从而使得废次烟草及传统烟草加工过程中烟末等废弃物得到充分利用。

造纸法再造烟叶虽然是烟草废弃物综合利用的一种新工艺，但在很大程度上只是原材料的物理重组过程, 烟叶原料的内在质量缺陷（如杂气重、香气量不足等）无法有效改善，影响了再造烟叶在成品卷烟中的使用。而在其工艺环节水提液（母液或浓缩液）中的微生物，可能对再造烟叶的品质有重要影响，因此对这些微生物的培养和功能分析就显得十分必要，特别是从再造烟叶工艺的浓缩液（烟末或烟梗）中分离出具有一定功能的微生物。目前利用微生物来提升造纸法再造烟叶工艺中烟末浓缩液及其再造烟叶制品的香气未见相关报道。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的一个目的的是提供枯草芽孢杆菌SM（Bacillus subtilis strain SM），该菌株是从造纸法再造烟叶生产工艺线的烟末浓缩液中分离筛选得到，并可应用于提升烟末浓缩液的香气。本发明的另外一个目的是提供上述的菌株在造纸法再造烟叶制品增香中的应用。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

枯草芽孢杆菌SM（Bacillus subtilis strain SM），该枯草芽孢杆菌SM保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏日期：2013年9月25日，保藏编号：CCTCC NO: M 2013443。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

上述的枯草芽孢杆菌SM的用途，该用途用于烟末浓缩液的增香。作为优选，该用途为在烟末浓缩液中添加10%体积百分比的枯草芽孢杆菌SM，36~38℃醇化3~10天。

本发明要求保护的产品如下：

一种烟末浓缩液，该烟末浓缩液中添加上述的枯草芽孢杆菌SM。作为优选，该烟末浓缩液中添加10%体积百分比的枯草芽孢杆菌SM，36~38℃醇化3~10天。

一种再造烟叶制品，该再造烟叶制品涂布有上述的烟末浓缩液。

一种卷烟制品，该卷烟制品采用上述的再造烟叶制品。

本发明所述的枯草芽孢杆菌SM（Bacillus subtilis strain SM）是从杭州利群环保纸业公司提供的烟末浓缩液中筛选得到，通过GC-MS检测分析、闻香和感官评吸结果显示，枯草芽孢杆菌SM通过增加烟末浓缩液的香气量，可提升再造烟叶制品的香气，并可减轻杂气和降低刺激性，在造纸法再造烟叶生产工艺上具有广泛的工业化应用前景。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌SM（Bacillus subtilis strain SM）菌株的革兰氏染色图。

图2为枯草芽孢杆菌SM（Bacillus subtilis strain SM）菌株的电镜观察图。

图3为枯草芽孢杆菌SM（Bacillus subtilis strain SM）菌株的系统进化树分析图。

图4为对照样品和10%的增香菌烟末浓缩液样品的总离子流比较图。

微生物保藏声明

枯草芽孢杆菌SM（Bacillus subtilis strain SM），该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2013年9月25日，保藏编号：CCTCC NO: M 2013443。

具体实施方式

材料与方法

造纸法再造烟叶生产工艺中的烟末浓缩液，由杭州利群环保纸业公司提供

1.1样品富集培养：

配制LB液体培养，取2mL样品分别接种到装有100mL的LB培养基的三角瓶中，将三角瓶在30℃的摇床中培养，2-3天，待其培养液呈现明显的浑浊。

由于样品中菌体量是很少的，我们先对样品中的菌体进行富集培养。注：LB培养基配方：蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl  10g/L，蒸馏水 1000mL；LB固体培养基：在LB液体培养基中每升加入15-20g琼脂粉，调pH至7.0。

样品中可培养微生物的分离：

将富集培养完成后的菌液用涂布平板法在R₂A培养基平板上进行均匀涂布，再在30℃恒温培养箱中培养3-5天，待平板上长出单菌落。（若富集培养后菌液浓度过高，需要分别做稀释10倍，100倍，1000倍后的涂布平板；使用的平板规格：90mm）

   R₂A培养基：1L培养基中：酵母提取物0.5g，蛋白胨0.5g，葡萄糖0.5g淀粉0.5g，K₂HPO₄  0.3g，丙酮酸纳0.3g，MgSO₄  0.05g，琼脂15g（加琼脂前调pH为7.2），1ml的微量元素溶液和10ml维生素溶液（注：维生素采用过滤除菌，并且在超净台中最后加入到培养基中。）。

功能菌的筛选和分离：

将涂布平板上长出的单菌落转接到筛选平板，采用平板划线法进行单菌落转接，转接好后，将平板置于30℃恒温培养箱中培养3-5天；将筛选平板上筛选到的目的菌，在筛选平板上进行多次转接纯化，直至整个平板上为单一菌种。

培养基（基本无机盐培养基）：Na₂HPO₄  5.57 g/L，KH₂P0₄  2.44 g/L，K₂S0₄  1 g/L，MgCl₂·6H₂ O  0.2 g/L，MnCl₂·4H₂ O  0.0004g/L，FeCl₃·6H₂ O  0.001 g/L，CaCl₂  0.001g/L，尼古丁(含量根据需要添加)，pH=7.0。

功能菌的摇瓶发酵试验：

将纯化出的目的菌，从平板上挑取单菌落接种到液体筛选培养基中，将摇瓶置于30℃的摇床中培养2-3天，观察其生长状况。

菌种鉴定和保藏:

分别取固体培养基菌落进行形态和生理生化试验。对分离得到的菌株进行革兰氏染色、拍照，并进行电镜拍照．生理生化实验参照文献(东秀珠，2001)进行。     

16S rDNA序列和系统发育分析用水煮法提取细菌总DNA，采用细菌16S rDNA的通用引物(上海英骏生物技术有限公司合成，其正向引物序列：5’-AGAGTl3"GATCCTGGCTCAG-3’，反向引物序列为：反向引物序列为：5’-CGGCTACCTTGTFACGACTI'C-3’ (Weisburg，1991))进行16S rDNA的PCR扩增．PCR产物的纯化和测序由上海英俊公司完成．测序结果利用BlastGenBank基因库中进行同源性比较和鉴定，将16S rDNA序列和与其同源性高的序列用DNASTARver.7.1.0中的multiple sequence alignment software CLUSTAL W分析，并用Megalign构建系统发育树。

结果与讨论

2.1 SM菌株鉴定：

   经形态学分析（图1, 图2），该菌为革兰氏阳性，有芽孢； 

   生理生化试验显示,该菌接触酶实验阳性，V-P实验阳性；水解淀粉阳性,硝酸盐还原阴性,柠檬酸盐利用阳性，丙酸盐利用阴性，5℃生长，55℃不生长。

   菌株16S rDNA测序分析结果如seqNO.1所示, 经BLAST比对和系统进化树分析（图3），该菌属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain）。保藏于武汉大学菌种保藏中心（保藏号：CCTCC NO: M 2013443）。

检测分析结果

取空白对照样品、10%的增香菌样品各1ml分别于50ml三角瓶中，先加入5ml甲醇摇匀，再加入3ml的二氯甲烷，超声10min。分别取混浊液4ml于离心管中。离心10min，取上清液进GC-MS分析。对照样品、10%的增香菌样品的两张谱图叠加结果如图4所示。

   采用面积归一化得到空白对照样品和10%的增香菌样品检测到的不同组分各自百分含量，经分析比较，含量明显增加的致香化合物有：5-羟甲基-2-糠醛、巨豆三烯酮、3-羟基-B-大马酮、n-棕榈酸、(Z,Z,Z)-9,12,15- 十八碳三烯酸甲酯、菜油甾醇、豆甾醇等。

感官评吸结果

利用前期在烟末浓缩液中分离得到的菌种SM，经过扩培，添加回新鲜浓缩液，醇化后，涂布，卷制成样品。

浓缩液中添加10%菌种SM，37℃醇化5天后，10%的增香菌样品同空白对照样相比，在闻香方面：香气量略有增加且闻香较特殊；卷制成再造烟叶制品进行感官评价：烟支整体烟气有所改善，香气略有增加，杂气稍有减轻，特别是口腔的毛刺感、粗糙感微有降低。

序列表

<110>浙江中烟工业有限责任公司

<120>枯草芽孢杆菌SM及其在卷烟增香中的应用

<160>1

 

<210> 1

<211> 1240

<212> 16s rDNA

<213>枯草芽孢杆菌SM（Bacillus subtilis strainSM）

<400> 1

       1 TGCaAGTCGA GCGGACAGAT GGGAGCTTGC TCCCTGATGT TAGCGGCGGA CGGGTGAGTA       

 61 ACACGTGGGT AACCTGCCTG TAAGACTGGG ATAACTCCGG GAAACCGGGG CTAATACCGG       

121 ATGGTTGTTT GAACCGCATG GTTCAAACAT AAAAGGTGGC TTCGGCTACC ACTTACAGAT       

181 GGACCCGCGG CGCATTAGCT AGTTGGTGAG GTAACGGCTC ACCAAGGCAA CGATGCGTAG       

241 CCGACCTGAG AGGGTGATCG GCCACACTGG GACTGAGACA CGGCCCAGAC TCCTACGGGA       

301 GGCAGCAGTA GGGAATCTTC CGCAATGGAC GAAAGTCTGA CGGAGCAACG CCGCGTGAGT       

361 GATGAAGGTT TTCGGATCGT AAAGCTCTGT TGTTAGGGAA GAACAAGTAC CGTTCGAATA       

421 GGGCGGTACC TTGACGGTAC CTAACCAGAA AGCCACGGCT AACTACGTGC CAGCAGCCGC       

481 GGTAATACGT AGGTGGCAAG CGTTGTCCGG AATTATTGGG CGTAAAGGGC TCGCAGGCGG       

541 TTTCTTAAGT CTGATGTGAA AGCCCCCGGC TCAACCGGGG AGGGTCATTG GAAACTGGGG       

601 AACTTGAGTG CAGAAGAGGA GAGTGGAATT CCACGTGTAG CGGTGAAATG CGTAGAGATG       

661 TGGAGGAACA CCAGTGGCGA AGGCGACTCT CTGGTCTGTA ACTGACGCTG AGGAGCGAAA       

721 GCGTGGGGAG CGAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCAC GCCGTAAACG ATGAGTGCTA       

781 AGTGTTAGGG GGTTTCCGCC CCTTAGTGCT GCAGCTAACG CATTAAGCAC TCCGCCTGGG       

841 GAGTACGGTC GCAAGACTGA AACTCAAAGG AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGTGGAG       

901 CATGTGGTTT AATTCGAAGC AACGCGAAGA ACCTTACCAG GTCTTGACAT CCTCTGACAA       

961 TCCTAGAGAT AGGACGTCCC CTTCGGGGGC AGAGTGACAG GTGGTGCATG GTTGTCGTCA      

1021 GCTCGTGTCG TGAGATGTTG GGTTAAGTCC CGCAACGAGC GCAACCCTTG ATCTTAGTTG      

1081 CCAGCATTCA GTTGGGCACT CTAAGGTGAC TGCCGGTGAC AAACCGGAGG AAGGTGGGGA      

1141 TGACGTCAAA TCATCATGCC CCTTATGACC TGGGCTACAC ACGTGCTACA ATGGACAGAA      

1201 CAAAGGGCAG CGAAACCGCG AGGTTAAGCC AATCCCACAA ATCTGTTCTC AGTTCGGATC      

1261 GCAGTCTGCA ACTCGACTGC GTGAAGCTGG AATCGCTAGT AATCGCGGAT CAGCATGCCG      

1321 CGGTGAATAC GTTCCCGGGC CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCACGAGA GTTTGTAACA      

1381 CCCGAAGTCG GTGAGGTAAC CTtTTAGGAG CCAGCCGCCG